全 文 ：临床检验杂志(电子版)2015年 3月第 4卷第 1期 Clinical Laboratory Journal(Electronic Edition)，Vol.4，No.1，Mar，2015 769
·论 著·
刀豆氨酸-甘氨酸-溴麝香草酚蓝培养基在区分格特隐球菌与新生隐球菌
中的应用
沈定霞，吴华，薛新颖，曹敬荣，刘智勇，金鑫，匡慧慧，沈跃云1

沈定霞，医学博士，现任解放军总医院微生物科主任医师、教授，博士研究生导师。擅长于对
感染性疾病的病原学检测特别是少见和疑难病原菌的鉴定。主要研究方向是病原微生物的耐药性、
致病性和流行特征研究。现负责国家自然科学基金课题 1项。以第一作者和通讯作者发表论文共 70
余篇。其中 SCI论文 13篇，单篇最高影响因子 19.97。主编《临床感染性疾病病原学诊断》，副主编
《实用检验医学》，参编《全国临床检验操作规程》第 3版和第 4版。
现任中国微生物学会医学微生物学和免疫学专业委员会委员，中国中西医结合学会检验医学专
业委员会委员和北京中西医结合学会第二届检验医学专业委员会副主任委员兼临床微生物检验专业组组长。是《中华检验
医学杂志》《临床检验杂志》(电子版)编委；《中华微生物学与免疫学杂志》通讯编委等。

[摘要] 目的 研究刀豆氨酸-甘氨酸-溴麝香草酚蓝培养基（CGB培养基）在区分新生隐球菌和格特隐球菌中的作用。
方法 将已鉴定并报告为新生隐球菌的 219 株不重复的保存菌种经复苏后接种至 CGB 培养基进行筛选。对筛选阳性的菌
株以及随机选择筛选阴性的菌株进行 PCR扩增，将扩增的 IGS1、URA5和 GPD1基因产物进行测序，与基因库中的标准
序列进行比对。结果 既往报告为新生隐球菌的 219株菌中，有 3株在 CGB培养基上生长且使菌落周围培养基颜色变为
蓝色，筛选为阳性，其余 216 株在 CGB 培养基上虽有生长，但培养基颜色无变化；3 株显色阳性菌经基因扩增和测序鉴
定为格特隐球菌，2 株显色阴性菌基因扩增及测序鉴定为新生隐球菌格鲁比变种。结论 格特隐球菌在 CGB 培养基上生
长产生明显的颜色变化，可用于其与新生隐球菌的鉴定。
[关键词] 格特隐球菌；新生隐球菌；鉴定；培养基
[中图分类号] R446.53 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 2095-2775（2015）01-0769-05
Application of Canavanine-glycine-bromthymol medium in the differentiation of Cryptococcus gattii from Cryptococcus
neoformans
Shen Dingxia, Wu Hua, Xue Xinying, Cao Jingrong, Liu Zhiyong, Jin Xin, Kuang Huihui, Shen Yueyun.
General Hospital of Chinese People’s Liberation Army, Beijing 100853, China
Corresponding author: shendx301@sina.com
[Abstract] Objective To analysis the role of Canavanine-glycine-bromthymol ( CGB ) medium in the differentiation of
Cryptococcus gattii from Cryptococcus neoformans. Methods 219 stored isolates which were primarily identified and reported as
Cryptococcus neoformans were recovered and inoculated on CGB agar. Those that made the medium blue were regarded
screen-positive, those maintained the medium yellow were screen-negative. The genes of IGS1, URA5 and GPD1 were amplified
and sequenced from screen positive and random-selected screen negative strains Results Among 219 strains, 3 grew on the CGB
agar and turned the medium around colony blue, which were confirmed as Cryptococcus gattii by gene amplification and sequence.
The media inoculated other 216 stains maintained yellow, from which, 2 strains were randomly selected for gene amplification and
sequence, and identified as Cryptococcus neoforman var grubii. Conclusion CGB medium showed clear color change for
Cryptococcus gattii and can be used to differentiate it from Cryptococcus neoformans.
[Key words] Cryptococcus gattii; Cryptococcus neoformans; Identification; medium

