全 文 ：第 7 卷第 2 期
1 1 99年 4月
生 物 化 学 杂 志
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赤小豆抑制剂对胰蛋白酶不可逆抑制作用的动力学探讨
杨 同 成
(福建师大高分于研究所生化研究室 , 福州 3 5 0 0 0 7 )
摘要 本文从中药赤小豆 ( p h a s e o l u s C a l c a r a t u s . R o x b ) 中分离 出一种脆蛋白晦 抑 制
荆 。通过一系列晦促反应动 力学的研完表明 ,赤小豆抑制荆对胰蛋白晦有较强的不可
逆竞争性抑制作用 。其 K m 和 ik 位分别为 l . 43 x l o 一 3m m ol / L 和 2 . 4 x l 0 一 “ ,m m o l/ L。
关链词 : 赤小豆 ; 旋蛋白晦抑制剂 ; 不可逆抑制作用 ; 精子 顶体蛋 白晦
我们从中药赤小豆 ( p h a s e o l u s C a l e a r a t u s R o x b )中分离一种蛋白酶抑制剂 。 它 不 仅对胰
蛋白酶有专一抑制作用 , 而且还对人体精子顶体蛋 白酶 (在酶学性质方面类似胰蛋白酶 )的活
性亦有较强的抑制作用 川 , 这将对防止精子穿过卵细胞透明带和卵细胞相融合而 受 精 , 起
一定作用 。
本文现从酶学角度 , 进一步探讨赤小豆抑制剂对胰蛋白酶抑制作用的动力学类型 。
实 验 方 法 与 结 果
赤小豆购自福州国药商店 。 羊胰蛋白酶 (结晶品 ) , N 一苯 甲酞 一 D L一精氨酸 一对硝 基 苯 胺
( B A P N A )系中科院上海生化所东风生化试剂厂产品 , 酪 蛋 白系上海化学试剂采购供应站分
装品 ; 其他试剂均为 A . R 级 。
一 、 赤小豆胰蛋白酶抑制剂的制备
取去皮的赤小豆 10 0 9用 4倍体积的 0 . 25 m ol / L 硫酸溶液浸泡并组织捣碎后 , 在室温下抽
提 2 小时 。 离心得清液并直接滴入 10 % T CA 溶液 , 使 T C A 的终浓度达 2 . 5% , 在 60 ” ~ 70 ℃
水浴上加热 5 分钟 , 冷却离心后调清液 P H 为 5 , 重复 2 次加饱和硫酸钱溶液至 0 . 6饱和度 ,
离心收集沉淀 , 即赤小豆抑制剂粗制品 。 分二批上 S eP h a d e x G一50 ( 1 . 2 x 3 c0 m )分离 ,用 0 . 25
m ol / L (内含 o . Zm ol / L N a cl 冲 H 7 . 8 磷酸缓冲液平衡洗脱 。 收集抑制剂活力部 分 , 合并后用
0
.
0 1“ o L / L P H 7 . 8磷酸缓冲液平衡 , 再经 D E A E 一纤维素柱 ( l . Z x 3 0 c m )分离 ,用 Zm o l / L N a C I
溶液 2 0 m L梯度洗脱 ,收集有抑制剂活力的对称峰部
分 。 经聚丙烯酞胺凝胶电泳纯度鉴定 , 显示单一谱带
(见 iF g . 1 ) 。 即赤小豆胰蛋白酶抑制剂 单点纯 电 泳 。
供以下实验之用 。 抑制剂通过对蛋白酶的抑制活力曲
F 19
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1 P o l y a e r y a m i d e g e l e l e e t r o
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收稿日期 . 1 9 . 9一 1 2一 1 2 , 修回 日期 : 1 9 Op一 Q4一 11
22王
DOI : 10. 13865 /j . cnki . cj bmb. 1991. 02. 017
线的鉴定 , 结果 , 赤小豆抑制剂不能抑制胰凝乳蛋 白酶 , 枯草杆菌蛋白酶及木瓜蛋白酶 。 仅
专一地抑制胰蛋白酶对酪蛋 白 , B A P N A 和 B E A A 等 底物水解 。 赤小豆抑制剂对胰蛋白酶的
当最抑制比值 , 分别为 i : 3 . 9 0 , l : 3 . 2 5 , i : 3 . 3 3 。
二 、 赤小豆抑制荆活力的测定
参考文献方法 2[, s1 。 测定赤小豆抑制剂的活力 。 以酪蛋白和 B A P N A为 底物 , 加一定量
抑制剂和不加抑制剂于一定量的胰蛋白酶溶液中作对照 , 分别于 37 ℃反应 1 0 , 20 , 30 , 40 和
5 0分钟 , 终止反应后 , 在 72 1型分光光度计上测定不同时间光密度的变化 , 分别绘制进程曲
线 。 从 iF g . 2 中可看出 , 在一定时间内加抑制剂和不加抑制剂 , 酶反应速度均维持恒定 , 随
时间的进程其反应速度均逐渐倾平稳 。 但二者之间始终保持一定当量抑制的关系 。
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三 、 赤小豆抑制剂类型的判断
取一定比例量的胰蛋白酶溶液 , 配于含有一定量的抑制剂和不含抑制剂的 0 . 05 m ol / L ,
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OT r i s一H C I缓冲液中 , 3 7℃反应 1 0m i n , 加 B A P N A 溶液 2 . s m L , 再反应 2 0m i n , 立即加
3 6%醋酸溶液 0 . S nI L 停 止反应 , 在 72 1型分光光度计 ( 4 1 0 n m )下测定不同酶量的光密度的变
化如 iF g . 3所示 , 从 iF g . 3可以看出 , 不加抑制剂时 , 可得一条通过零点的直线 “ , 而加抑制
剂所得一条是不通过零点向右移与直线 a 相平行的直 线 b 。 由于抑制剂与酶之间存在一定当
