全 文 ：中 国计划生育和妇产科 年 第 卷 第 期
论著与临床
鹿藿正丁醇提取物体外杀精作用及机制探讨
黄世兴 、 孟天庆 、 王 骁、 余 琼、 熊 承良
麗
，
基金项 目 ： 湖北省 人 口 和计划生育委员会项 目 （ 编号
作者单 位 湖北 武汉 ， 华中科技 大学 同济医学 院计划生育研究所 生殖医学 中心妇 产科 华 中科技大学 同济
医学 院计划生育研究所 武汉 同济生殖专科医院妇产科
作者简介 ： 黄世兴 ， 华 中科技大学计 划生育所在读硕士研究生 ， 研究方 向为妇产科
通讯作者 ， ：
【 摘 要 】 目 的 研究 虎 正 丁 醇提取物 （ 的 体
外杀 精子作用 及机制 。 同 时观察该提取物体外对嗜酸乳 酸杆菌 的 影响 ， 初 步评估 作 为 杀精子剂 的 可
行性和安全性 。 方 法 体外杀精子 实 验以 生理盐水 为 阴 性 对照 ， 壬苯醇醚 （ ， 为 阳性 对
照 ， 显微镜下观察浓度为 的 对人精子活 力 的
影响 ； 体外抑 菌 实验 用 试管稀释法和琼脂稀释法 ； 体 外杀精子机制 探讨 ： 用 伊红 水 试验和
荧光双染 ， 显微镜下检测 精子膜功能和精子 凋 亡 。 结果 在 浓度组 ： 体 外杀精实验 ， 原 地活
动精子 百 分率 为 （ ± ； 体 外抑 菌试验 ， 对 嗜酸乳 酸杆 菌抑 制 率为 ； 伊红 水
溶液染 色 ， 精子 头 部 未 着 色 百 分 率 为 （ ± 。 荧 光 双染 ， 凋 亡精 子 百 分率 为
± ， 死精子 百 分率 为 （ ± 。 结论 为 较安 全理想 的 体 外杀
精浓度 。 有显著 的体外杀精子作 用 ， 可能与破坏精 子膜和加 速精子凋 亡及死亡有 关 。
【 关键词 】 鹿 藿 正丁 醇提取物 ； 体外杀精 ； 乳酸杆 菌 ； 凋 亡
【 中 图分类号 】 【 文献标识 码 】 【 文章编号 】
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? 3 6 . 中 国计划 生育和妇产科 年 第 卷 第 期
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【 】 ； ； ；
本课题组前期实验研究证明 鹿藿及其提取物 再缓慢加人 精液于分离液上层 ， 以
有较好的抗生育作用 对生殖道常见病原体也有显 离心 。 沉淀用 稀释浓度为 （
著的抑制作用 。 因此 鹿藿及其提取物 有望开 。
发为兼具抗菌作用 的新型避孕药 。 本实验研究鹿 鹿藿正丁醇提取物提取过程 将鹿藿根
藿正 丁醇提取物 （ 粉碎 乙醇浸泡 次 渗滤 ， 得到 乙醇
体外杀精子作用及机制和该 浸膏 ， 将乙醇浸膏 （ 用 倍水溶解后得到水
提取物体外对乳酸杆菌 的影响 ， 为将其开发为新型 溶液 再用乙 酸 乙酯萃取后得 到油相 和水相 ， 其 中
外用避孕药提供实验依据 。 水相用正丁醇萃取再得到水相和油相 ， 其中油相为
鹿藿正丁醇浸膏 。
材料和方法 鹿藿正丁醇提取物制备 将鹿藿正丁醇
材料 提取物 溶于 生理盐水 中得到混悬液 ； 低速
鹿藿正丁醇提取物 （ 河南科技大学化工与制药 离心机 ， 离心 离心除渣 ， 调整
学 院 天 然 药 物 研 究 室 提 取 ） ； 分 离 液 值为 微孔滤膜过滤除菌 ， 管分装 ，
