全 文 ：实验研究／论著
芒柄花素联合 ＭＫ２２０６对不同亚型乳腺癌细胞
增殖和凋亡的影响
盛佳钰　陈红风
上海中医药大学附属龙华医院乳腺科，上海２０００３２
【摘要】　目的　体外观察芒柄花素联合 Ａｋｔ抑制剂 ＭＫ２２０６对不同分子亚型人乳腺癌 ＭＣＦ－７、ＢＴ－４７４、ＳＫ－ＢＲ－３和
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１细胞株增殖和凋亡的影响。方法　ＭＴＴ法检测芒柄花素单独或联合 ＭＫ２２０６对４种不同分子亚型乳腺癌
细胞增殖的抑制作用。流式细胞术分析单独用药及联合用药对乳腺癌细胞生长凋亡的影响。实时荧光定量ＰＣＲ法检测
实验组中凋亡相关基因Ｂｃｌ－２和Ｂａｘ的表达。蛋白质印迹法检测磷酸化 Ａｋｔ（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｔｅ－Ａｋｔ，ｐ－Ａｋｔ）和总Ａｋｔ（ｔｏｔａｌ－Ａｋｔ，
ｔ－Ａｋｔ）蛋白表达。结果　芒柄花素和 ＭＫ２２０６均能抑制４种乳腺癌细胞的生长，呈剂量依赖性。选择８０μｍｏｌ／Ｌ芒柄花素
和２０ｎｍｏｌ／Ｌ　ＭＫ２２０６单独和联合处理４种细胞。联合用药后的抑制率高于单用药组，其中ＢＴ－４７４及 ＭＤＡ－ＭＢ－２３１细胞
的联合用药组产生了协同作用，Ｑ＞１．１５。两种药物均可诱导４种细胞凋亡，两药联用可使 ＢＴ－４７４、ＳＫ－ＢＲ－３和
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１细胞凋亡率显著增加，Ｐ＜０．０１。实时荧光定量ＰＣＲ与蛋白质印迹法检测结果发现，单独用药能上调Ｂａｘ及
下调Ｂｃｌ－２基因表达水平，并下调ｐ－Ａｋｔ蛋白表达水平，其中ＢＴ－４７４、ＳＫ－ＢＲ－３和 ＭＤＡ－ＭＢ－２３１细胞的联合用药组效果更
显著，Ｐ＜０．０１。结论　ＭＫ２２０６联合芒柄花素可抑制４种不同亚型乳腺癌细胞的增殖，诱导凋亡，联合用药效果更显著，
４种细胞效果有差异，其机制可能与抑制Ａｋｔ磷酸化从而阻断ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号转导途径有关。
【关键词】　芒柄花素；ＭＫ２２０６；乳腺肿瘤；增殖；凋亡；磷酸化Ａｋｔ
中华肿瘤防治杂志，２０１５，２２（１３）：９９８－１００３
Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｆｏｒｍｏｎｏｎｅｔｉｎ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　Ａｋｔ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ＭＫ２２０６ｏｎ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ
ａｎｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｕｂｔｙｐｅｓ　ｏｆ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌ　ｌｉｎｅｓ
ＳＨＥＮＧ　Ｊｉａ－ｙｕ，ＣＨＥＮ　Ｈｏｎｇ－ｆｅｎｇ
Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｂｒｅａｓｔ　Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｌｏｎｇｈｕａ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，
Ｓｈａｎｇｈａｉ　２０００３２，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ
［ＡＢＳＴＲＡＣＴ］　ＯＢＪＥＣＴＩＶＥ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ｅｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｆｏｒｍｏｎｏｎｅｔｉｎ　ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　Ａｋｔ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＭＫ２２０６）ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａ－
ｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｓｕｂｔｙｐｅｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌ　ｌｉｎｅｓ　ＭＣＦ－７，ＢＴ－４７４，ＳＫ－ＢＲ－３ａｎｄ　ＭＤＡ－ＭＢ－２３１．ＭＥＴＨＯＤＳ　
ＭＴＴ　ａｓｓａｙ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｅｖａｌｕａｔｅ　ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｃｅｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｆｔｅｒ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｆｏｒｍｏｎｏｎｅｔｉｎ　ａｎｄ　ＭＫ２２０６ａｌｏｎｅ　ｏｒ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
