全 文 ：小大黄对 ox-LDL诱导血管平滑肌细胞增殖的影响
戴晓明　吴慧平　陈　亮　陈文垲
(南京中医药大学基础医学院·南京 210046)
摘　要　目的:观察小大黄对氧化修饰型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导血管平滑肌细胞(SMC)增殖的影
响。方法:采用体外培养的牛主动脉平滑肌细胞为模型 , ox-LDL诱导 SMC 增殖。实验分为对照组 、ox-
LDL组和用药组(ox-LDL+不同剂量小大黄),应用 MTT 法 、流式细胞仪分别测定细胞数量和细胞周期 ,
用硫代巴比妥酸比色法测定细胞培养液中丙二醛(MDA)的水平。结果:小大黄能明显降低细胞培养液中
MDA 的水平 , MTT检测显示用药组比 ox-LDL组 OD值降低 ,并呈浓度依赖性。流式细胞仪检测表明 ,用
药组(S+G2M)期细胞百分率降低。结论:小大黄能抑制 ox-LDL诱导的 SMC增殖 ,并具有抗脂质过氧化
作用。
主题词　小大黄 药理学　血管平滑肌细胞 药物作用　体外研究
　　近年来研究表明 ,动脉粥样硬化(AS)病变的发生 、发展
与氧化修饰 LDL密切相关 , 而脂质被细胞摄取 、蓄积形成泡
沫细胞是血管壁的早期病变 , AS 斑块形成的重要环节则是
平滑肌细胞增殖 , 三者之间互相关联。能够干预 LDL的氧
化修饰过程 ,减少细胞内脂质的含量 、抑制平滑肌细胞增殖
的药物对于AS 病变的干预具有良好作用。大黄是一味重要
的藏药 ,青藏高原分布大黄属植物 28 种 ,其中藏药应用的有
21 种。对于大黄的研究很多 , 现代医学证明:大黄有广谱抗
菌 、抗病毒 、抗病原微生物的功能 , 具有保肝利胆 , 降血脂的
药理作用 ,而对同属大黄属的植物小大黄(PSL)研究却甚少。
小大黄(藏药名曲玛枚), 又名西伯利亚蓼(Polygonum Sibiri-
cum Laxm , PSL), 其在AS 病变的发生 、发展中作用如何 , 国内
外文献至今尚未见报道。本文将小大黄作用于培养的血管
平滑肌细胞 ,观察其对经 ox-LDL刺激增殖的血管平滑肌细
胞的影响 ,并对其作用机理进行初步的探讨。以期为藏药的
开发和利用提供实验依据。
1　实验材料　新生小牛血清:杭州四季青公司。 DEME 培
养基:Gibco 公司。胰蛋白酶 、二甲基亚枫 DMSO:Sigma公司。
噻唑蓝(MTT):华美公司。丙二醛测试盒:南京建成生物工
程研究所。其他试剂均为国产分析纯。 实验培养瓶 、96 孔 、
6 孔培养板:丹麦 Nunclon公司产品。超净工作台:苏州净化
设备厂生产。CO2 培养箱:德国 Heraecus 产品。倒置相差显
微镜:日本 Olympus公司。酶联免疫测定仪(CliniBio 128):奥
地利 Clini Bio生产。 FACS Calibur型流式细胞仪:美国 BD公
司产品。 L8 -80 超速离心机和 Ti80 转头:Beckman 公司产
品。 RF-540荧光分光光度计:Shimadzu公司生产。小大黄:
青海医学院王索安教授惠赠。
2　实验方法
2.1　小大黄(PSL)制剂的制备　PSL为蒸馏水煎煮的浓缩
液 ,主要参照黄海茵 、郝淑清等方法进行[ 2 ,3] , 并作了改进 , 煎
煮时间 10 分钟 , 提取 3 次 , 浓缩液用无菌纱布及器皿过滤 ,
高速离心5000r/min ,持续 10分钟 , 取上清液 ,滤纸过滤 , 反复
3次 , 实验前用培养基液调渗透压 ,用 10%的碳酸氢钠液调
pH至 7.2～ 7.4 ,先后经 0.45μm 和 0.2μm 微孔滤膜滤菌 , 制
成供体外细胞培养用的中药原液 , 加药时在培养基液中稀释
到所需浓度。
2.2　人血浆低密度脂蛋白制备　新鲜健康人空腹血浆 , 用
Beckman 公司 L8-80 型超速离心机以序列超速离心法分离 ,
整个操作过程中 , 密度液中均加入 0.05%的二乙胺四乙酸
(EDTA),以防止脂蛋白氧化 , 同时加入 0.33%庆大霉素用于
抗菌。最终得到密度为 1.019 ～ 1.063kg L 的 LDL 组分。于
4℃下以 0.01mol/ L 磷酸盐缓冲液充分透析 , 蛋白测定用
Lowry s 法进行。
2.3　人血浆 LDL氧化修饰　按铜氧化法制备 ox-LDL。在
新配制的 LDL溶液中加入 1mmol氯化铜溶液 , 使 Cu2+的最
终浓度为 10μmol/ L , 置 37℃孵箱 4 小时后 , 加入 2.7mmol/ L
EDTA 终止氧化反应。氧化修饰程度的鉴定:①硫代巴比妥
酸反应物质测定:用硫代巴比妥酸反应物质(TBARS)来表示
脂质过氧化代谢产物丙二醛(MDA)的含量。在酸性条件下。
过氧化脂质的分解产物(MDA)与 TBA 反应后 , 生成红色荧
光物质 ,用荧光分光光度计在 Ex515nm 和 Em553nm 处测定
荧光强度 ,标准物质为 1 , 1 , 3 , 3-四甲氧基丙烷。 TBARS 值
(20.3±3.5)。 ②相对电泳迁移率(REM)测定:pH8.6 的巴比
妥缓冲液中进行琼脂糖凝胶电泳。 天然未修饰的 LDL作为
基准对照(REM:1.0), ox-LDL与 LDL.的实际迁移距离之比
