全 文 ：Vol. 34 No. 9
Sep. 2014
第 34 卷 第 9期
2014年 9月
中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
Journal of Central South University of Forestry & Technology
收稿日期：2014-02-10
基金项目：国家林业公益性行业科研专项 (201104033)；十二五国家科技支撑计划项目（2012BAC01B07-2）
作者简介：何长青（1990-），男，湖南永州人，硕士研究生，主要从事分子种群遗传学研究；E-mail：601867297@qq.com
通讯作者：徐刚标（1965-），男，安徽枞阳人，教授，主要从事植物种群遗传与林木遗传改良研究；E-mail：gangbiaoxu@163.com
观光木 Tsoongiodendron odorum系木兰科常绿
乔木，虫媒传粉 [1]，为我国珍稀孑遗树种，属国家
II级重点保护植物 [2]，对被子植物系统发育以及系
统分类方面具有重要的科学意义。在我国，观光木
零散分布于长江流域以南海拔 300～ 1 100 m 的山
地常绿阔叶林中 [3-4]，天然种群很小，为我国极小
种群野生植物 [5]。
观光木的研究主要集中在观光木的生物学特
性、生态学特征、引种繁殖、化学成分和遗传多
样性等方面 [5-6]。分子谱系地理学是揭示种群遗传
多样性、推测种群进化过程中的历史事件、探讨
近缘物种亲缘关系的重要手段，已引起国内外学
者的广泛重视。叶绿体 DNA（Chrloroplast DNA，
cpDNA）非编码序列具有较高的核苷酸置换率，
能揭示种间和种内遗传变异，多态性丰富，能提
供对系统发育研究的信息位点 [7-8]。本研究通过对
影响观光木 cpDNA标记 PCR反应体系主要因子
进行优化，筛选出适宜的非编码区序列引物，为
进一步开展濒危植物观光木分子谱系地理学研究
奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材 料
材料采集于贵州省从江县。新鲜叶片经硅胶
干燥后，带回实验室于 -70℃冰箱中保存。cpDNA
观光木 cpDNA非编码序列 PCR 反应体系优化及
引物筛选
何长青 1，王红霞 2，付 甜 1，黄芳芳 1，闫丽君 1，徐刚标 1
（1.中南林业科技大学 林木遗传育种实验室，湖南 长沙 410004；2.国家林业局 林产工业规划设计院，
北京 100010）
摘 要：利用单因素与正交设计试验，对影响观光木 cpDNA-PCR扩增的主要因子进行优化，建立了观光木
cpDNA-PCR 最适反应体系（20 μL)，为：50 ng 模板 DNA、1×PCR buffer、0.2 μmol·L-1 引物、2 mmol·L-1
MgCl2、0.3 mmol·L-1dNTP以及 1 U Taq DNA 聚合酶；筛选出了适合观光木分子谱系地理学研究的非编码区序列
引物，为 rpl32-trnL、psbJ-petA、3′rps16-5′trnK、atpI-atpH、petL-psbE。
关键词：观光木；cpDNA；非编码序列 PCR；体系优化；引物筛选
中图分类号：S759.95；Q948 文献标志码：A 文章编号：1673-923X(2014)09-0107-05
Optimization of PCR reaction system and primers screening of
cpDNA non-coding regions for Tsoongiodendron odorum
HE Chang-qing1, WANG Hong-xia2, FU Tian1, HUANG Fang-fang1, YAN Li-jun1, XU Gang-biao1
( 1. Lab. of Forest Genetics, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China;
2. Planning and Design Institute of Forest Products Industry, State Forestry Administration, Beijing 100010, China)
Abstract: With single factor orthogonal design method, the experiments were conducted to optimize the main elements affecting
cpDNA-PCR amplifi cation system for Tsoongiodendron odorum. An optimal cpDNA-PCR system for T. odorum was set up as follows:
50 ng DNA template, 1×PCR buffer, 0.3 μmol·L-1 primer, 2.5 mmol·L-1 MgCl2, 0.3 mmol·L-1 dNTP and 1 U Taq DNA polymerase in a
total volume of 20 μL. Five pairs of cpDNA non-coding regions primers which are appropriate for the study of molecular genealogy of T.
odorum were screened out, they are: rpl32-trnL, psbJ-petA, 3′rps16-5′trnK, atpI-atpH and petL-psbE.