ａｔ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ．Ｃｅｌ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｒａｔｅ，ｃｅｌ　Ｂｃｌ－２／ｂａｘ　ｍＲＮＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ　ｐｈｏｓｐｈｏｒａｔｅ－Ａｋｔ（ｐ－Ａｋｔ）／ｔｏｔａｌ　Ａｋｔ（Ｔ－Ａｋｔ）
ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ＲＴ－ＰＣＲ　ａｎｄ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂｌｏｔ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＲＥＳＵＬＴＳ　Ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ
ｆｏｕｒ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｓｕｂｔｙｐｅｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｓ　ｗａｓ　ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ　ｉｎ　ｄｏｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｍａｎｎｅｒｓ　ａｆｔｅｒ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｆｏｒｍｏｎｏｎｅｔｉｎ，
ＭＫ２２０６ａｌｏｎｅ　ａｎｄ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．Ｆｏｕｒ　ｃｅｌ　ｌｉｎｅｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｆｏｒｍｏｎｏｎｅｔｉｎ　ａｔ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　８０μｍｏｌ／Ｌ　ａｎｄ　ＭＫ２２０６ａｔ
２０ｎｍｏｌ／Ｌ　ａｌｏｎｅ　ａｎｄ　ｉｎ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｇｒｏｕｐ　ｗａｓ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｓｉｎｇｌｅ　ｄｒｕｇ　ｇｒｏｕｐ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｎ　ＢＴ－４７ａｎｄ　ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ｓｈｏｗｅｄ　ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ　ｅｆｅｃｔ，Ｑ＞１．１５．Ｂｏｔｈ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｗｏ　ｄｒｕｇｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｆｏｕｒ　ｃｅｌ　ｌｉｎｅｓ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．
Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ＢＴ－４７４，ＳＫ－ＢＲ－３ａｎｄ　ＭＤＡ－ＭＢ－２３１．ＲＴ－ＰＣＲ　ａｎｄ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ
ｓｉｎｇｌｅ　ｄｒｕｇ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｒａｉｓｅｄ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｂａｘ　ｍＲＮＡ，ｒｅｄｕｃｅｄ　Ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ　ａｎｄ　ｐ－Ａｋｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ．Ｃｏｍｂｉｎｅｄ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｓｔｒｏｎｇｅｒ　ｅｆｅｃｔ　ｏｎ　ＢＴ－４７４，ＳＫ－ＢＲ－３ａｎｄ　ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ｃｅｌ　ｌｉｎｅｓ（Ｐ＜０．０１）．ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮＳ　Ｆｏｒｍｏｎｏｎｅｔｉｎ　ａｎｄ
ＭＫ２２０６ｃａｎ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｎｄｕｃｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｎ　ｆｏｕｒ　ｄｉｆｅｒｅｎｔ　ｓｕｂｔｙｐｅｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌ　ｌｉｎｅｓ．Ｔｈｅｓｅ　ｅｆｅｃｔｓ　ｍａｙ
ｂｅ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐ－ＡＫＴ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｂｌｏｃｋ　ｏｆ　ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙ．
