全 文 ：问济 医科大学学报 1 9 8 吕 年第 3 期
巨噬细胞和组织细胞的刀豆素A受体染色
同济医科大学实验医学研究中心超微病理研究宝
徐玉会 武忘仍
内容提要 本文报告一种在组织切片中特异性地显示 巨噬细胞和组织细胞的C o n A 受体染色 技
术 。 这一技术将金标H R P间接染色法与银显影过程相结合 , 能在不经酶消化的石蜡切片中选 择 性
地对巨噬细胞和组织细胞着染 。 此方法程序简单 , 试剂易自行配制 , 重复性 、 特异性高 , 因 而 在
单核吞噬细胞系统的病理学研究中将具有广泛的使用价值 。
关键词 C on A 结合染色 ; 巨噬细胞和 组织细胞 ; 金标辣根过氧化物酶 ; 银增强
凝集索 ( L ec t nj s )是一类能与 糖 和 寡糖
特异性结合的植物和动物源性蛋白质 , 近年
来广泛运用于细胞的分化 、 成熟和瘤细胞转
化等研究中〔 ` 〕 。 细胞表面对某种凝集素的特
异性受体表达 可以作为该细胞的有价值的组
织化学指标 。 最近 有人报道刀 豆素 A ( C O n A )
在一定浓度时能选择性地与组织内巨噬细胞
和组织细胞胞浆内的糖基相结合 , 从而可通
过检测这些糖 基 来 特 异 性 显 示 此 类 细
胞〔 ` , 2 〕 。 本研究将 G co g he ga n 的金标辣 根 过
氧化物酶 ( H R P ) 间接染色法与 D a ns c he r的
银显影技术相结合 , 成功地在石蜡切片上特
异性地显示了巨噬细胞内的 C O n A 受体 。
白酶消化后菇本按葡萄球菌蛋白 A 金银法进
行染色 〔 “ 〕 。 不 同之处为非特异性封闭山卵蛋
白改为小鼠肝粉 ( l m g / Z m l 0 . 0 2M T B S ,
p H 7
.
4 )
。 第一层试剂为C o n A 一 T B S ( C o n A ,
四级 , S i g m a , 浓 度 为 1 0 ~ 1 0 0拼g / m l ) 。
第二层试剂为金标 H R P ( 1 : 8 ) , 切 片 从
后用 改良M o e r e m a o s显影液 内显影 〔 “ 〕 。 染色
特异性检验 : ①切片不经 C o n A 一 T那温 育 ;
② C o n A 一 T B S少乞用 0 . IM ( 18m g / m l ) D 一甘
露糖 范争抑制后再与切片温育〔 5 〕 。
材料和方法
一 、 金标 H R P的制备及纯化
金颗粒直径为 10 n m的胶体金制备 过 程
见另文山 。 胶体金标记 H R P的方法 鉴 本 参
照 G e o g h e g a n介绍 l飞勺方法进行〔落〕 。 按 H o r i s -
be gr er 介绍的方法测得最小能稳定 1 m l胶 体
金的H R p ( s i g m a , T y p e F ) 为 1 2 5件g 。 金
标 H R P的纯化用超速离心法 〔“ 〕 。
二 、 c o n A 结 合来色程序
材料选用常规福尔马林固定 、 石蜡包埋
的人淋巴结组织 (病理诊断为反应性增生 ) ,
作厚约 4 卜石蜡 切片 , 常规脱蜡后不经 酶 消
化 , 或经胰蛋自酶 、 胃蛋 自晦或拈草杆菌蛋
给 果
低浓度的 C O n A 涪 液 ( 1 0一 2 5拼g / m l)
未能特异性地显示 巨噬细胞和 组 织 细 胞 。
C on A 浓度在 50 雌 /m l 时则选择性地对 巨 噬
细胞右色 。 切片不经酶消化时 , C o n A 浓 度
以 5 0林g / m l 染色效果最佳 。 高于此浓度时淋
巴结 内其它纷l胞亦可着色 , 但仍能根据其着
色深浅和类型将 巨噬细胞与其它 细 胞 相 区
别 。 在 试验的三种消化酶中 , 胃蛋 白酶和枯
草杆菌蛋自酶不仅 一可使 切片背景增强 , 而且
还能降低巨噬细胞内C o n A受体染色 。 胰 蛋
白酶消化则可明显减弱背景 , 但也在一 定程
度上 降低 了巨噬细胞的特异性着色强度 。 胰
蛋 白 .晦消化后如将 C o n A浓度提高 到 7 5“ g /
m l时 ;叮获最好效果
门片在 明C o n A和金 标 H R F处理前用 )jf
粉封闭能明显降低背景着色 。 10 肠卵蛋白或