； 壬苯醇酸 ， 上 力 冻存备用 。
海现代制药股份有限公司生产 体外杀精 参照 改进 的方法进行
； ； 浊度计 体外杀精实验 。 以生理盐水为阴性对照 为阳
上海 ） ；乳酸杆菌菌株 （ ， ； 离心机 性对照 ， 个 浓 度组 ， 分别为 、
电热温培养箱 （ 、
上海 ） ； 显微镜 （ 。 。 将 精液与 的 混
实验方法 匀 迅速取一滴于载玻片上 室温下连续观察
体外杀精 个高倍镜视野 以全部精子失活为终点 计算
精液标本收集和分析 标本采集于 内 活动精子百分率 。
年 月 至 年 月 ， 来 自 于 例湖北省人类精 抑菌实验
子库捐精志愿者 均签有知情同 意书 ， 年龄 为 培养基 酪蛋 白 胨 ， 牛 肉 浸膏
岁 健康男性 。 精液标本禁欲 手淫法取精 。 ， 酵母提取物 ， 葡萄糖 ， 乙酸钠 ， 柠檬
内 液化 ， 按照世界卫生组织 （ 酸二胺 吐温
标准进行精液常规分析 。 ， 琼脂
筛选精子活动率 ， 浓度 的精液 将上述溶于 蒸馏水 高压灭菌 三
标本 。 角烧瓶分装备用 。
精子悬液制备 精子悬液制备用 细 菌悬 液 制 备 将 嗜 酸 乳 酸 杆 菌
梯度 密度离 心法 。 取新鲜正常 的精液标本 ， 将 ， 接种 于 培养液 中 ， 培养
的 分离 液 加入 的锥形离心 。 用浊度计调整试管 内 菌液浓度 麦 ，
管 ， 后沿管壁缓慢加人 的 分离液 相当 于 ， 按 ： 稀 释 ， 在
中国计划生育和妇产科 年 第 卷 第 期
内接种 。 梯度密度离心 ，精液浓度为 （
试管稀释法 排列 号试管 装 人 精子活 动率为 （ 。 精 液 与
稀释备用 的细菌悬液 号加人 生理 混合后 ， 内活动精子百分率变化详见表 。
盐水 ， 号加入 浓度分别为 、 各个浓度组 的活动精子百分率明显低于对
、 、 、 、 照组 （ 。 浓度组仅见 （ ±
的 溶液 ， 再加 入 的 的精子存在原地活 动能力 。
液体培养基 。 孵育 ， 观察结果 。 浓度组 ± 的精子具有运动能力 ，
琼脂稀释法 选择直径为 的培养 部分具有前向运 动能力 。 体外杀精子作用
皿 每个浓度组三个培养皿 ， 加入 稀释备用 稍弱 于 。
的细 菌 悬液 ， 实 验 组加 人 浓度 分别 为 抑菌实验
、 、 、 、 将 嗜 酸 乳 酸 杆 菌 与 含 有
的 溶液 ， 对照组加人 的 于 温箱鮮育 观察结果 ， 详
生理盐水 。 再加人适量 的 琼脂 ， 吹 见表 。 琼脂稀释法和试管稀释法都显示
打混匀 待琼脂凝 固 倒置 温箱孵育 对嗜酸乳酸杆菌 有不同程度的抑制
观察结果 。 作用 。 不同浓度组其体外对嗜酸乳酸杆菌抑制率
体外杀精作用机制 存在差异 。
伊红 水试验 将稀释备用 的精子悬液 伊红 水实验
分别与 浓度为 伊红 水溶液不仅可以 通过检测精子尾部肿
及 的 溶液混匀 ， 对照组选择生理 胀率来反映精子尾膜的完整性 也可 以通过检测头
盐水 。 将精液与 伊红 水溶液按 部未着色率来评估精子 头膜的 完整性⑴ 。 本实验
比例于载玻片上混匀 ， 盖上盖玻片 ， 静置 通过伊红 水实验 来评估 对人精子膜的
显微镜下连续观察 个高倍镜视野 ， 至少计数 影响 。 取 份人新鲜精液 ， 精液浓度及活动精子率