[作者简介] 沈定霞，医学博士，主任医师。主要研究方向是病原微生物的耐药性、致病性和流行特征的研究
[作者单位] 100853 北京 解放军总医院微生物科（沈定霞，吴华，沈跃云）；解放军总医院呼吸科（薛新颖）；100053
北京 宣武医院检验科（曹敬荣）；400038 重庆 重庆西南医院检验科（刘智勇）；201508 上海 上海市公共卫生临
床中心医学检验科（金鑫）；解放军总医院海南分院检验科（匡慧慧）
[通讯作者] 沈定霞，E-mail：shendx301@sina.com
770 临床检验杂志(电子版)2015年 3月第 4卷第 1期 Clinical Laboratory Journal(Electronic Edition)，Vol.4，No.1，Mar，2015
隐球菌在环境中广泛存在，新生隐球菌
（Cryptococcus neoformans，CN）和格特隐球菌
（Cryptococcus gattii，CG）是引起人类感染的
主要两个种。上世纪 80 年代以前，按照荚膜多
糖抗原的不同将 CN分为 A、B、C、D和 AD五
个血清型，其中 A、D和 AD 型为格鲁比变种和
新生变种，B和 C型为格特变种。后来的研究发
现，格特变种在生态学、生化和分子特征及致病
等方面与前两个变种差别较大，因而被列为独立
的种[1]。CN 多感染免疫功能抑制者如艾滋病患
者，引起隐球菌病；而 CG则可感染免疫功能正
常者，引起脑膜脑炎或肺部感染。还有报道称，
CG 对某些抗真菌药的敏感性较 CN 低[2]，因此
临床微生物室有必要将格特隐球菌与新生隐球
菌格鲁比变种和新生变种区别开来。然而，目前
临床微生物实验室采用的隐球菌鉴定手段，包括
全自动鉴定系统并不能区分 CN 和 CG。国外已
有研究使用刀豆氨酸 -甘氨酸 -溴麝香草酚蓝
（Canavanine-glycine-bromthymol，CGB）培养
基来鉴定 CN和 CG[3]，本文通过配制 CGB培养
基，观察隐球菌在 CGB 培养基上的生长和颜色
变化，并用基因扩增和测序的方法进行验证，旨
在为国内实验室介绍一种简单有效的区分格特
隐球菌和新生隐球菌的方法。

1 材料与方法
1.1 菌株 219个实验菌株为北京、重庆、上海、
海南三亚共五家三级甲等综合医院微生物室保
留的菌种，采用 Vitek2或 Vitek Compact初始鉴
定并报告为新生隐球菌，经复苏后接种至沙保弱
和玉米培养基，观察菌落和显微镜下形态，部分
菌株经 Vitek2和 VITEKMS确认。白念珠菌、近
平滑念珠菌、光滑念珠菌、阿莎希毛孢子菌为本
院分离的临床菌株经 VITEK MS鉴定。
1.2 CGB 培养基的配制、培养方法及结果判定
按照参考文献[4]的方法配制 CGB 琼脂培养基。
先分别配制溶液 A，即甘氨酸-刀豆氨酸溶液（甘
氨酸 10g，磷酸二氢钾 1g，硫酸镁 1g，盐酸噻
胺 1mg，L-硫酸刀豆氨酸 30mg，溶于 100ml蒸
馏水，调整 pH至 5.6后用 0.22μm滤膜过滤除菌）
和溶液 B，即溴麝香草酚蓝溶液（溴麝香草酚蓝
0.4g，溶于 0.01N 氢氧化钠 64ml，加蒸馏水
36ml），再将溶液 B 20ml，蒸馏水 880ml和琼脂
20g 混匀后，121℃高压 15min，冷却至 50℃左
右，加入 100ml溶液 A，混匀后倾碟，保存于 4℃
冰箱待用。将待检菌点种于 CGB 培养基上
25℃～30℃培养至 5天，每日观察菌落生长和培
养基颜色变化。CG 可耐受刀豆氨酸并可利用甘
氨酸为碳源而生长，使培养基 pH升高，溴麝香
草酚蓝由黄色变为蓝色，显色反应为阳性，CN
不能使培养基颜色发生变化，培养基保持黄色，
显色反应为阴性。
1.3 基因扩增及测序鉴定 对 CGB培养基筛
选阳性的菌株进行进一步的基因扩增和测序分
析，并随机选取2株筛选阴性的菌株为对照，同
时进行鉴定。采用 TianGen公司的酵母菌提取试
剂盒提取 DNA模板，按说明书进行操作。选取
IGS1，URA5和 GPD1作为靶基因，引物序列参
照文献[5]，由上海生工公司合成。分别为（5’-3’
端）：IGS1-F：ATCCTTTGCAGACGACTTGA，
IGS1-R: GTGATCAGTGCATTGCATGA ，
URA5-F: ATGTCCTCCCAAGCCCTCGAC ，
URA5-R: TTAAGACCTCTGAACACCGTACTC；
GPD1-F: CCACCGAACCCTTCTAGGATA ，
GPD1-R：CTTCTTGGCACCTCCCTTGAG。IGS1
基因扩增反应条件为94℃变性3min，在94℃变性
30s，60℃退火30s，72℃延伸1min条件下，经35
个循环后72℃延伸5min， URA5和 GPD1的基因
扩增反应条件为：94℃变性 3min，然后经 94℃
变性45s，63℃退火 1min，72℃延伸1min，35
个循环后 72℃延伸 5min。 PCR产物由北京天
一辉远公司进行双向测序。将所得序列使用
MEGA6 软 件 拼 接 后 输 入 GenBank
（ http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi）进行比
对。