［ＫＥＹＷＯＲＤＳ］　ｆｏｒｍｏｎｏｎｅｔｉｎ；ＭＫ２２０６；ｂｒｅａｓｔ　ｎｅｏｐｌａｓｍｓ；ｃｅｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；ｐｈｏｓｐｈｏｒ－Ａｋｔ
Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｐｒｅｖ　Ｔｒｅａｔ，２０１５，２２（１３）：９９８－１００３
【基金项目】　 国家自然科学基金（８１３７３６４７）
【第一作者简介】　盛佳钰，女，江苏海门人，博士，主治医师，主要从事乳腺肿瘤基础与临床的研究工作。
Ｔｅｌ：８６－２１－６４３８５７００　Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｈｅｎｇｊｉａｙｕ＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｍ
【通讯作者简介】　陈红风，女，浙江余姚人，主任医师，教授，博士生导师，主要从事乳腺肿瘤基础与临床的研究工作。
Ｔｅｌ：８６－２１－６４３８５７００　Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｈｈｆｌｕｋ＠１２６．ｃｏｍ
·８９９· 盛佳钰，等　芒柄花素联合 ＭＫ２２０６对不同亚型乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响
DOI:10.16073/j.cnki.cjcpt.2015.13.002
【中图分类号】　Ｒ７３７．９　　　【文献标识码】　Ａ　　　【文章编号】　１６７３－５２６９（２０１５）１３－０９９８－０６
　　研究发现，７０％的乳腺癌患者中存在磷脂酰肌醇
３－激酶（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ－３ｋｉｎａｓｅ，ＰＩ３Ｋ）／蛋白激酶Ｂ
（ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ　Ｂ，ＰＫＢ）信号转导通路位点的突变，其中
Ａｋｔ位点被认为是治疗乳腺癌的重要分子靶点［１］。乳
腺癌是一种在分子水平上高度异质性的肿瘤，雌激素受
体（ｅｓｔｒｏｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＥＲ）、孕激素受体（ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ　ｒｅ－
ｃｅｐｔｏｒ，ＰＲ）和人类表皮生长因子受体２（ｈｕｍａｎ　ｅｐｉｄｅｒ－
ｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　２，ＨＥＲ－２）是目前判断乳腺癌
患者预后并指导治疗重要的分子标志。根据其表达情
况，可将乳腺癌分为不同的亚型，本研究人乳腺癌细胞
ＭＣＦ－７、ＢＴ－４７４、ＳＫ－ＢＲ－３和 ＭＤＡ－ＭＢ－２３１，分别属于
Ｌｕｍｉｎａｌ　Ａ型、Ｌｕｍｉｎａｌ　Ｂ型、ＨＥＲ－２过表达型和Ｂａｓａｌ－
ｌｉｋｅ型。本研究以上述肿瘤细胞作为研究对象，探讨了
ＭＫ２２０６与芒柄花素联合作用对不同分子亚型乳腺癌
细胞增殖和凋亡的影响，并分析两者是否具有协同作用
及相关分子机制。
１　材料与方法
１．１　细胞与药品
人乳腺癌细胞株 ＭＣＦ－７、ＢＴ－４７４、ＳＫ－ＢＲ－３及
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ 均 购 自 中 国 科 学 院 上 海 细 胞 库。
ＭＫ２２０６购自美国 Ｓｅｌｅｃｋ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ公司 （批号：
Ｓ１０７８０６），相对分子质量４８０．３９，化学分子式为 Ｃ２５
Ｈ２１Ｎ５Ｏ·２ＨＣｌ，纯度为９９％，用二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）
溶解并配置成１０μｍｏｌ／Ｌ储存液，置于－２０℃冰箱中
保存。化学成分标准品芒柄花素（Ｆｏｒｍｏｎｏｎｅｔｉｎ）购自
中国药品生物制品检定所（批号：１１１７０３－２００６０３），相
对分子质量２６８．２７，化学分子式为Ｃ１６Ｈ１２Ｏ４，纯度为
９８％，用ＤＭＳＯ溶解并配置成０．１ｍｏｌ／Ｌ储存液，置
于－２０℃冰箱中保存。
１．２　主要试剂与仪器
ＤＭＥＭ高糖、Ｌ－１５及ＲＰＭＩ１６４０液体培养液、胎牛
血清、胰酶、磷酸盐缓冲液（ｐｈｏｓｐａｔｅ　ｂｕｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ，
ＰＢＳ）均为Ｇｉｂｃｏ公司产品，四甲基氮唑蓝（ｍｅｔｈｙｌｔｈｉａ－
ｚｏｌｙｌ　ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，ＭＴＴ）及ＤＭＳＯ均购自上海生工生物
有限公司，ＡｎｎｅｘｉｎⅤ／碘化丙啶（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　ｉｏｄｉｄｅ，ＰＩ）
试剂盒购自美国ＢＤ　Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ公司，Ｔｒｉｚｏｌ提取试剂
盒、反转录试剂盒和实时荧光定量ＰＣＲ试剂盒购自日
本ＴａＫａＲａ公司，实时荧光定量ＰＣＲ所用引物均由宝
生物工程（大连）有限公司合成，抗磷酸化Ａｋｔ（ｐｈｏｓｐｈｏ－
ｒａｔｅ－Ａｋｔ，ｐ－Ａｋｔ）、总 Ａｋｔ（ｔｏｔａｌ－Ａｋｔ，ｔ－Ａｋｔ）、内参ＧＡＰ－