3肠牛血清蛋白封闭切片后可完全阻断 C no A
与受体的结合 , 当降低卵蛋白浓度 ( l % )
时可以明显降低背景 , 当 C o n A 在 50 林gm/ l
时尚可对巨噬细胞着色 。
在上述最适条件下对人淋巴组织的染色
结果与文献报道颇为一致 。 当C o n A 浓 度 为
1 0 0协g / m l时 , 淋 巴结内大多数细胞 均 可 着
色 。但窦组织细胞和生发中心巨噬细胞 ( iT n -
g i bl e b o d y e e ] 15 ) 弥漫性胞浆着色 与 仅 有
一薄层膜性 阳性染色的淋巴细胞极易区分 。
当C o n A浓度降到 75 林g /m l以下时 , 则除巨噬
细胞以外的其它细胞着色甚淡 。 巨噬细胞与
其背景呈鲜明对 比 。 这种巨噬细胞的胞浆着
色呈深黑色细颗粒状 。 以生发 中心巨噬细胞
最为明显 (图 1 ~ 3 ) 。 窦组织细胞清晰可
辨 (图 4 ) , 巨噬细胞的核不着色 。 滤泡生
发中心巨噬细胞内的吞噬物质亦不着色 (图
2 )
。 滤泡内淋巴细胞和其它部位的淋巴细
胞着色极淡 。 皮质旁淋巴细胞之间个别细胞
亦为阳性 , 但其形态学提示其性质亦为 巨噬
细胞 。 淋 巴结内结缔组织成分 , 如成纤维细
胞 、 血管内皮细胞以及胶原纤维和网状纤维
亦示弱阳性 。
讨 论
凝集素在病理学和生物学中作为显色试
剂的基础在于它们能够识别糖蛋白中 . 尤其
是细胞膜中的碳水化物结构 。 生物组织内不
同细胞的胞膜上有着不 同的碳水化物结构 ,
而且这些结构在细胞的分化 、 成熟和肿瘤性
转化中发生明显变化〔 “丁。 因此 , 凝集素不仅
可用来区令不同类型的细胞 , 而且可用于对
细胞介上述转变过程的研究 。 C O n A 是 一 种
从刀豆中提取的凝集素 , 它能使红细胞凝集
并能刺激淋巴细胞胚变 。 这些特 点 依 赖 于
C o n A 与细胞膜上的。 一 甲基甘 露 糖 残 基 共
价交联 〔 6 1 。 虽然文献报进很多细胞膜 _ 1几均有
C o n A 受体【’ 〕 , 但最近 R ec 等人发现在巨噬细
,
1白5 ·
胞胞浆内亦存在 C o n A 结合部位 , 因此 认 为
C O n A 受体染色对于特异性地显示组 织 内 、
特别是肿瘤组织内的巨噬细胞具 有 重 要 价
值 〔 ` , 2 , 。
文献中显示 C o n A受体的组化方法很 多 ,
但大致可分为两类 。 一类是用标记物直接标
记 C O n A , 然后对其结合部位进行检 测 。 另
一类是用 所谓 糖 一 凝 集 素 一 糖 夹 心 法 对
C o n A受体进行 间接显示 〔幻 , 而其中应 用 最
多的是 H R P间接法 。 其原理是因为 H R P上亦
含有甘露糖残基 〔 5〕 。 但由于在显示 H R P时要
应用 D A B作为供氢体 , 这不仅需要接触致癌
剂 , 而且染色中还要封闭内源性 过氧 化 物
酶 , 而此酶在正常时就广泛存在 巨 噬 细 胞
内 , 因而常常难 以判断染色结果 。
1 9 8 3年 H of g a f e等人将胶体金技术与aD -
ns ch er 在组织切片显示胶体金的银显影相 结
合 ,从而使胶体金技术得以用于光镜水平 〔。 〕 。
受这一方法的启示 , 我们将 G eo g he g a n 等介
绍的金标 H R P在电镜水平显示 C o n A受体 的
方法与银显影相结合 , 成功地在光镜水平显
示了 C o n A 受体 。 阴性对照 以及阳性细 胞 的
分布与形态特点证明了此方法的准确性和特
异性 。 实验结果证明 , 这一方 法 简 便 、 经
济 , 重复性和特异性 高 , 一种试剂可同时应
用于光镜和电镜染色 , 不需要阻断内源性过
氧化物酶 , 如与D A B显色联用可 作 双重 标
记 。
st ar uc he n 等人使用间 接 酶 法 时 , 其
C o n A 浓度 为 10 0卜g / m l 〔 2 〕 。 而 R e e 等 人 用
A B C法时使用的 C o n A 浓 度 为 10协g /m 1L`〕 。
我们用金银法获得阳性染色的最低 C o n A 浓
度为 2 5件g /m l 。 说明本方法的敏感性介于间