2 结 果
2.1 CGB 培养基筛选 从 219 株隐球菌中共获
得 3株阳性显色反应的菌株，菌落和周围的培养
基变为蓝色，其余菌株显色反应为阴性。结果见
图 1。白念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌在
CGB 培养基上不出现任何颜色变化，阿莎希毛
孢子菌在CGB培养基上生长 72小时开始出现菌
落周围淡蓝色，为假阴性。
临床检验杂志(电子版)2015年 3月第 4卷第 1期 Clinical Laboratory Journal(Electronic Edition)，Vol.4，No.1，Mar，2015 771

图 1 CGB培养基显色反应
阳性：1-3，阴性：4和 5
2.2 基因扩增和测序分析
2.2.1 基因扩增 对 3株 CGB培养基筛选阳性
菌（菌株编号分别为 1，2，3）和 2 株 CGB 培
养基筛选阴性菌（菌株编号分别为 4和 5）进行
IGS1、URA5和 GPD1基因的扩增，凝胶电泳成
像显示片段大小分别为 850bp、750bp 和 700bp
左右。结果见图 2。








图 2 5株菌的 IGS1、URA5和 GPD1基因扩增产物电泳结果

2.2.2 测序与序列比对 对 5株菌 3个基因的
PCR产物进行测序并与 GenBank中相应基因的
比对结果见表 1。

表 1 隐球菌 IGS1、URA5和 GPD1基因与 GenBank中相应基因的比对
菌
株
编
号
与标准
菌株比较
IGS1 URA5 GPD1
鉴定率 差异位点 鉴定率 差异位点 鉴定率 差异位点
1 Cryptococc
us gattii
WM178
756/756
(100%)
- / 635/639
(99%)
80,204,
276,362
547/547
(100%)
- /
2 Cryptococc
us gattii
WM276
845/853
(99%)
10,11,328,495,
688,842,845,848
772/780
(99%)
8,36,37,40,
428,444,621,626
626/627
(99%)
440
3 Cryptococcus
gattii B9313
824/826
(99%)
363,498 741/747
(99%)
34,37,165,
425,426,634
627/627
(100%)
- /
1500
500
400
300
200
100
1000
900
800
700
600
M IGS1
1 2 3 4 5
URA5
1 2 3 4 5
GPD1
1 2 3 4 5
M
772 临床检验杂志(电子版)2015年 3月第 4卷第 1期 Clinical Laboratory Journal(Electronic Edition)，Vol.4，No.1，Mar，2015
4 Cryptococc
us
neoformans
var grubii
H99
857/875
(98%)
10,11,12,13,238,
321,406,419,477,
499,500,547,566,
570,706,726,817,
844
777/784
(99%)
10,13,18,459,
774,778,783
700/704
(99%)
10,21,
702,725
5 Cryptococc
us
neoformans
var grubii
H99
875/877
(99%)
15,16 770/774
(99%)
18,461,778,
779
701/705
(99%)
20,460,
710,704