ＤＨ（均为抗兔单克隆抗体）及其相应的二抗均购自美国
Ｃｅｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ公司。ＨＥＲＡｃｅｌ型ＣＯ２ 培养箱购自美国
Ｔｈｅｒｍｏ公司，５４２７Ｒ型低温高速离心机购自德国Ｅｐ－
ｐｅｎｄｏｒｆ公司，Ｓｙｎｅｒｇｙ　Ｈ１型酶标仪购自美国Ｂｉｏｔｅｋ公
司，ＦＡＣＳＡｒｉａ型流式细胞仪购自美国ＢＤ公司，Ｒｏｔｏｒ－
Ｇｅｎｅ　６０００型Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ仪购自美国Ｃｏｒｂｅｔｔ公司，
ＰｏｗｅｒＰａｃ型基础电泳仪购自美国Ｂｉｏ－ｒａｄ公司，Ｇ：ＢＯＸ
型化学发光／荧光凝胶成像系统购自Ｓｙｎｇｅｎｅ公司。
１．３　细胞培养
ＭＣＦ－７细胞用含１０％胎牛血清及０．０１ｍｇ／ｍＬ
牛胰岛素的ＤＭＥＭ 高糖培养基培养，ＢＴ－４７４及ＳＫ－
ＢＲ－３细胞用含１０％胎牛血清的ＲＰＭＩ１６４０培养基培
养，ＭＤＡ－ＭＢ－２３１细胞用含１０％胎牛血清的Ｌ１５培
养基培养，所有培养基中均加入１００Ｕ／Ｌ青霉素和
１０ｍｇ／ｍＬ链霉素。置于３７℃、５％ ＣＯ２ 的恒温培养
箱中培养，次日观察细胞贴壁情况并换液。贴壁生长
良好的乳腺癌细胞经０．２５％胰蛋白酶消化，选用对数
生长期细胞进行实验。
１．４　细胞活力检测
取对数生长期的各亚型乳腺癌细胞，调整细胞密度
为５×１０４　ｍＬ－１，接种于９６孔培养板中，２００μＬ／孔。置
３７℃、５％ＣＯ２ 的恒温培养箱中培养。待细胞贴壁生
长后，更换相应的无血清培养液使细胞饥饿培养２４ｈ
后，再换为各组含药物的完全培养液继续培养。
ＭＫ２２０６组分别按５、１０、２０、４０和８０ｎｍｏｌ／Ｌ浓度梯
度给 药；芒 柄 花 素 组 分 别 按 １０、２０、４０、８０ 和
１６０μｍｏｌ／Ｌ浓度梯度给药；联合用药组选取 ＭＫ２２０６
及芒柄花素抑制率 低 于 ＩＣ５０ 的 浓 度 进 行 组 合，
ＭＫ２２０６＋ 芒 柄 花 素 浓 度 分 别 为 １０ ｎｍｏｌ／Ｌ＋
４０μｍｏｌ／Ｌ、２０ｎｍｏｌ／Ｌ＋４０μｍｏｌ／Ｌ和２０ｎｍｏｌ／Ｌ＋
８０μｍｏｌ／Ｌ。每组均设３个复孔，并设置调零孔（只含
相应培养液，无细胞）和对照孔（只含细胞、培养液）。
待单一药物以及联合药物组作用２４ｈ后，每孔加入
ＭＴＴ（５ｍｇ／ｍＬ）１５μＬ／孔，继续培养４ｈ，小心吸弃培
养液和 ＭＴＴ 溶液，加入 ＤＭＳＯ　１５０μＬ／孔，振荡
１０ｍｉｎ使充分溶解显色。用全波长酶标仪测定吸光度
值（Ａ４９０），按下式计算细胞生长抑制率。
生长抑制率（％）＝（１－
药物组Ａ４９０
对照组Ａ４９０
）×１００％
实验重复３次，按金正均法［２］的概率和法计算 Ｑ
值，并判断两药的协同作用。
Ｑ（％）＝ Ｅａ＋ｂＥａ＋Ｅｂ－Ｅａ×Ｅｂ
×１００％
其中Ｅａ＋ｂ为联合处理组的抑制率，Ｅａ、Ｅｂ 分别为
ａ药和ｂ药单独处理的抑制率。若 Ｑ 值在０．８５～
１．１５为两药合用单纯相加；若 Ｑ＞１．１５为有协同作
用；若Ｑ＜０．８５表示两药合用有拮抗作用。
·９９９·中华肿瘤防治杂志２０１５年７月第２２卷第１３期　　ＣＨＩＮ　Ｊ　ＣＡＮＣＥＲ　ＰＲＥＶ　ＴＲＥＡＴ，Ｊｕｌｙ　２０１５，Ｖｏｌ．２２　Ｎｏ．１３
１．５　细胞凋亡检测
选取Ｑ＞１．１５即 ＭＫ２２０６　２０ｎｍｏｌ／Ｌ，芒柄花素
８０μｍｏｌ／Ｌ单用或联合２４ｈ作为药物实验组。收集
各组药物处理后细胞，１　５００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ（ｒ＝
１０ｃｍ），弃上清，ＰＢＳ洗涤２遍。再次１　５００ｒ／ｍｉｎ离
心５ｍｉｎ后收集细胞，缓慢加入预冷的７０％乙醇溶
液，１　５００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ（ｒ＝１０ｃｍ）后，ＰＢＳ洗涤
２遍，收集细胞，加入１０μＬ　ＡｎｎｅｘｉｎⅤ－ＦＩＴＣ避光染
色３０ｍｉｎ，然后上流式细胞仪检测细胞凋亡率。
１．６　凋亡相关基因表达检测
采用 Ｔｒｉｚｏｌ法提取各实验组总 ＲＮＡ（ＭＫ２２０６
２０ｎｍｏｌ／Ｌ，芒柄花素 ８０μｍｏｌ／Ｌ，ＭＫ２２０６＋芒柄花
素），分光光度法测定其纯度及浓度。用反转录试剂盒
将各组细胞总ＲＮＡ反转录，生成ｃＤＮＡ，进一步用Ｂｃｌ－２
及Ｂａｘ引物及内参ＧＡＰＤＨ引物扩增（表１）。ＰＣＲ结果
由Ｒｏｔｏｒ－Ｇｅｎｅ　６软件分析，确定各反应样本的Ｃｔ值，采
用相对定量的２－ΔΔＣｔ法计算目的基因的相对表达量，分
析各样本之间Ｂｃｌ－２及Ｂａｘ基因的表达差异。
表１　实时荧光定量ＰＣＲ所用引物及相关参数
基因 引物序列
产物大小
（ｂｐ）
Ｂｃｌ－２
上游 ５′－ＡＡＣＡＴＣＧＣＣＣＴＧＴＧＧＡＴＧＡＣ－３′
下游 ５′－ＡＧＡＧＴＣＴＴＣＡＧＡＧＡＣＡＧＣＣＡＧＧＡＧ－３′
１４６
Ｂａｘ
上游 ５′－ＡＧＡＴＧＴＧＧＴＣＴＡＴＡＡＴＧＣＧＴＴＴＴＣＣ－３′
下游 ５′－ＣＡＧＡＡＧＧＣＡＣＴＡＡＴＣＡＡＧＴＣＡＡＧＧＴ－３′
１１８
ＧＡＰＤＨ
上游 ５′－ＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＣ－３′
下游 ５′－ＴＧＧＴＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＧＴＧＧＡ－３′
１３８
１．７　Ａｋｔ磷酸化相关蛋白表达检测
提取各实验组蛋白（ＭＫ２２０６　２０ｎｍｏｌ／Ｌ，芒柄花素
８０μｍｏｌ／Ｌ，ＭＫ２２０６＋芒柄花素）并定量样本后，将等量
的蛋白样品（３０μｇ）加入聚丙烯酰胺凝胶，常规电泳、转
膜。用含５％脱脂牛奶的ＴＢＳＴ封闭硝酸纤维素膜，室