个精子 ， 计算精子头部未着色百分率和尾部肿 分别为 及 经
胀百分率 。 梯 密度 离心 ， ■ 悬： ， 胃整浓度为 （
。 荧光双染 将稀释备用 ， 精子活动率为 （ 。
的精子悬液 与 浓度 为 与新鲜精液混合后 ， 通过伊红 水实验 精子膜 的
及 的 溶液混匀 ， 对照 改变结果详见表 ，显微镜下精子形态见图 。 精子
组选择生理盐水 。 将终浓度为 头部未 色
■ 分率■部肿胀百分率都低于对照
和 按 ： 混合 。 将稀释至 的精子 组 。
悬液与染液按 ： 的比例混合 ， 避光染色 。 荧光双染
荧光显微镜下连续 个高倍镜概 计数至少 ° 能透过包膜完整的细胞 ， 嵌入细
个精子 计算正常精子 、 调亡精子和 坏死精子百 的细胞 嵌入核 ， 发橘红色光 。 荧光显微镜
紫外光激发下 正常精子淡蓝色 ； 凋 亡精子亮蓝色 ；
使用统计软件 进行统计学分析 ， 数 本实验 ， ，
过 。
据用 趣 ，細 检验贿显■■ ， 取 份人新鲜正常精液 ， 精液浓度及活动精子率分
‘ 、 ° 别为 （ ， 经 梯
度密度离心 重悬 浓度为 ， 活动精子
率为 。 荧光显微镜下精子形态见图 各
型精子形态比率改变详见表 。 从表 中 ， 我们发现取 份人正常新鲜 精液 精子浓度为 （ 精子凋亡率和死精子率高于对照组 戶 。活 动精 子 率为 （ ， 经 过
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表 不同 组别体外活动精子百分 率的 比 较 （ 打 ， ± 表 伊红 丫 水 实验结果 （ 打 ， ％ ， ±
药 物 浓度 （ 活动精 子百分率 ％ 分组 生理盐水
± △ ± ± ± ±
± ± ± ± ±
± ± ± ± ±
± ± ± ± ±
壬苯醇醚 土 ± ± ±
± ± ± ±
注 ： 与对照组 比较 。 为头未着 色 ， 尾肿胀精子 为
头未着 色 ， 尾未 肿胀精 子 为头 着色 ， 尾肿胀 精子 为头着
土
色 ’尾未肿胀精子 。 为头部未着色率 为尾部肿胀率 。
生理 盐水 ± 表 双染调亡和死精子百分率 ， ％ ±
注 与对 照组相 比 尸 。 与 相比 。 分组 生理盐水
表 体外对 嗜酸乳酸杆菌抑制率 （
正常精子 ％ ± ± ± ±分组
凋亡精子 ％ ± ± ± ±琼脂稀 释法 （
死亡精子 ％ ± ± ± ±试 管稀释法 （ ％
注 ： 与对照组比较 ， 。 凋亡精子与死精子相比 ， 。
■
图 头未着色 ， 图 头未着色 ， 图 头着色 ， 图 头着色 ，
尾未肿胀精子 尾肿胀精子 尾未肿胀精子
图 伊红 水 溶 液 染 色 ， 精子膜 的 改 变情况 型 ， 。
■ ■ ■
图 正常精子 图 凋 亡精子 图 死精子
图 与人精液混合后 荧光双染 荧光显微镜紫外光激发下 精子形态 型 。
中国计划生育和妇产科 年 第 卷 第 期
讨论 头膜的破坏率达 。 因此 ， 和其他杀精剂
体外杀精剂如 是一种避孕效果好 ， 目 前 一样能通过破坏精子胞膜达到避孕 目 的 。
广泛使用的避孕药 。 但是有文献报道 有增加 精子凋亡是精子发生过程 中 的重要过程 ， 自 发
人类免疫缺 陷 病毒 （ 精子调亡是维持正常精子数量 的重要特征 。 诱
感染发生率的危险 ° 。 因此 ， 有必要研发一 发过多的精子凋亡是一种不正常 的病理现象 ， 过多