即为 ox-LDL的 REM。经琼脂糖凝胶电泳 90v.2h , ox-LDL
电泳迁移率为 2.4 , ox-LDL终浓度蛋白含量 200mg/ L。
2.4　各用药组非毒性作用的依据　相差显微镜下观察对照
组与加入不同剂量药物的 VSMC , VSMC 形态正常 , 呈梭形 、
三角形或不规则形状 , 未见细胞收缩漂浮与死亡。
2.5　平滑肌细胞培养　取胎牛胸主动脉 , 剖开动脉 , 去除内
皮和外层结缔组织 , 将中层平滑肌剪成 1mm3 组织块 , 以贴
块法均匀平铺于培养瓶底 , 加入 20%新生小牛血清 DMFM
培养液 ,培养瓶底朝上组织块不浸入培养液 , 置于 37℃, 5%
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CO2 培养箱中 , 3～ 4 小时后 ,轻轻翻转培养瓶使组织块完全
浸入培养液 ,继续静置于 37℃, 5%CO2 培养箱中培养。当细
胞生长融合形成单层后 , 用含 0.125%胰蛋白酶进行消化传
代。实验用 3～ 10代的细胞。
2.6　MTT测定　血管平滑肌细胞按 2×104 个/ml密度接种
于 96孔板上 , 10%新生小牛血清的 DEME 培养基 , 37℃, 5%
CO2 培养箱中静置孵育 48 小时 ,换 0.1%血清培养液继续孵
育 24小时后 ,随机分为对照 , ox-LDL , ox-LDL+不同剂量
小大黄(终浓度 0.2mg/ml , 0.4mg ml , 0.8mg/ml)组。 除对照
组外其余各组加入 ox-LDL 10μl/孔 , 继续培养 24小时后 , 每
孔加入噻唑蓝(MTT)溶液 20μl(5g L)孵育 4 小时后 , 终止培
养。吸弃孔内上清液 , 每孔加入二甲基亚枫(DMSO)100μl ,
490nm 波长在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值。并计
算药物对细胞的生长抑制率(IR%)。
2.7　MDA 测定　收取条件培养液离心 , 测上清液丙二醛含
量(按试剂盒方法进行)。
2.8　细胞周期的测定　血管平滑肌细胞按 2×106 个/ ml密
度按种于 6 孔板上 , 用含 10%小牛血清的 DMEM 培养液
37℃, 5%CO2 培养箱中静置培养 24 小时 ,继而更换培养液为
含0.1%小牛血清的 DMEM 培养液继续培养 24小时后 , 随机
分为对照组 , ox-LDL , 小大黄组。除对照组外各组加入 ox-
LDL50μl/孔 ,小大黄组加入 PSL0.4mg/ ml , 继续培养 24 小时
后 ,经碘化丙锭染色 , 用流式细胞仪进行细胞周期分析 , 并计
算细胞分裂指数。分裂增殖指数计算公式为:分裂增殖指数
=(S+G2M)/(G0G1+S+G2M)×100%
2.9　统计学处理　采用 SPSS11.5 软件 , 实验数据以均数±
标准差表示 ,组间差异采用方差分析的方法处理。
3　结果
3.1　小大黄对 ox-LDL作用下 VSMC 增殖的影响　见表 1。
　表 1　小大黄对 ox-LDL作用下 VSMC增殖的影响(n=6)
组　别 剂量(mg ml)
VSMC增殖
OD(x±s) 　IR(%)
空白组 — 0.094±0.0081＊
ox-LDL — 0.156±0.0022 —
ox-LDL+PSL 0.2 0.131±0.0023＊ 16.0
ox-LDL+PSL 0.4 0.115±0.0021＊＊ 26.28
ox-LDL+PSL 0.8 0.101±0.0100＊＊ 35.25
　与 ox-LDL组相比＊P<0.05 , ＊＊P<0.01(下同)
3.2　小大黄对 ox-LDL作用下VSMC 条件培养液MDA浓度
的影响　见表 2。
表 2 各组条件培养液MDA 浓度变化(n=6 , x±s)
组　别 剂量(mg ml) MDA(nmol L)
空白组 — 1.37±0.16＊＊
ox-LDL — 3.23±0.22
ox-LDL+PSL 0.2 2.37±0.17＊
ox-LDL+PSL 0.4 1.99±0.27＊＊
ox-LDL+PSL 0.8 1.66±0.31＊＊
3.3　小大黄对 ox-LDL作用下 VSMC 细胞周期的影响　流
式细胞仪检测结果显示 , 在正常对照组约有 18.75%处于(S
+G2M)期 , ox-LDL组(S+G2M)期为 42.62%,小大黄+ox-
LDL组 23.92%处于(S+G2M)期。 细胞分裂增殖指数分别
为对照组 18.75%、ox-LDL 组 42.62%, 两组相比 ox-LDL
组细胞分裂增殖指数明显增高 , 小大黄+ox-LDL 组 23.
92%, 与 ox-LDL组比细胞分裂增殖指数明显降低。
4　讨论　平滑肌细胞增殖是动脉粥样硬化(AS)斑块形成过
程中的重要环节 , 许多研究资料显示 ox-LDL可诱导平滑肌
细胞增殖 ,平滑肌细胞受(ox-LDL)作用被活化 ,可释放多种
细胞因子如血小板源性生长因子(PDGF)、成纤维生长因子
(FCF)、表皮生长因子(EGF)以及 LDL的组成成分溶血卵磷
脂胆碱刺激平滑肌细胞产生成纤维细胞生长因子 , 促进平滑