温６０ｍｉｎ，分别加入１∶８　０００稀释的Ｔ－Ａｋｔ、ｐ－Ａｋｔ抗
体及１∶５　０００稀释的 ＧＡＰＤＨ（内参照）抗体。置于
４℃摇床过夜，用含０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０的ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）洗
３次，５ｍｉｎ／次，加入１∶８　０００稀释的二抗室温培育１ｈ，
ＰＢＳＴ洗涤３次，加入化学底物发光液结合显影、定影和
扫描。用Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ　Ｉｍａｇｅ　Ｊ软件分析各条带灰度值。
以目的条带灰度值／ＧＡＰＤＨ条带灰度值的比值表示目
的条带的相对表达量。
相对灰度值＝
目的蛋白灰度值
ＧＡＰＤＨ灰度值
１．８　统计学方法
所有实验均平行重复３次，数据以ｘ－±ｓ表示。应
用ＳＰＳＳ　１６．０软件，同一药物不同浓度组采用参数检验
和非参数检验同时进行分析，结果结论一致，故采用参
数法中的单因素方差分析进行检验；多组间的两两比较
采用Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ方法检验；流式凋亡、ＰＣＲ及蛋白质印
迹法检测结果采用析因设计。检验水准α＝０．０５。
２　结果
２．１　单独及联合用药对不同亚型乳腺癌细胞的作用
图１示，ＭＫ２２０６和芒柄花素对４种乳腺癌细胞
体外有明显的抑制作用，并且抑制率呈剂量依赖关系。
表２～表４示，不同浓度的芒柄花素或 ＭＫ２２０６单用
对不同细胞增殖抑制效果不同，其中８０μｍｏｌ／Ｌ芒柄
花素和２０ｎｍｏｌ／Ｌ　ＭＫ２２０６单独使用可显著抑制４种
细胞增殖，ＭＣＦ－７细胞 ＭＫ２２０６组Ｐ＜０．０５，余各组
Ｐ值均＜０．０１。该组浓度下两药联合抑制作用显著增
加，ＭＣＦ－７细胞Ｐ＜０．０５，余各组Ｐ值均＜０．０１。采
用金正均法计算显示，ＢＴ－４７４和 ＭＤＡ－ＭＢ－２３１细胞
的 ＭＫ２２０６（２０ｎｍｏｌ／Ｌ）＋芒柄花素（８０μｍｏｌ／Ｌ）组
Ｑ＞１．１５，表明８０μｍｏｌ／Ｌ的芒柄花素及２０ｎｍｏｌ／Ｌ
的 ＭＫ２２０６联合应用对ＢＴ－４７４及 ＭＤＡ－ＭＢ－２３１细
胞增殖抑制率具有显著的协同作用。
注：Ａ．ＭＫ２２０６；Ｂ．芒柄花素
图１　 ＭＴＴ法检测不同浓度ＭＫ２２０６及芒柄花素对
不同亚型乳腺癌细胞的增殖抑制率的影响
·０００１· 盛佳钰，等　芒柄花素联合 ＭＫ２２０６对不同亚型乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响
表２　４０μｍｏｌ／Ｌ芒柄花素联合１０ｎｍｏｌ／Ｌ　ＭＫ２２０６对不同亚型乳腺癌细胞的增殖抑制作用
组别
ＭＣＦ－７
抑制率（％） Ｐ值
ＢＴ－４７４
抑制率（％） Ｐ值
ＳＫ－ＢＲ－３
抑制率（％） Ｐ值
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１
抑制率（％） Ｐ值
芒柄花素组（４０μｍｏｌ／Ｌ） ２６．４７±０．６９ ＜０．０１　 ６．１３±３．７４ ＜０．０１　 ２２．１８±２．０３ ＞０．０５　 １７．５２±２．４５ ＜０．０５
ＭＫ２２０６组（１０ｎｍｏｌ／Ｌ） ３６．２９±１．７２ ＞０．０５　 ３９．４３±１．５３ ＞０．０５　 ２９．２５±１．４４ ＞０．０５　 ２３．７５±２．９５ ＜０．０５
联合用药组 ３９．４２±２．０６　 ４１．３３±１．４１　 ３３．９５±１．８６　 ３２．４８±３．６７
表３　４０μｍｏｌ／Ｌ芒柄花素联合２０ｎｍｏｌ／Ｌ　ＭＫ２２０６对不同亚型乳腺癌细胞的增殖抑制作用
组别
ＭＣＦ－７
抑制率（％） Ｐ值
ＢＴ－４７４
抑制率（％） Ｐ值
ＳＫ－ＢＲ－３
抑制率（％） Ｐ值
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１
抑制率（％） Ｐ值
芒柄花素组（４０μｍｏｌ／Ｌ） ２６．４７±０．６９ ＜０．０１　 ６．１３±３．７４ ＜０．０１　 ２２．１８±２．０３ ＜０．０１　 １７．５２±２．４５ ＜０．０１
ＭＫ２２０６组（２０ｎｍｏｌ／Ｌ） ４９．６３±２．２７ ＜０．０１　 ４８．７５±２．３５ ＞０．０５　 ４３．８２±１．５３ ＜０．０１　 ３２．６３±１．９２ ＜０．０１
联合用药组 ５２．９９±１．３３　 ５３．１５±２．４３　 ５６．２７±２．２６　 ４７．６９±１．２５
表４　８０μｍｏｌ／Ｌ芒柄花素联合２０ｎｍｏｌ／Ｌ　ＭＫ２２０６对不同亚型乳腺癌细胞的增殖抑制作用
组别
ＭＣＦ－７
抑制率（％） Ｐ值
ＢＴ－４７４
抑制率（％） Ｐ值
ＳＫ－ＢＲ－３
抑制率（％） Ｐ值
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１
抑制率（％） Ｐ值
芒柄花素组（８０μｍｏｌ／Ｌ） ３３．３０±２．４１ ＜０．０１　 １４．８２±２．０２ ＜０．０１　 ３４．７２±１．１９ ＜０．０１　 ２３．２９±１．７８ ＜０．０１
ＭＫ２２０６组（２０ｎｍｏｌ／Ｌ） ４９．６３±２．２７ ＜０．０５　 ４８．７５±２．３５ ＜０．０１　 ４３．８２±１．５３ ＜０．０１　 ３２．６３±１．９２ ＜０．０１
联合用药组 ５８．１２±２．１７　 ６３．９１±２．８７　 ６５．５１±２．６７　 ５８．８９±１．３３
２．２　ＭＫ２２０６对不同亚型乳腺癌细胞凋亡的作用
图２示，各组细胞作用２４ｈ后，ＭＣＦ－７细胞的芒
柄花素组凋亡率为（４．４６±０．５２）％，ＢＴ－４７４为（４．１±
０．６０）％，ＳＫ－ＢＲ－３为（４．５５±０．４４）％，ＭＤＡ－ＭＢ－２３１
为（３．３７±０．７０）％；ＭＫ２２０６ 组分别为 （８．３３±