2.2.3 CGB培养基筛选与基因扩增和测序鉴定
符合情况 3株 CGB培养基筛选阳性菌经基因
扩增和测序鉴定为 CG，2株 CGB培养基筛选阴
性菌经基因扩增和测序鉴定为 CN。CGB培养基
筛选与基因扩增、测序及序列比对的鉴定结果一
致。

3 讨 论
CG 曾被认为仅分布于热带和亚热带，受到
的关注较少。自 1999 年在加拿大温哥华[6]和美
国西北部[7]的温带地区发生 CG 爆发流行后 CG
开始受到重视。已经有研究发现，除了感染免疫
抑制患者，CG 还可感染免疫功能正常者。相比
CN，CG更易引起脑和肺部的病变，也更易导致
中重度的后遗症甚至死亡[8]，且所需治疗时间更
长。然而，实验室常用的鉴定方法均不能分辨
CN和 CG[3]。虽然有报道称墨汁负染色时 CN多
为圆形而 CG为椭圆或雪茄型，但这种方法常受
主观因素影响且敏感度不高[9]。另有作者使用
API 20C AUX、Vitek 2 compact和MALDI-TOF
MS 将一株 CG 鉴定为 CN[10]。本实验中的 3 株
CG应用本实验室的 Vitek MS进行鉴定，其中 2
株被鉴定为 CN（鉴定率分别为 99.6%和 99.4%），
另一株被鉴定为异酒香酵母菌（鉴定率为 90%）。
德国布鲁克公司的MALDI-TOF MS因数据库的
不同，对 CG和 CN的鉴定结果也不尽相同，2.0.1
数据库中隐球菌的条目有限，当增加条目后可正
确鉴定 CG[11]，FiracativeC 等[12]使用的 2.0.43.8
数据库，不仅能准确区分 CN 和 CG，还可进行
分子分型。
Klein等[3]评估了 CGB培养基在不同温度下
的显色反应，发现在 30℃培养时 CG的显色最明
显，而 37℃培养 48小时后显色明显变弱，因而
选择 30℃培养。本研究的 3 株 CG 在 25℃培养
24 小时就已出现菌落及其周围培养基的颜色变
化，48 小时后蓝色向四周扩散更明显。我们认
为 25～30℃对显色的影响不大，CGB 培养基在
此温度范围内都适用。结果还显示，阿莎希毛孢
子菌在 72 小时开始出现菌落周围的淡蓝色，但
白念珠菌、光滑念珠菌和近平滑念珠菌直到 5天
也没有颜色变化。Klein 等指出阿莎希毛孢子菌
可以在 CGB 培养基上生长，产生蓝色反应[3]。
因此，仅凭 CGB 培养基的显色并不能独立鉴定
CN和 CG，不可将 CGB培养基作为真菌鉴定的
初始培养基，必须在具有酵母菌落形态、玉米琼
脂上不形成假菌丝、甚至尿素酶及咖啡酸试验阳
性的基础上，才能通过 CGB培养基将 CG与 CN
区分开来。
Klein等[3]用 CGB培养基筛查发现 1株 CN
显示弱阳性反应，与真正阳性反应不同的是，仅
在菌株划线的有限区域内培养基变蓝。通过调整
接种量，观察菌落及其周围培养基广泛的蓝色变
化，可以防止出现假阳性。本研究虽然未对所有
显色阴性菌株进行基因扩增和测序鉴定，但随机
选取的 2 株菌经进一步基因扩增和测序鉴定为
CN，同时，结合 Klein等在所有显色为阴性的菌
株中未见 CG的研究结果，可以得出，CGB培养
基筛查结果为阴性者基本上可排除 CG。
本研究中使用的 CN和 CG所共有的 3个管
家基因 (IGS1、URA5、GPD1)能很好地从基因
水平鉴定 CN 和 CG[13,14]，对 3 个显色阳性菌株
进行正确的验证。但基因扩增和测序需要特殊的
设备，且增加额外的费用。利用 CGB 培养基对
隐球菌进行进一步鉴定需要的成本不高，操作简
临床检验杂志(电子版)2015年 3月第 4卷第 1期 Clinical Laboratory Journal(Electronic Edition)，Vol.4，No.1，Mar，2015 773
便，结果直观，易于观察，值得在临床微生物实
验室推广使用。尽管本研究从 219株隐球菌中仅
鉴定出 3株 CG，检测阳性的比例不高，但是，
随着我国 CG感染病例的增加，实验室有必要对
CG 进行常规鉴定，以了解我国 CG 感染的真正
发生情况，使临床医生正确诊断和治疗格特隐球
菌病。