Key words: Tsoongiodendron odorum; cpDNA; non-coding sequence of PCR; system optimization; primers screening
何长青，等：观光木 cpDNA非编码序列 PCR反应体系优化及引物筛选108 第 9期
非编码序列标记通用引物序列参考文献 [9-11]，由
北京六合华大基因科技股份有限公司合成。
1.2 基因组 DNA提取与检测
采用改良的 CTAB法提取观光木总 DNA[12]。
用 Eppendorf 公司生产的 Biophotometer 核酸蛋白分
析仪检测 DNA 浓度和纯度，用 0.8% 琼脂糖凝胶
对提取的总 DNA 进行电泳，用 Syngene公司生产
的 G-BOX 紫外凝胶成像系统观察 DNA 是否污染。
1.3 PCR扩增产物检测
参考文献 [9-10]。观光木 DNA PCR扩增初始
反应体系（20 μL）为：50 ng模板 DNA，1×PCR
buffer，0.1 μmol·L-1引物，3.0 mmol·L-1 MgCl2，0.2
mmol·L-1 dNTP，1 U Taq DNA聚合酶。PCR反应
程序为：80 ℃预变性 5 min；95℃变性 1 min，退
火 1 min，72 ℃延伸 1 min，共 30个循环；最后
72℃延伸 7 min，4 ℃保存。
PCR扩增产物采用 1.5%琼脂糖凝胶电泳检
测。电泳缓冲液为 1×TAE，电压 5 V/cm。在
G-BOX紫外凝胶成像系统拍照记录。
1.4 PCR反应体系优化与引物筛选
以 petL-psbE为引物，参考文献 [13-14]，进
行 6个浓度水平 DNA模板用量试验，以确定最适
DNA模板用量。对影响 PCR反应扩增产物的特异
性和产量的引物、Mg2+、dNTPs、Taq DNA 浓度进
行单因素梯度试验（见表 1）。根据单因子确定的
各因素最适浓度范围，进行 4因素 4水平正交试
验（见表 2）。
表 1 PCR反应体系优化的因素与水平
Table 1 Factors and levels of PCR reaction system
序号 模板用量/ng
引物浓度
/(μmol·L-1)
Mg2+浓度
/(mmol·L-1)
dNTP浓度
/(mmol·L-1)
Taq DNA
聚合酶 /U
1 10 0.1 1.0 0.10 0.6
2 20 0.2 1.5 0.15 0.8
3 30 0.3 2.0 0.20 1.0
4 40 0.4 2.5 0.25 1.2
5 50 0.5 3.0 0.30 1.4
6 60 0.6 3.5 0.35 1.6
利用优化的 PCR反应体系，对文献 [9-11]中
的 cpDNA非编码序列通用引物进行筛选。对筛选
出的最适 cpDNA非编码序列引物，以 Tm值计算
理论退火温度，以理论值为中心，设置梯度为 1℃
的 6个退火温度，最终确定引物的最佳退火温度。
1.5 最适反应体系的验证
利用筛选出的最适引物对从江种群 17株观光
木进行 PCR扩增，对优化的 PCR反应体系及反应
参数的稳定性进行检测。
2 结果与分析
2.1 DNA纯度与浓度
观光木样本提取总 DNA，通过核酸蛋白分
析仪检测 DNA 浓度和纯度。结果表明，提取的
DNA的 OD260nm/ OD280nm 值在 1.6～ 2.0之间，符
合 PCR扩增的要求。
2.2 PCR反应体系单因子试验
6个水平浓度的 DNA模板扩增结果见图 1。
由图 1可知，不同浓度DNA模板都能扩增出产物，
但随着 DNA模板用量的增加，PCR扩增条带越来
越亮，DNA模板用量为 50 ng时，扩增带条最明
亮，之后，随浓度增加，扩增条带变暗。由此可见，
观光木 cpDNA PCR扩增体系的 DNA模板最适浓
度为 50 ng。
引物、Mg2+、dNTP、Taq DNA 聚合酶 6 种
不同浓度的 PCR扩增结果如图 2所示。由图 2
可知，引物浓度为 0.3 μmol·L-1、Mg2+浓度为 2.5
mmol·L-1、dNTP浓度为 0.30 mmol·L-1、Taq DNA
聚合酶用量为 1.0 U时，PCR扩增的条带最为清晰。
表 2 PCR正交设计
Table 2 PCR orthogonal design
试验号 Mg
2+浓度
/(mmol·L-1)
dNTP浓度
/(mmol·L-1)
Taq DNA
聚合酶 /U
引物浓度
/(μmol·L-1)
1 1.0 0.15 0.8 0.2
2 1.0 0.2 1.0 0.3
3 1.0 0.25 1.2 0.4
4 1.0 0.3 1.4 0.5