０．６６）％、（７．６９±０．６０）％、（５．８１±０．７３）％和（５．８１±
０．６０）％；联合用药组分别为 （１２．４８±０．６０）％、
（１３．３２±０．７０）％、（１３．９７±０．７０）％ 和（１９．３０±
０．５２）％。细胞凋亡率均较对照组增加，两药单用主效
应可显著促进４种细胞凋亡，Ｐ＜０．０１；芒柄花素和
ＭＫ２２０６交互作用对ＢＴ４７４、ＳＫ－ＢＲ－３及 ＭＤＡ－ＭＢ－２３１
细胞凋亡率影响差异有统计学意义，Ｐ＜０．０１。表明
两种药物合用具有协同促进上述３种细胞凋亡的
作用。
２．３　Ｂａｘ和Ｂｃｌ－２基因表达
图３示，与对照组相比，４种细胞用药组的Ｂａｘ
ｍＲＮＡ表达水平均增高，Ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ 表达水平降
低。两药单用主效应可提高４种细胞Ｂａｘ　ｍＲＮＡ表
达水平，Ｐ＜０．０１；并降低 Ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ 表达水平，
ＭＣＦ－７细胞芒柄花素组Ｐ＜０．０５，余各组Ｐ 值均＜
０．０１。两药交互作用对ＢＴ４７４和 ＭＤＡ－ＭＢ－２３１细胞
的Ｂａｘ　ｍＲＮＡ 表达水平差异有统计学意义，Ｐ＜
０．０１；ＢＴ４７４、ＳＫ－ＢＲ－３和 ＭＤＡ－ＭＢ－２３１细胞的Ｂｃｌ－２
ｍＲＮＡ表达水平差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１），具有
显著协同作用。
图２　ＦＣＭ法检测芒柄花素联合ＭＫ２２０６对不同亚型
乳腺癌细胞凋亡的影响
２．４　ｐ－Ａｋｔ和ｔ－Ａｋｔ蛋白表达
蛋白质印迹法检测结果显示，与对照组相比，给药
组ｔ－Ａｋｔ蛋白表达变化不明显，而ｐ－Ａｋｔ蛋白表达均有
所下降。ＭＣＦ－７、ＢＴ－４７４、ＳＫ－ＢＲ－３和 ＭＤＡ－ＭＢ－２３１细
胞芒柄花素组ｐ－Ａｋｔ蛋白表达量分别为０．９１±０．０２、
·１００１·中华肿瘤防治杂志２０１５年７月第２２卷第１３期　　ＣＨＩＮ　Ｊ　ＣＡＮＣＥＲ　ＰＲＥＶ　ＴＲＥＡＴ，Ｊｕｌｙ　２０１５，Ｖｏｌ．２２　Ｎｏ．１３
０．６９±０．０３、０．８７±０．０１和１．００±０．０２；ＭＫ２２０６组
分别为０．６８±０．０３、０．５５±０．０４、０．６９±０．０３和
０．７７±０．０２；联合用药组分别为０．６２±０．０２、０．２８±
０．０５、０．４７±０．０４和０．４５±０．０３。两药单用主效应可
显著降低４种细胞ｐ－Ａｋｔ蛋白表达，Ｐ＜０．０１；芒柄花
素和 ＭＫ２２０６交互作用对ＳＫ－ＢＲ－３和 ＭＤＡ－ＭＢ－２３１
细胞ｐ－Ａｋｔ蛋白表达影响极其显著，Ｐ＜０．０１。图４
示，两种药物合用具有协同降低上述两种细胞ｐ－Ａｋｔ
蛋白表达的作用。
注：Ａ．Ｂａｘ基因表达；Ｂ．Ｂｃｌ－２基因表达
图３　时实荧光定量ＰＣＲ法检测芒柄花素联合ＭＫ２２０６
对不同亚型乳腺癌细胞凋亡相关基因表达的影响
图４　蛋白质印迹法检测芒柄花素联合ＭＫ２２０６对不同亚型
乳腺癌细胞的ｐ－Ａｋｔ和ｔ－Ａｋｔ蛋白表达的影响
３　讨论
ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号通路是继Ｒａｓ通路以来发现的另
一个与肿瘤发生密切相关的信号通路［３］。而 Ａｋｔ是
已知的唯一与恶性转化相关的ＰＩ３Ｋ下游靶点，它通
过与下游效应分子结合，影响其下游的多种效应分子
如Ｂｃｌ－２和Ｂｃｌ－Ｘ１等而发挥抗凋亡作用，最终导致在
肿瘤细胞凋亡抑制，肿瘤发生［４－５］。ＭＫ２２０６是一种新
型的高效、高选择性 Ａｋｔ抑制剂，能通过破坏ＰＤＫ１
依赖的Ａｋｔ的磷酸化位点，对多种肿瘤细胞表现出抗
肿瘤活性，并已通过实体瘤患者的一期临床实验［６－９］。
针对单靶点分子靶向药物治疗实体瘤的客观有效率偏
低，易引起药物单个接触点的突变，导致耐药［１０］。近
年来将分子靶向药物与其他抗肿瘤药物进行联合应
用，成为了肿瘤研究的新方向［１１］。芒柄花素是黄芪、
鸡血藤等中药中含有的异黄酮类化合物，本课题组前
期研究证实芒柄花素具有一定的抗肿瘤作用，对不同
亚型乳腺癌细胞均具有抑制作用，而该作用的产生与
其下调乳腺癌细胞Ａｋｔ磷酸化的水平密切相关［１２－１３］。
因此，本次实验将芒柄花素与 ＭＫ２２０６联合应用于乳
·２００１· 盛佳钰，等　芒柄花素联合 ＭＫ２２０６对不同亚型乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响
腺癌细胞，探讨联合用药对不同亚型乳腺癌细胞增殖、
凋亡的影响。
　　 本研究结果显示，ＭＫ２２０６联合芒柄花素与两药
单独处理相比较，对乳腺癌细胞的增殖抑制作用更为
明显，这种抑制作用表现为良好的剂量依赖性，且金正
均［２］法 显 示，ＢＴ－４７４ 及 ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ 细 胞 的
ＭＫ２２０６（２０ｎｍｏｌ／Ｌ）＋芒柄花素（８０μｍｏｌ／Ｌ）联合用
药组Ｑ＞１．１５，表现出协同增效作用。流式细胞术检
测结 果 显 示，ＭＫ２２０６（２０ｎｍｏｌ／Ｌ）及 芒 柄 花 素
（８０μｍｏｌ／Ｌ）能提高不同分子亚型乳腺癌细胞的凋亡
率，ＢＴ－４７４、ＳＫ－ＢＲ－３和 ＭＤＡ－ＭＢ－２３１细胞的联合给
药组是具有显著的协同作用。提示芒柄花素联合
ＭＫ２２０６作用于乳腺癌细胞，能够更好地发挥两者的
协同作用，起到抑制增殖、诱导凋亡的作用。
Ｂｃｌ－２是Ａｋｔ下游效应分子中公认的抑制凋亡的
原癌基因，在肿瘤的发生发展中发挥抗凋亡作用［１４］。
为了探讨芒柄花素联合 ＭＫ２２０６治疗乳腺癌的分子
机制，本研究采用实时荧光定量ＰＣＲ检测凋亡相关基
因的变化。结果显示，两药单独处理组均能引起Ｂｃｌ－２
基因的上调及Ｂａｘ基因的下调，而联合处理组此调节