肌细胞增殖 , ox-LDL可能通过细胞内信号转导通路激活 NF
-κB ,增强作为多种细胞受到刺激分裂时的一种早期即刻反
应基因 c-myc的基因表达[4] 。如有药物能阻断 ox-LDL诱
导平滑肌增殖这一环节 ,将有助于延缓 AS 的发生发展。本
实验结果显示 ox-LDL 组 OD 值与正常对照组相比显著升
高(P<0.01), 表明一定浓度的 ox-LDL可刺激平滑肌细胞
增殖 ,而用药组 OD值与 ox-LDL 组 OD 值相比明显下降(P
<0.05 ～ P <0.01), 表明药物具有抑制 ox-LDL刺激 VSMC
增殖的作用 ,细胞的生长抑制率也随药物浓度增高而明显增
高 ,呈浓度依赖性。细胞周期检测结果显示小大黄对 ox-
LDL所致平滑肌细胞增殖有一定的抑制作用 , 用药后 , 细胞
分裂增殖指数较 ox-LDL组降低。
氧化应激可以成为细胞增殖的刺激信号 , 氧自由基能明
显增强血管平滑肌细胞的 sis基因表达 , 促使细胞增殖[5] ,活
化的 SMC 还释放氧自由基作用于膜脂质 , 引起脂质过氧化
反应 ,产生大量 LPO。 LPO 能刺激中膜 SMC 移入内膜增殖。
促使 AS 斑块的形成和发展。文献报道高原药用大黄水溶液
对氧自由基具有较好的清除作用[6] , 本实验显示 , 条件培养
液 ox-LDL组MDA 含量较对照组明显上升(P<0.01), 而用
药后则明显降低(P<0.05 ～ P <0.01)。说明小大黄具有抗
脂质氧化作用。
由此表明小大黄可抑制 ox-LDL 刺激的 VSMC 增殖 ,其
作用可能与其抗脂质氧化作用有关 ,在防治 AS 中小大黄应
是一种具有开发和应用价值的药用植物。
　　参考文献
1　李秀才.大黄的研究进展.中国药学杂志 ,1998;33(10):581
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中草药 , 1984;15(2):14
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cle cells growth and prdto-on-cogene expression.Circ Res , 1992;70
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6　吴生满.大黄提取物对氧自由基(O-2 )清除效果的研究.青海大
学学报 , 2006;24(4):80
(收稿:2006-11-06)
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EXPERIMENTAL STUDY ON MULTIPLE ORGANS DYSFUNCTION
INDUCED BY CEREBRAL HEMORRHAGE MAINLY TREATED
WITH JIAWEI DIDANG DECOCTION
TONG Li-yan , HOU Qun , QI Guan-shu
(The First Hospital Affiliated to Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine , Hangzhou 310006)
Objective:To observe the effect of jiawei didang decoction on multiple organs dysfunction(CH-MOD)induced by experimental cerebral
hemorrhage in rabbit.
Methods:Models of CH-MOD were built by injecting VII type collagenase into rabbit s cerebrum.All CH-MOD rabbits were divided into
high dose , low dose Chinese herb groups and control group , their vital signs including respiration(R), heart rate(HR), body temperature
(T), white blood cell(WBC), creatinkinase(CK), alanine aminotransferase(ALT), creatinine(Cr)and pathology were observed.
Results:The function of organs in high dose group was recovered guicker than that of model group , HR, R, Cr, ALT and WBC were obvi-
ously lowered in high dose group , the effective rate in high dose group was 66.7%, that of control was 18.2%, there was significant differ-