接酶法和A B C法之间 。 但有趣的是 , R e 等
人在其所用的A B C法中均要对切片作酶消化
处理 , 而我 们用金标 H R P染色时不需消化就
能特异性地着染色 巨噬细胞 , 胰蛋白酶消化
反而会降低特 异性肴色强度 , 这种现象可能
与染色反应 的机理不同有关 。
1 8 6
以_l 一犷高浓度 C O n A儿乎能显示所有 淋 巴
结内细胞 , 因此控制 C o n A 的浓度对 于 特 异
性显示巨噬细胞至关重要 , 但用金标 H R P染
色时 , 这一浓度变化范围似乎较为宽 )“ 。 我
们将 C o n A 浓度变 动 于 2 5林g ~ 1 0 0卜g / m l 时
仍能明确地区分 巨噬细胞 , 但随着 C o n A 浓
度的提高 , 背景着色增强 。 为了降低背景 ,
我们曾尝试用卵蛋白或牛血清 白蛋 白封闭或
延长肝粉的吸收时间 , 结果发现延长肝粉吸
收 , 特别是在金标 H R P温育之前最为重要 ,
卵蛋白或牛血清蛋白可部 分 或 完 全 阻 断
C o n A 的结合 , 其确切机理尚不明了 。
在一般情况下 , 在组织切片中鉴别 巨噬
细胞和组织细胞并不困难 。 但在某些病理情
况 下 , 尤其是在鉴别肿瘤性巨噬细胞 (如 R
一
S 细胞 ) 时则单凭常 规染 色切片往往难以
作出判断 。 目前针对某些动物和人的单克隆
抗体不仪不易获得 , 而且价格昂贵 。 抗溶菌
酶 、 a 一卜抗胰蛋白酶免疫组化染色特异性不
高 ,而且仅能显示一部分 巨噬细胞 。 而 c o n A
受体染色则可以显示近 10 0呱 的 巨 噬 细 胞
〔 `叩 。 此外 , c o n A 受体分布的改变还 可用 来
研究细胞的转化以及瘤细胞的生物学行为 ,
有助于阐明细胞恶性转化的分子机制 , 甚至
可以用于病理分型和预测病理的发展 〔“〕 。 因
此这一方法对于实验和临床病理学中 .单核吞
噬细胞系统的研究将具有重要的使用价值 。
(本研究 D 一甘露糖山张育 文 医师提供 , 北 京
医科大学樊景禹 医师给子帮助 , 谨致谢忱 ) 。
( 本文 图 l 一 4 兀 2 4 5 页 )
参 考 文 献
2
.
R e e H J
.
L e ct i n h i s t o e h e m i吕z r y 0 1 m a l i -
g n a n t t u m o r
.
1 1
.
C o n e a n a v a l i n A
.
A
n e w h i s t o e h e m i e a l m a r k e r f o r m a e r o 一
p h a g e
一 h i s t i o e y t e s i n f o ll i e u l a r l y m p h o m a
.
C a n e c r 1 9 8 3 ; 5 1 ( 9 )
: 1 6 3 9
.
2
.
S t r a u e h e n J A
.
L e e t i n r e e e P t o r s a s m a r -
k e r s o f ] y m r h o i d e e l l s
,
A m J P a t h
1 9 8 4 ; 2 1 6 ( 2 )
:
2 0 7
.
3
.
X u Y
, e t a l
.
l m m u no h i跳o e h e m i e al lo e al i 一
z a t i 0 I I o f f i b r o n e e t in a n d l a m i n i n i n
m u r i n e 11丫 e r u s i n g P r o t e i n A 一g o l d t e e h -
n i q u e 以 l i g h t m i e r o s e o P o i e l e v e l : A
m e t h o d o ! g i e a l s t u d y
.
J J o n g j i M e d U n i v
1 0 5 7 , 7 ( 2 )
:
7 4
.
4
.
G e C g l
一e g a n W D
,
A c k e r m a n G A
.