作用更显著。蛋白质印迹法检测 ＭＫ２２０６及芒柄花
素作用后乳腺癌细胞的ｔ－Ａｋｔ和ｐ－Ａｋｔ蛋白表达变
化，结果显示，４种细胞ｔ－Ａｋｔ蛋白表达水平无明显改
变，说明非磷酸化 Ａｋｔ不具有生物学活性。但是，给
药后４种乳腺癌细胞的ｐ－Ａｋｔ蛋白表达均有所下降，
联合用药组蛋白表达较单独用药组低。
上述研究结果提示，４种不同亚型乳腺癌细胞均
存在ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ信号通路的异常活化，芒柄花素可以
通过抑制 Ａｋｔ的磷酸化来促进 ＭＫ２２０６对该通路的
抑制作用。不同亚型乳腺癌细胞对芒柄花素及
ＭＫ２２０６的作用不尽相同，其中三阴性 ＭＤＡ－ＭＢ－２３１
细胞和 ＨＥＲ－２过表达型的ＳＫ－ＢＲ－３细胞疗效更显
著，符合ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ通路与乳腺癌分子亚型中基底细
胞样、ＨＥＲ－２亚型密切相关的文献表述［１５］。此外，芒
柄花素及 ＭＫ２２０６对三阴性乳腺癌细胞ＢＴ－４７４也表
现出较好的抑制效果，说明芒柄花素抗肿瘤的内在机
制很复杂，而Ｂｃｌ－２及Ｂａｘ可能只是其中的一个方面。
本研究证明芒柄花素和 ＭＫ２２０６能通过降低 Ａｋｔ磷
酸化水平阻断ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ通路，引起Ｂｃｌ－２及Ｂａｘ基
因变化，从而起到抗肿瘤的作用，但是否存在其他凋亡
途径，仍需要进一步探讨。
参考文献
［１］ Ｗｉｃｋｅｎｄｅｎ　ＪＡ，Ｗａｓｔｏｎ　ＣＪ．Ｋｅｙ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｎｏｄｅｓ　ｉｎ　ｍａｍｍａｒｙ
ｇｌａｎｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｃａｎｃｅｒ．Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ　ｏｆ　ＰＩ３ｋｉ－
ｎａｓｅ　ｉｎ　ｍａｍｍａｒｙ　ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ：ａｐｌａｙ　ｉｎ　３Ａｋｔｓ［Ｊ］．Ｂｒｅａｓｔ　Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ，２０１０，１２（２）：２０２－２０４．
［２］　金正均．合并用药中的相加［Ｊ］．中国药理学报，１９８０，１（２）：７０－
７６．
［３］　王亚力，李湘奇，党相国，等．ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ信号通路相关蛋白表达
与乳腺癌淋巴转移相关性分析［Ｊ］．中华肿瘤防治杂志，２０１３，
２０（８）：６００－６０３．
［４］　赵婧，屈艺，母得志．ＡＫＴ与细胞线粒体凋亡途径［Ｊ］．生命的化
学，２０１０，３０（４）：５２８－５３１．
［５］　Ｄｅ　Ｍａｒｃｏ　Ｃ，Ｒｉｎａｌｄｏ　Ｎ，Ｂｒｕｎｉ　Ｐ，ｅｔ　ａｌ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｌｔｅｒａ－
ｔｉｏｎｓ　ｗｉｔｈｉｎ　ｔｈｅ　ＰＩ３Ｋｐａｔｈｗａｙ　ａｒｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ　ｆｏｒ　ＡＫＴ　ａｃｔｉｖａ－
ｔｉｏｎ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｏｖａｒｉａｎ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ［Ｊ／ＣＤ］．ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ，２０１３，
８（２）：ｅ５５３６２．
［６］　Ｍｏｌｉｆｅ　ＬＲ，Ｙａｎ　Ｌ，Ｖｉｔｆｅｌｌ－Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ　Ｊ，ｅｔ　ａｌ．Ｐｈａｓｅ　１ｔｒｉａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ
ｏｒａｌ　ＡＫＴ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ＭＫ－２２０６ｐｌｕｓ　ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ／ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ，ｄｏ－
ｃｅｔａｘｅｌ，ｏｒ　ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ａｄｖａｎｃｅｄ　ｓｏｌｉｄ　ｔｕｍｏｒｓ［Ｊ］．Ｊ
Ｈｅｍａｔｏｌ　Ｏｎｃｏｌ，２０１４，７（１）：１．
［７］　Ａｑａｒｗａｌ　Ｅ，Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ　Ａ，Ｌｅｉｐｈｒａｋｐａｍ　ＰＤ，ｅｔ　ａｌ．Ａｋｔ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
ＭＫ－２２０６ｐｒｏｍｏｔｅｓ　ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｃｅｌ　ｄｅａｔｈ　ｂｙ　ｍｏｄｕｌａ－
ｔｉｏｎ　ｏｆ　ＡＩＦ　ａｎｄ　Ｅｚｒｉｎ　ｉｎ　ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．ＢＭＣ　Ｃａｎｃｅｒ，