【参考文献】

[1] Kwon-Chung, K.J, Boekhout, T, Fell, J.W, et al. Proposal to
conserve the name Cryptococcus gattii against C. hondurianus
and C. bacillisporus (Basidiomycota, Hymenomycetes,
Tremellomycetidae) [J]. Taxon, 2002, 51: 804-806.
[2] Soares, BM., Santos DA, Kohler LM, et al. Cerebral infection
caused by Cryptococcus gattii: a case report and antifungal
susceptibility testing. Rev[J]. Iberoam. Micol, 2008, 25: 242-245.
[3] Klein KR, Hall L, Deml SM, et al. Identification of Cryptococcus
gattii by use of L-canavanine glycine bromothymol blue medium
and DNA sequencing[J]. J Clin Microbiol, 2009, 47(11):
3669-3772.
[4] Bulter-Wu SM, Limaye AP. A Quick Guide to the Significance and
Laboratory Identification of Cryptococcus gattii[J]. American
Society for microbiology, 2011, Jan 18: 1-5.
[5] Wieland Meyer, David M. Aanensen, Teun Boekhout，et al.
Consensus multi-locus sequence typing scheme for Cryptococcus
neoformans and Cryptococcus gattii[J]. Med Mycol, 2009, 47(6):
561-570.
[6] Kidd SE, Hagen F, Tscharke RL, et al. A rare genotype of
Cryptococcus gattii caused the cryptococcosis outbreak on
Vancouver Island (British Columbia, Canada) [J]. Proc Natl Acad
Sci USA, 2004, 101(49): 17258-17263.
[7] Harris JR, Lockhart SR, Debess E, et al. Cryptococcus gattii in the
United States: clinical aspects of infection with an emerging
pathogen[J]. Clin Infect Dis, 2011, 53(12): 1188-1195.
[8] Mitchell DH, Sorrell TC, Allworth AM, et al. Cryptococcal
disease of the CNS in immunocompetent hosts: influence of
cryptococcal variety on clinical manifestations and outcome[J].
Clin Infect Dis, 1995, 20: 611-616.
[9] Harris J, Lockhart S, Chiller T. Cryptococcus gattii: where do we
go from here? [J]. Med Mycol, 2012, 50(2): 113-129.

[10] 窦红涛, 万喆, 徐英春, 等. 格特隐球菌在河北地区引起1例
脑膜炎的临床与实验研究 [J]. 中国真菌学杂志 , 2015,
10(1):11-15.
[11] McTaqqart LR, Lei E, Richardson SE, et al. Rapid identification
of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii by
matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass
spectrometry[J]. J Clin Microbiol, 2011, 49(8): 3050-3053.
[12] Firacative C, Trilles L, Meyer W. MALDI-TOF MS enables the
rapid identification of the major molecular types within the
Cryptococcus neoformans/ C. gattii species complex [J]. PLos
One, 2012, 7(5): e37566.
[13] Diaz MR, Boekhout T, Kiesling T, et al. Comparative analysis of
the intergenic spacer regions and population structure of the
species complex of the pathogenic yeast Crypotococcus
neoformans[J]. FEMS Yeast Res, 2005, 5(12): 1129-1140.
[14] Sidrim JJ, Costa AK, Cordeiro RA, et al. Molecular methods for
the diagnosis and characterization of Cryptococcus: a review[J].
Can J Microbial, 2010, 56(6): 445-458.