量的抑制关系 , 只有当加人酶的靡尔数超过抑制剂时 , 即尚有剩余的酶分子时 , 才能表现活
力。 一旦具有活力后 , 其反应初速度随酶量增加程度应和无抑制剂时一样 , 而出现二条平行
的直线 [` , 。 因此表明 , 赤小豆抑制剂对胰蛋白酶的抑制作用是不可逆的 。
四 、 赤小豆抑制剂与底物之间的关系
根据赤小豆抑制剂活力测定的方法 , 以酪蛋白 , B A P N人为底物 , 分别 用抑制剂先与酶
22 3
混合 , 后与底物反应 。 和抑制剂先与底物混合 , 后与酶反应作比较 。 测 定 抑 制 剂的抑制活
力 , 结果在 iF g . 4 , 5 中可看出 , 以酪蛋白为底物时 ,后加酶液 ,其抑制程度仅为先 加 酶 液 的
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r y P s i n : 1 0林g / m L , B A P N A : 3 6 0“ g /m L
8 5%左右 。 而以 B A P N A 为底物 , 后加酶比先加酶 , 反应初期其抑制程度虽然比较低 , 继后
出现不明显的抑制作用 。 这可能抑制剂先与酪蛋白为底物结合 , 而受到底物的保护作用 , 而
减少了抑制剂与酶结合 , 使酶和底物亲和力变大 。 相反先加酶 , 使抑制剂直接和酶相结合 ,
而影响酶和底物的结合 , 因此先加酶的抑制作用比后加酶的抑制作用强 。 B A P N A 属 于 合成
的酞胺类底物 , 是不易水解的 , 与酶亲和力较小 , 与抑制剂的竞争亦不 明 显 〔sJ 。 赤小豆抑
制剂对胰蛋白酶的抑制作用虽然是不可逆抑制 , 但其结构与底物可能有某些相似 , 可以与酶
活性中心的底物结合基团结合 , 属于底物型的不可逆抑制剂 〔` ’ 。 亦即邹承香教授所提出的竞
争性的不可逆抑制 `“ 1 。
五 、 赤小豆抑制剂不可逆 , 竞争性抑制的证实
通过 iL ne w ae ve r 一 B盯 k 曲线 , 即 i / A 4 l o n m 一 l /〔。〕可见赤小豆抑制剂对胰蛋白酶的抑制作
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用是竞争性的 ( 见F i g. 6) , K m 值为 1 . 4 3 火 1 0 一 3 m m o l / L , 由 D i x o n 作图即 l / A 4 1 0 n m一〔l 〕测得
K i 值为2 . 4 x l0 一 6m m ol / L , 表明 , 抑制剂和酶亲和力大过酶和底物的亲和 力 (见 iF g . 7) 。 因
而赤小豆胰蛋白酶抑制剂是一种抑制活力很强的抑制剂 。
讨 论
综上所述 , 可以认为赤小豆胰蛋白酶抑制剂对胰蛋 白酶的抑制作用是不可逆的 。 当抑制
剂先和底物混合 , 然后加酶 。 与其相反情况下相比较 , 其抑制活力就比较低 , 说明抑制剂同
底物对酶分子存在着竞相结合 , 也就是说底物和抑制剂和酶分子上结合的部位相同 , 表明底
物和抑制剂之间的竞争性关系 。 从 iL en w ea ve r 一 B ur k 和 iD xo n 曲线中也得到证实 , 赤小豆抑
制剂对胰蛋白酶的抑制作用属于竞争性 。 其 K m 值大过 iK 值 , 说 明 抑制剂与酶亲和力比底
物和酶亲和力大 。 因此 , 赤小豆抑制剂是一种抑制能力较强的不可逆 , 竞争性抑制剂 。 又专
一性抑制胰蛋白酶 。 经我们初步试验 【’ ] , 证实赤小豆抑制剂对人体精子顶体蛋白酶 (类胰蛋
白酶 )有较强的抑制作用 。 使精子失去水解 , 穿过卵细胞透明带的能力 , 以 阻 碍精子和卵细
胞结合而受精 。 从理论上 , 为赤小豆抑制剂提供试作蛋 白酶抑制剂避孕药的可能性 。
参 考 文 献
〔 1」杨 同成 , 等 . 福建 师范大学学报 ( 自然科学版 ) , 1 98 9 , 5 ( 3) : 7 6一 79
[ 2 〕 L a 日k o w s k i M . M e t h o d s i n E n z y m o l , 2 , 3 6 ( C o lo w i e k , 5 . P a n d K a P la n , N . O . e d ) A e a d ,
e m i e P r e s s
,
N
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Y
.
1 9 5 5
〔 3 〕 屈 资铭 , 等 . 生物化学与生物物理学报 , 1 9 6 3 , 3( 2) : 2 29 e 卫30
〔们 陈惠攀 , 等 . 分子醉学 , 北京 : 人 民卫生出版社 , 1 9 8 3 : 2 32 一2 3
〔 6 〕 梁之彦 . 生理化学 , 上海 , 上海科学技术 出版社 , 1 9 8 5 , 2 38 一 2 40
[ 6 〕 邹承每 .生物化学与生物物理 学报 , 1 9 6 5 , 4 ( 5 ) : 3 9 8一 40 6
K i n e t i e s S t u d y o f I r r e v e r s i b l e I n h i b i t o r y E f f e e t s o f C h i
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, e o m P e t i v e i n h i b i t i o n o n t r y P s i n b y
s e r i e s o f k i n e t i e s t u d y o n e n z y m e一 e a t a l y : e d r e a e t i o n s
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