２０１４，１４：１４５．
［８］　Ｗｉｌｓｏｎ　ＪＭ，Ｋｕｎｎｉｍａｌａｉｙａａｎ　Ｓ，Ｇａｍｂｌｉｎ　ＴＣ，ｅｔ　ａｌ．ＭＫ２２０６ｉｎ－
ｈｉｂｉｔｓ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｕｌａｒ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｖｉａ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ
ｏｆ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｃｅｌ　ｃｙｃｌｅ　ａｒｒｅｓｔ［Ｊ］．Ｊ　Ｓｕｒｇ　Ｒｅｓ，２０１４，１９１（２）：
２８０－２８５．
［９］　Ｌｉｎｄｓｌｅｙ　ＣＷ．Ｔｈｅ　Ａｋｔ／ＰＫＢ　ｆａｍｉｌｙ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅｓ：ａ　ｒｅｖｉｅｗ
ｏｆ　ｓｍａｌ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｔｏｗａｒｄｓ　ｔａｒｇｅｔ　ｖａｌｉｄａ－
ｔｉｏｎ：ａ　２００９ｕｐｄａｔｅ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ　Ｔｏｐ　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ，２０１０，１０（４）：４５８－
４７７．
［１０］　Ｚｈｅｎｇ　ＳＴ，Ｆｌａｖｅｌ　ＡＲ．Ｄｉｖｉｎａｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｓｕｒｐｒｉｓｅｓ：ｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙ－
ｓｉｓ　ｏｆ　ｃａｓｐａｓｅｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｅｘｐ　Ｃｅｌ　Ｒｅｓ，２０００，２５６（１）：６７－
７３．
［１１］　Ｌｉｎ　ＹＨ，Ｃｈｅｎ　ＢＹ，Ｌａｉ　ＷＴ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ　Ａｋｔ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ＭＫ－２２０６
ｅｎｈａｎｃｅｓ　ｔｈｅ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ（Ｔａｘｏｌ）ａｎｄ　ｃｉｓｐｌａｔｉｎ　ｉｎ　ｏ－
ｖａｒｉａｎ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｓ［Ｊ］．Ｎａｕｎｙｎ　Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｓ　Ａｒｃｈ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，
２０１５，３８８（１）：１９－３１．
［１２］　周瑞娟，陈红风，叶媚娜，等．芒柄花素对不同亚型乳腺癌细胞增
殖及细胞周期的影响［Ｊ］．肿瘤防治研究，２０１２，３９（９）：１０５１－
１０５５．
［１３］　Ｚｈｏｕ　Ｒ，Ｘｕ　Ｌ，Ｙｅ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．Ｆｏｒｍｏｎｏｎｅｔｉｎ　ｉｎｈｉｂｉｔｓ　ｍｉｇｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ
ｉｎｖａｓｉｏｎ　ｏｆ　ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ａｎｄ　４Ｔ１ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｓ　ｂｙ　ｓｕｐ－
ｐｒｅｓｓｉｎｇ　ＭＭＰ－２ａｎｄ　ＭＭＰ－９ｔｈｒｏｕｇｈ　ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ
ｐａｔｈｗａｙｓ［Ｊ］．Ｈｏｒｍ　Ｍｅｔａｂ　Ｒｅｓ，２０１４，４６（１１）：７５３－７６０．
［１４］　马娜，郭瑞珍，阮媛，等．ＰＩ３Ｋ－ＡＫＴ－Ｂｃｌ－２抗凋亡途径与瘢痕癌
癌细胞凋亡相关性探讨［Ｊ］．中华肿瘤防治杂志，２０１４，２１（８）：
５９９－６０４．
［１５］　Ｌóｐｅｚ－Ｋｎｏｗｌｅｓ　Ｅ，Ｏ’Ｔｏｏｌｅ　ＳＡ，ＭｃＮｅｉｌ　ＣＭ，ｅｔ　ａｌ．ＰＩ３Ｋｐａｔｈｗａｙ
ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｉｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｂａｓａｌ－ｌｉｋｅ　ｐｈｅ－
ｎｏｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｃａｎｃｅｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｏｒｔａｌｉｔｙ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ，２０１０，
１２６（５）：１１２１－１１３１．
收稿日期：２０１５－０３－２７　修回日期：２０１５－０５－１７
（编辑：杨靖）
·３００１·中华肿瘤防治杂志２０１５年７月第２２卷第１３期　　ＣＨＩＮ　Ｊ　ＣＡＮＣＥＲ　ＰＲＥＶ　ＴＲＥＡＴ，Ｊｕｌｙ　２０１５，Ｖｏｌ．２２　Ｎｏ．１３