A d幻 r -
p t i o n o f h o r s e r a d i s h P e r o x i d a s e
, o v o m u 一
e o i d a n d a n t i一 i m m u n o g l o b ul i n t o e o l l o i d
g o l d f o r t h e i n d i r e e t d e t e e t i o n o f co n 一
e a n a 、书 l i n A , w h e a t g e r m a g g l u t i n i n a n d
g o a t a n t i一h u m a n i m m u n o g l o b u l i n G o n
e e l j s u r f a e e s a t t h e e l e e t or n m i e r o s e o P i e
l e
、 , e l : a n e w m e t h o d , t h e o r y a n d a p p一
! i e a t i o n
.
J H i s t o hc e m C y t o 比 e m 1 9 7 7 :
2 5 ( 2 1 )
: 2 2 5 7
.
5
.
K i e r n e n J A
.
L o e a l i z a t i o n o f a
一D 一 g l u e o s y l
a n d a 一D 一 m a n n o s y l g r ou P
s o f m u e o s u b s 一
t a n e e s w i t h e o n e a n a v a l i n A a n d h o r s e 一
r a d i s h p e r o x i d a s e
.
H i s t o e h e m i s t r y 1 9 7 5 :
4 4 ( 上) ; 3 0
.
6
.
1王o w a r d D R , e t a ] . C a r e i n o m a 一 a s s o e i a t e d
e y t o s t r u e t r u r a l a n t i g e n i e a l t e r a t i o n s :
D e t e e t i o n b y l e e t i n b i n d i n g
.
C a n e e r
1 9 5 1 ; 4 7 ( x Z )
:
2 5 7 2
.
7
.
1玉r a m w e l l V H C , e t a l . S t u d i e s o f ] e e t i n
i〕 i n d i n g t o n o r m a l a n d n c o lP a s t i e l y m 一
p h o i i d t i s s u e
.
1
.
N o r m a l n o d e s a n d
H o d g k i n
. s d i s e a s e
.
B r i t J C a n e e r 1 9 8 2
;
4 ` ( 4 ) : 5 c s
`
8
. r
l e m i n k J H M
, e t a j
.
A e o m P a r a t i v e s t u d y
o f f o u r e y t o e h e m i e a l d e t e e t i o n m e t h o d s
。 f e o 月 e a n a v a l i n A b i n d i n g s i t e s o n e e l l
n l 。 。 l b r a n e
.
E x p C e l } R e s 2 9 7 5
; 9 2 ( 2 )
:
3 0 7
.
9
.
H o l g a t e C S
, e t a l
.
I m
xn u n o s o ! d 一 s i l v e r
s t a i n i n g
: n e w m e t h o d o f i m m u n o s t a i n i n吕
w i t h e n h a n c e d s e n s i t t v i t y
.
J H i s t o e h e m
C y t o e h e m 1 9 8 5 ; 3 1 ( 7 )
: 。 3 8 .
1 0
.
R o h o l l P JM
, e t a l
.
C o m F a拟 t i v e i m m u -
n o h i从 o e h e m i e a 玉 i n v e s t i g a t i o n o f 门 a 少: e r s
f o r m a j i g n a n t h i s t i o e y t e s
. 丁!飞l m P a t {飞0 1
2 0 8 5 ; 1 6( 8 )
: 7 6 3
.
( 1 0 8 7年 3 月一8 日 收稿 )
1 87
C o n c an a v al i n A Re e e P t o r De t e e t i o n a s AN e w
Hi sto e h e mi e al S t ai n i n gf o r Mae r 0P h a ge s an d
Hi st io e yt e : s De mo n str at i o n i n P ar af f i n S e e
-
t i o n sb y Go l d
一
l ab e l le d
一
HRP
一 si l e vr T e e h n i q u e
Xu Y u h u i
,
W u Z h o n g b i
D e P a r tm e n 云 o f U 乙t r a s t r u e t u r a乙 p a t孔。 乙o g y , T o 砚 g j i
M
己d落ca l U凡云ve r s云t y , W u h a n
A b s t r a e t A n e w孟h i s t o e h e m i e a l m e t h od f o r d e t e c t i n g C o n c a n a va l i n A b i n d i o g
s i t昭 i n f o r m a l i n 一 f i x e d , aP ar f f i n 一 e m b e d d e d t i s s u e 15 d es e r i b e d tha t u t i l l z es b o t h G e -
o g he g
a n ’ 5 i n d i r e e t g o l d
一
la b e l l e d H R P t e e h n 乡q u e a n d s u b s e q u e n t D a n s e h e r ’ 5 s i l v e r
i n et n s i f i e a t i o n
.
