全 文 ：第 15卷第 6期
1999年 12月
中国生物化学与分子生物学报
Chinese Journal of Bio chemist ry and Molecular Biolo gy
Vo l. 15, No. 6
Dec. , 1999
　* 　 福建省自然科学基金资助项目 ( B96019)
* * 　联系人　 Tel: ( 0591 ) 3711368- 2115, Fax: ( 0591 )
3714946, E-mail: lyj@ ms. f ji rsm. ac. cn
郝　冰 ,女 , 1970年 6月生 ,硕士
收稿日期: 1998-12-11,修回日期: 1999-03-22
研究简报
豆薯种籽中一种抗真菌蛋白 PaAFP的分离纯化和
部分特性研究*
郝　冰　叶晓明　林玉娟* *　陈明晃　蔡建华　宋立军
(结构化学国家重点实验室 ,中国科学院福建物质结构研究所 ,福州　 350002)
Isolation, Purif ication and Partial Characterization of an Antifungal Protein
PaAFP from Seeds of Pachyrrhizus erosus
HAO Bing, Y E Xiaoming , LIN Yujuan
* , CHEN Minghuang , CAI Jianhua, SON G Lijun
( Sta te Key Laboratory of S tructure Chemist ry , Fuj ian Institute of Structure of Matter ,
Chinese Academy of S ciences , Fuzhou 350002)
Abstract　 An antifungal pro tein named PaAFP w as isolated and purified f rom the seeds of
Pachyrrhizus erosus by ex t raction w ith PB buf fer , S-Sepharose Fa st Flow , CM -52 cel lulo se and
Sephadex G-75 column ch romatog raphy. On po ta to-sucrose-agar medium , the puri fied pro tein
obviously inhibited the g row th of the impo rtant edible fungus pathogens Trichoderma viride and
Chrysosporium luteum at 6. 2μg and 12. 5μg per disc respectiv ely. The molecular weight w as
about 14 kD by SDS-PAGE and HPLC. The iso elect ric point w as pH7. 5. Analy sis of the compo-
si tion o f amino acids show ed that this pro tein was rich in Asx , but lacking in M et.
Key words　Pachyrrhizus erosus , Anti fungal pro tein, Purification
　　各类植物由于缺少自身免疫系统的支持 ,因而
必须依赖于其它机制来抵御外来微生物的入侵 .其
中的一种重要机制就是通过合成体内各类能抑制微
生物生长的蛋白质来完成的 [1 ] .已报道从植物中分
离出多种不同的抗真菌蛋白 .广为研究的是几丁质
酶和 β -1, 3-葡聚糖酶 ,认为它们在植物对真菌病的
抗性中起重要作用 [2, 3 ] ;核糖体失活蛋白 ( RIPs)和
一类富含半胱氨酸的碱性多肽 Thionins也显示有
非专一的抗真菌活性 [4, 5 ] .但仍有一些蛋白质 ,体外
表现强烈的抗真菌活性 ,却不属于以上范围 [6, 7] .本
文报道了豆薯种籽中一种抗真菌蛋白的分离纯化和
部分特性的研究结果 .
1　材料和方法
1. 1　材料
S-Sepharose Fast Flo s和 Sephadex G-75为
Pha rmacia产品 ; CM-52纤维素为 Whatman产品 ;
低分子量标准蛋白为上海生化所东风试剂厂产品 ;
其余试剂为分析纯 .福建省农科院提供供试真菌:绿
色木霉 ( Trichoderma viride ) ,黄霉菌 (Chrysospori-
um luteum ) ,灵芝菌 (Ganoderma lucidum ) ,疣孢霉
(Mycogone Srniciosa ) ,稻瘟菌 ( Pyricularia oryzae) .
真菌培养基为马铃薯蔗糖琼脂 ( PDA)培养基 ,成分
如下:马铃薯 200 g ,蔗糖 15 g,琼脂 16 g ,以水溶解 ,
终体积为 1 000 ml,高压灭菌 30 min.