种新型的体外杀精剂 。 鹿藿是我 国 民 间避孕经验 的精子凋亡与不育有密切 的关系 。 因 此 ， 也可 以通
方中的一主药 。 本课题组前期实验研究发现 鹿藿 过检测凋亡精子率来评估 避孕效果和探讨
及其提取物体外能抑制精子运动 对生殖道”常见病 其体外杀精 子机制 。 本实验通过
原体也有明显抑制 作用 。 因此 ， 进一步了解鹿藿及 突光双染方法 检测 对精子凋亡的影响 发
其提取物的抗生育作用 ， 有利于兼具抗菌作用 的新 现 直接作用于人精子加速了精子的凋亡和
型避孕药的研发 。 本实验通过对 进行体外 死亡 。 在有效的体外杀精子浓度 能直接致
杀精子实验 发现 的 与人精子混 精子死亡 。 因此 通过加速精子凋亡 ， 快速
合后 ， 显微镜下仅见 ± 的精子 尚 有 致精子死亡达到避孕 目 的 。
原地活动能力 。 值及渗透压对精子质量有很大 综上所述 的浓度为安全有效的体外
影响 ， 阴道 本实验用药 调整 杀精 子浓度 。 有 望开发为 外 用避 孕 药 ，
避免了酸性对精子的影响 ； 用生理盐水稀释 能通过破坏精子膜 加 速精子凋亡 ， 快速致
避免 了蒸镏水的低渗压 ， 因 此 ， 我们 推测 有 精子死亡而达到避孕 目 的 。 另 外本课题组前期试
良好 的体外杀 精作用 的 浓度 为 验证明 对生殖道常见致病微生物也有较好
较理想的体外杀精子浓度 。 的抑制作用 。 因此 ， 有望开发为兼具抗菌作
新的 避孕 方 式 ， 要 求 避 孕 效果 和 安 全性 兼 用的新型外用避孕药 。
容 。 因此 ， 评估 体外杀精子作用 的安全
性具有重要意义 。 健康女性 阴道 中含有 的乳 【 参考文献 】
酸杆菌 ， 维 持着 整 个生 态 系 统 的 平 衡 和 生 殖健 王建 刚 熊承 良 王淑英 等 鹿藿根 种提 取物抗雄性 小 鼠生
康 。 细菌 阴 道病 （ ， 是 育作用 比较 中 华男科学杂志
世界上最普遍的生殖道感染性疾病之一 ， 以伴随乳 ⑴ 王建 刚 ’ 熊承 良 ’ 王学廷 ’ 等 鹿藿醇提取物 的体外杀精及抗菌
口 作用 时珍国医国 药 ， 丨酸杆菌显著减少 致病菌异常增多为临床特征 。 另
「 。 ⑶女凃惠敏 ， 胡 廉 ， 熊承良 中药鹿藿 的抑菌实验研究 天 然产外研允 表明 ， 及性传播疾病与 有关联 。 物研究与开发
因此 ， 检测 对阴 道乳酸杆菌的 影响 ， 具有重
要意义 ， 可以 用来评估 作为杀精剂 的安全
性指 标 。 本 实 验 通 过 体外 实 验发 现 ， 不 同 剂 量 ，
体外 对嗜酸乳杆菌 有 不同 ⑶ ： “
抑制作用 。 正常妇女生殖道 酸乳酸杆菌 占 ’ 影 响 第 四军 医大学学报 細 狐而 患者生殖道仅有 。 因此 具有最 小体 余力摔 李 华 ，杨为民 等 凋亡精子 两种染色法 的比较
外杀精子作用的 的 为安全的体外 中华男科学杂志 ， ：
杀精子浓度 。 岳 林 精子膜完整性 与精子功能评估的相关性研究 中 国
客观的评价精子功能 已 经成为为评估新鲜精 计划生育学杂志
液授精能力及诊断不育的 重要指标 。 一些植物 汤亲青 ’ 于燕妮 双赢光 活染法 检测 氣对体外
曰 培养小 鼠肾小管上皮细胞调亡的影响 中 国地方病学杂志 ，提取物杀精子作用都是通过破坏胞膜而 达到避孕