T h e t e e h n i q u e se l e e t ive l y d
e m o n s t r a t e s m a e r o P ha g
e s a n d h i s t i o e y t e s i n
h u m a n l y m P h n o d e W i t h r e a e t ive h y p
e r lP
a s i a a t a l o w e r e o n e e n t r a t i o n o f C o n A
.
T h e Op t i m
u m e助d i t i o n s f o r a P P l i aC t i o n o f t h i s 功 e t h o d a r e e s t a b l i s h e d . T h e p r oc e d u -
r e 15 s i m P l e
,
r a P i d a n d e e o n o m i e
.
I t a P详a r s a d v a n t a g e o u s i n s t u d y i n g n o r m a l a n d
d i s o r d e r e d m o n o n u e l e a r P h a g o e y t i e s y s t e m i n b o t h e x p e r i m e m t a l a n d s u r g i e a l P a t h o
-
10 g y
.
K e y w o r d s C o n A b i n d i n g ; m a e r o P h a g es a n d h i s t i o e y t es ; g o l d
一 la b el led H R P
-
s i l v e r t e e h n i q u e ; h u m a n l y m P h n o d e
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .… … , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . …… ` . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .…… `… , . . … , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .… …
耳 穴 埋 压 法 治 疗 慢 性 尊 麻 疹
同济医科大学附属同济医院皮肤科 凡 丽 华 周礼 义
1 9 8 7年 4 ~ 1 月 , 我们以耳穴埋 药按压法治疗
尊麻诊 5 0例 (男 2。例 , 女 30 例 ) , 慢性尊麻疹 45 例 ,
皮肤划痕症 5 例 . 病期最短 1 月 , 最长10 年 。 病人
皆为反复发作 , 经各种治疗无明显好转者 。
治疗方法 : 取用王不留行 , 将其置于小块正方
形胶布上 , 准确地粘于两侧耳上 ,取耳穴处 , 给予适
度的揉 、 按 、 捏 、 压 . 每日 5 次 , 每次 1 5分钟 , 隔
日更换 . 选贴穴位 , 主穴肺 、 尊麻疹点 、 神门 , 每
次两侧均同时选用。 配穴 , 如心 , 肾上腺 、 内分泌 、
枕 、 神经衰弱点 , 根据症 状 相 应 选用 , 以加强疗
效 . 本法以 10 天为一个疗程 , 如无效时可继续进行
第二疗程 . 最长达三个疗程 。 多数二个疗程见效 。
结果 : 5 0例中痊愈 (皮疹 完全 消退 ) 26 例 , 好
转 (痒症明显减轻 ) 18 例 , 无 效( 自觉症状无缓减 ,
皮疹消退不明显 ) 6 例 , 有效率为 8 8 . 0肠 .
中医认为本病乃为风邪外袭 , 血热不清 , 浸淫
肌腆 , 流窜经络所致 . 神门有安神养心之功能 , 肾
上腺可调节机体 免 疫 功 能 , 故本疗法选用肺 、 神
门 、 肾上腺等穴 , 再则王不留行性味苦平 , 善于通
利血脉 , 行而不住 , 走而不守 , 故有行血 、 通经消
肿之功效 , 从而加强疗效 。 因此通过耳穴埋压法浴
疏通经络 , 调和气血 , 调整脏腑功能 , 以达驱风邪 ,
消血热之 目的 , 本方法简单 , 又无副作用 , 对慢性
尊麻疹病 , 常能获得满意的效果 。
( 1 9 8 8年 3 月 1 6 日收稿 )
.24 5
.
巨噬细胞和组织细胞的刀豆素 A受体染色
〔正文 见第 8 14页〕
人反应性增生淋巴结内次级淋巴滤泡 .示滤泡内巨噬细胞散布于弱阳性着色的淋巴
细胞之间 . Co n A浓度 0 5林部m l x 0 1 2
为图 1的局部放大 .示 巨噬细胞内吞噬的红细胞 x 24 0
反应性增生淋巴结内次级淋巴滤泡 。 示呈同心环状排列的阳性巨噬细胞和弱阳性的
淋巴细胞 . Con A 50卜g /m l x 10 2
淋巴结健质内淋巴窦内阳性巨噬细胞 . Co n A S。环g /m l x 24 0
,.32I日圈
日 4
日 Z A 迷走神经背核吻侧端平面 x ls 。
B 迷走神经背核门附近平面 x 18 0
C 迷走神经背核尾侧端平面 x 180
t F B书Y双标记细胞 t F B单标记 细胞
r N Y单标记细胞