1. 2　方法
1. 2. 1　蛋白的分离和纯化
称取豆薯种籽 100 g ,经粉碎后 ,加入 800 ml
pH7. 2、 5 mmo l /L磷酸盐缓冲液 ( PB)进行匀浆 ,于
4℃抽提过夜 .将粗提液过滤 ,滤液用 50% HAc调至
pH4. 0,静置 2 h后 ,离心 ( 12 000 r /min) 30 min.上
清液上用 pH4. 5、 0. 01 mol /L的 NaAc缓冲液充分
平衡的 S-Sepharose F F柱 ( 2. 6 cm× 15 cm ) .上样
后用 pH7. 0, 5 mmol /L的磷酸盐缓冲液充分洗去
DOI : 10. 13865 /j . cnki . cj bmb. 1999. 06. 035
杂蛋白 ,再用含 1 mo l /L NaCl的相同 PB阶段洗脱 ,
得一尖锐高峰 SF峰 .收集 SF峰 ,先后对蒸馏水及
pH6. 5, 5 mmo l /L的 PB缓冲液 ( A液 )透析 .将透
析液离心 ( 10 000 r /min) 30 min后 ,上清液上用同
样缓冲液平衡的 CM-52纤维素柱 ( 1. 5 cm× 15
cm ) .洗去杂蛋白 ,用 400 ml含 0～ 0. 5 mol /L NaCl
的 PB缓冲液进行梯度洗脱 ,收集洗脱峰 Cl.经过浓
缩、透析 ,离心 ( 10 000 r /min ) 30 min,将 Cl上
Sephadex G-75柱 ( 2. 6 cm× 20 cm ) ,用 A液进行洗
脱 ,收集洗脱峰 C1G.
1. 2. 2　分子量的测定
SDS-PAGE按 Laemmli的方法 [8 ]进行 ,凝胶浓
度 7% .同时 ,根据未知蛋白与标准蛋白滞留时间的
比较 ,用分析性高效液相色谱 ( HPLC)测定蛋白质
分子量 .
1. 2. 3　等电点的测定
等电聚焦电泳参照 Catsimpoolas的方法 [9 ]进
行 .蛋白质样品和载体两性电解质 ( pH3. 5～ 10)聚
合于 7. 5%的凝胶中 ,正极电泳液为 5%磷酸 ,负极为
5%乙醇胺 .
1. 2. 4　 HPLC分析
各步分离所得的蛋白样品用高效凝胶蛋白分离
柱 Pro tein-PAK125( Waters Co. ) ,结合岛津 ( Shi-
madzu)的 SPD-M IA光电二极管阵列检测器进行了
组分分析和纯度分析 ,并给出了 200～ 400 nm范围
的紫外吸收光谱图 .
1. 2. 5　氨基酸组成分析
称取 1 mg左右的样品 ,用 6 m l /L HCl在 110℃
水解 24 h后 ,采用邻苯二甲醛 ( O PA)柱后衍生荧光
法 ,在岛津 LC-4A高效液相色谱仪的氨基酸分析系
统上测定样品的氨基酸组成 .
1. 2. 6　抗真菌活性检测
参照 Roberts[4 ]和胡忠等人 [6 ]的菌丝生长抑制
法 ,在直径 9 cm的培养皿中加入 PDA培养基 8 m l,
将每种经过斜面活化培养的真菌菌丝块接种于培养
皿 ,每个培养皿接种同样的 4块 ,置于 24℃培养 .待菌
丝向外蔓延的圆面直径约 3 cm时 ,取无菌滤纸圆片
(直径 0. 5 cm) ,平放在菌丝生长前方约 1 cm处 ,每
皿 5个 .待测试样品用无菌水配制成不同浓度 ,分别
滴加在滤纸片上 ,每一纸片滴加 10μl,其中位于中
心的滤纸片滴加等量无菌水作为对照 ,置于 24℃ .加
有抗菌活性物质的纸片周围出现抑菌圈 ,以肉眼可
以观察到菌丝生长被抑制的蛋白含量为抗菌指标 .