， ：
—
效果 ’ 。 因此 ， 对精子 能的检测有助于评估 赖桂华 邱小 忠 余 氣 等 氧化应激对 雌细胞增值
的避孕效果和探讨其体外杀精子作用机制 。 与凋亡的影 响 中国 组 织 工程研究 与 临床康复
本实验通过伊红 水实验来评估精子膜的功能 ， 实 （ ：
验结果显 直接作用 于人精子后 ， 精子膜 ，
功能均受到严重破坏 。 的 对精子 （ 下转第 页 ）
. 4 2 ? 中 国计划生育和 妇产科 年 第 卷 第 期
和一侧卵巢位置异常 （ 多位于子宫后方 ） ， 例在 同 恶心 、上腹不适 、头晕胸闷 、 心悸等 。 多数不 良反应
侧 附件区存在卵巢子宫 内膜异位囊肿 ， 随后的腹腔 在检查结束后 左右 自 行消失 ， 仅有 例患者
镜检査显示患者盆腔 内存在粘连和输卵管扭 曲 ， 此 需要对症处理缓解症状 。
时输卵管走行不在同 一水平 导致二维超声追踪 观 综上所述 笔者认为 ， 使用声诺维超声造影评价
察困难而误诊 。 三维超声造影的 空间 成像技术 输卵管梗阻准确性高 并可提示输卵管的走行状态和
可克服此 不 足 ， 将是输 卵 管 造 影技术 的 发展 方 梗阻部位 ， 操作简便 ， 无放射危害和药物过敏 ， 可作为
向 。 另 例患者因体型肥胖超声声束穿透困难而 临床一线技术筛查女性不孕症的输卵管通畅性 。
误诊 。 条被超声造影漏诊的梗阻输卵管 ， 其中 条
为伞端不全闭锁 ， 声像图特征为造影剂在伞端局限性 【 参考文献 】
聚集和延迟溢出 ， 在检查初期操作者对此认识不足 。 ⑴ 丰有吉 ， 沈 铿主编 妇产科学 北京 ：人 民卫生 出版社 ，
本组研究尝试通过观察造影剂 在输卵管 内 的 “
命 科 法 斗 也 啦 丨 ； 抽 如 户 甘 、 社 由 本 姚荣玉 ， 马小玲 ， 李 琴 双氧水子宫输卵管声学造影 例⑴
中 国 生育健康杂志 ， ⑶ ：
。 分析主要误诊原因是 当输卵管 因盆腔粘连 査晓霞 ， 邓 晓杨 ， 游艱 ， 等 声诺维超 声造影诊断输 卵管性
而扭曲 时 ， 通过二维超声不易观察到造影液在输卵 不孕症的临 床价值研究 中 国 超声 医学 杂 志 ，
管全段的流动 ， 因而不能精确地判断梗阻部位 。 而 （
对远段梗阻的诊断符合率优于近段梗阻 ， 应归 因 于
本组多数患者输卵管梗阻为伞部的粘连 ， 此时超声 ° °
造影多呈现输卵管的增粗和扭■ 曲 ， 及造： 影剂在伞
：
■形 胃 。 李兰兰 ， 刘红霞 ， 孟媛媛 ， 等 腹腔镜诊治输卵管性不孕症
另外 ， 本组研究提示 了 例输卵管卵巢周围 粘 例 中国生育健康杂志 ， ：
连 ， 得到腹腔镜检査证实 但未能提示另外 例盆
腔粘连 。 不 良反应方面 下腹部疼痛不适为超声造 ° ‘
、 — 一影检査的主要不 良反应 ， 本组 中有
的患者 出现明显疼痛 这与梗阻程度 、 造影剂 温度 、
用量 、推注速度和 检查 持续时 间 以 及患 者 紧张 有 （ 收稿 日 期 编辑 ： 魏 魏 ）
关 。 另有 患者 出现迷走神经反应症状 ， 包括
上接 第 页 ） ， ，
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： 收稿 日 期 编辑 ：魏 幾 〉