ence between these two groups(P<0.05).The pathological phenomena was improved in Chinese herb groups.
Conclusion:Jiawei didang decoction could improve many indicators of organs and promote the effective rate of experimental CH-MOD on
rabbit.
EFFECTS OF COMPOUND SOPHORA INJECTION ON SERUM IL-1β
AND TNF-αIN RATS WITH RHEUMATOID ARTHRITIS
YAO　Jian
(The First Hospital Affiliated to Harbin Medical University , Harbin 150001)
Objective:To observe the effects of compound sophora injection on serum IL-1β and TNF-αin rats with rheumatoid arthritis , and discuss
its mechanism.
Methods:Experimental model was induced by type II collagen , the inhibitory effect of injection on rats paw edema was observed , and serum
IL-1β and TNF-αlevel were determined.
Results:Compound sophora injection could inhibit rats paw edema obviously , and lowered serum IL-1β and TNF-αlevel of rheumatoid
arthritis rats.
Conclusion:Compound sophora injection could lower serum IL-1β and TNF-αlevel which maybe one of the mechanism that compound so-
phora injection effectively treated rheumatoid arthritis.
EFFECT OF POLYGONUM SIBIRICUM LAXM ON VASCULAR SMOOTH
CELLS PROLIFERATION INDUCED BY OXIDIZED LDL
Dai Xiao-ming , WU Hui-ping , CHEN Liang , et al
(Nanjing University of Traditioal Chinese Medicine , Nanjing 210046)
Objective:To observe the effect of polygonum sibiricum laxm on vascular smooth cells proliferation induced by oxidized LDL.
Methods:The subjects were divided into 5 groups:control group , ox-LDL group and three polygonum sibiricum laxm treatment groups.The
experimental models of proliferation of cultured bovine VSMC induced by oxidized-low density lipoprotein , the MDA level was determined
with thiobarbituric acid reactive substance and the number of bovine VSMC was tested with MTT and the cell cycle phase was determined by
flow cytometer.
Results:Polygonum sibiricum laxm could obviously reduce the level of MDA in the medium and inhibit the proliferation of VSMC in a concen-
tration-dependent fashion.Polygonum sibiricum laxm could reduce the(S+G2M)block in cell cy cle traverse.
Conclusion:Polygonum sibiricum laxm can inhibit the proliferation of VSMC , which maybe related to the inhibition of lipid peroxidation.