2　结果和讨论
2. 1　抗真菌蛋白 PaAFP的分离和纯度鉴定
豆薯种籽的蛋白粗提液经调酸、过滤后 ,清液上
S-Sepha ro se F F柱 ,洗出峰样品经 HPLC分析 ,共
分出两个大峰 S1和 S2(结果已另文发表 [10 ] )和一个
较小的峰 S3.对三峰用光电二极管阵列检测器进行
紫外光谱扫描 ,在λ= 280 nm处有强吸收 ,λ= 260
nm处弱吸收 ,证明是蛋白峰 . SF峰经过 CM-52纤
维素柱梯度洗脱 ,得一个峰 C1( Fig. 1) .峰 C1经
Sephadex G-75柱 ,洗脱后 ,主要峰 C1G( Fig . 2)定名
为 PaAFP(即 S3) .经 SDS-PAGE( Fig. 3) , HPLC
( Fig . 4)及 IEF鉴定 ,均为单一纯 .从 1 kg种子中可
得纯 PaAFP 10 mg.
Fig. 1　 Ion exch ang e ch romatography of th e S3 f raction on
CM-52 cel lulos e column
Eluted w ith th e gradien t 0～ 0. 5 mol /L Na Cl
Fig. 2　 Gel f il t ration of f raction Cl on Sephadex G-75
colum n Eluted wi th pH6. 5, 5 mm ol /L PB buf fer
2. 2　部分生化性质的测定
SDS-PAGE与 HPLC上根据滞留时间分析的
结果均表明 , PaAFP的分子量约为 14 kD.而由
Table 1氨基酸组成分析结果推算其分子量接近 15
kD .由 IEF显示 , PaAFP等电点是 pH7. 5,属于
1007第 6期 郝　冰等: 豆薯种籽中一种抗真菌蛋白 PaAFP的分离纯化和部分特性研究 　
Fig. 3　 SDS-PAGE pat terns of Pa AFP
Lane 1, Molecular w eigh t Stadand s;
Lane 2, Lysozyme( 14. 4 kD)
Lane 3, Pa AFP
Fig. 4　 Elu tion profi le of Pa AFP in HPLC
中性偏碱的蛋白质 .由 Table 1可见 PaAFP的特点是
高含 Asx ( 34 mo l /mo l) ,但不含 Met ,是个单链蛋白 .
Table 1　 Amino acid composition of PaAFP
Amino
acid
Conten t
( mol mol )
Amino
acid
Con tent
( mol mol)
Ala 5. 18( 5) Met 0. 44( 0)
Cys 1. 38( 1) Pro 8. 78( 9)
Asx 34. 26( 34) Arg 5. 93( 6)
Glx 8. 81( 9) Ser 5. 89( 6)
Phe 8. 58( 9) Th r 12. 43( 12)
Gly 13. 05( 13) Val 2. 88( 3)
His 5. 55( 6) Trp Nd
Ile 3. 19( 3) Tyr 0. 77( 1)
Lys 11. 28( 11) To tal 121
Leu 8. 35( 8) Mr 14964
2. 3　抗真菌活性的测定
由于抗真菌实验条件所限 ,我们未能在分离每
步跟踪测定其活性 ,而是将冻干的豆薯 3个蛋白
PaAFP ( S3) , S1和 S2[10 ]以及牛血清蛋白 ( bovine
serum albumin, BSA)配成 0. 06～ 20 mg /m l浓度梯
度样品 ,每个浓度平行作 3板 .结果显示蛋白 PaAFP
对木霉、黄霉菌菌丝的生长有明显的抑制作用 ,抑菌
最低量分别为每片 6. 2μg和 12. 5μg. PaAFP对稻
瘟菌菌丝的作用较弱 ,而对疣孢霉和灵芝的生长无
抑制作用 .蛋白 S1, S2和 BSA即使点样量达每片
200μg对所试真菌也无作用 .
抗真菌蛋白首次在豆薯种籽中被发现 .黄霉菌
和木霉是食用菌生产过程中的主要危害杂菌 ,尤其
是黄霉菌 ,它传播速度极快 ,再加上繁殖力很强 ,在
菌种生产过程中 ,一旦感染上这种菌 ,常常会引起成
批菌种报废 ,且很难根除 .我们纯化的蛋白 Pa AFP
能有效地抑制这两种菌的生长 ,而对食用菌 (如灵
芝 )却无可见的抑制效果 .因此 ,该蛋白无论是应用
于蛋白制剂 ,或者通过分离抗性基因 ,运用植物基因
工程方法进行抗病育种 ,都有一定的价值和意义 .
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1008 中国生物化学与分子生物学报 15卷