5 1.5 0.15 1.0 0.4
6 1.5 0.2 0.8 0.5
7 1.5 0.25 1.4 0.2
8 1.5 0.3 1.2 0.4
9 2.0 0.15 1.2 0.5
10 2.0 0.2 1.4 0.4
11 2.0 0.25 0.8 0.3
12 2.0 0.3 1.0 0.2
13 2.5 0.15 1.4 0.3
14 2.5 0.2 1.2 0.2
15 2.5 0.25 1.0 0.5
16 2.5 0.3 0.8 0.4
109第 34卷 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
M, D2000 DNA marker; 1～ 6, DNA用量分别为 10、20、30、40、50、60 ng
图 1 不同 DNA用量对 PCR的影响
Fig.1 Effects of different template DNA concentrations on
PCR
2.3 PCR反应体系正交试验
根据单因素试验结果，设定上、下游引物浓
度为 0.1～ 0.5 μmol·L-1， Mg2+ 浓度为 0.1～ 2.5
mmol·L-1， dNTP 浓度为 0.15 ～ 0.30 mmol·L-1，
Taq DNA聚合酶用量为 0.6～ 1.4 U。采用 4因
素 4水平的正交试验，对 PCR反应体系进一步优
化。正交试验结果如图 3所示。由图 3可知，8、
12和 15组试验的 PCR扩增条带清晰明亮，但第
8组合的结果稳定性较差。因此，最终确定观光木
cpDNA非编码序列 PCR最佳反应体系（20 μL）
为：50 ng模板 DNA、1×PCR buffer、引物各 0.2
图中M为 D2000 DNA marker；1～ 6表示不同浓度处理（见表 1）
图 2 各单因素用量对 PCR的影响
Fig.2 Effects of different factor concentrations on PCR
图中M为 D2000 DNA marker；1～ 16表示不同浓度处理（见表 2）
图 3 PCR正交试验电泳图谱
Fig.3 Electrophoretogram for an orthogonal design of PCR amplifi cation
何长青，等：观光木 cpDNA非编码序列 PCR反应体系优化及引物筛选110 第 9期
μmol·L-1、2.0 mmol·L-1MgCl2、0.3 mmol·L-1dNTP、
1 U Taq DNA 聚合酶。
2.4 观光木 cpDNA引物筛选
根据正交试验结果，对文献 [9-11]中 trnK内
含 子 3914-2R 序 列，rpl32-trnL、trnQ-5′rps16、
3′trnV-ndhC、ndhF-rpl32、psbD-trnT、psbJ-petA、
3′rps16-5′trnK、atpI-atpH、petL-psbE、trnTUGU-
trnFGAA、trnCGCA-rpoB、trnDGUC-trnTGGU、trnSGCU-
tnGUUC基因间隔序列共 14对引物进行筛选。筛选
出 PCR扩增产物单一、清晰、明亮、稳定的 5对
引物（见表 3）。图 4是 5对引物 PCR圹增结果。
表 3 筛选的5对引物
Table 3 Selected five pairs of primers
引物 序列 (5′-3′) 退火温度 /℃ 目的片段长度范围 /bp
rpl32-trnL
rpL32-F:CAGTTCCAAAAAAACGTACTTC
53 1 200～ 1 400
trnLUAG: CTGCTTCCTAAGAGCAGCGT
psbJ-petA
psbJ:ATAGGTACTGTARCYGGTATT
56 1 100～ 1 300
petA:AACARTTYGARAAGGTTCAATT
3′rps16-5′trnK
rpS16x2F2:AAAGTGGGTTTTTATGATCC
54 750～ 850
trnKUUUx1:TTAAAAGCCGAGTACTCTACC
atpI-atpH
atpI:TATTTACAAGYGGTATTCAAGCT
55 1 100～ 1 300
atpH:CCAAYCCAGCAGCAATAAC
petL-psbE
petL:AGTAGAAAACCGAAATAACTAGTTA
56 1 100～ 1 300
psbE:TATCGAATACTGGTAATAATATCAGC
M, D2000 DNA marker; 1～ 6, 52、53、54、55、56、57 ℃
图 4 不同退火温度对 PCR的影响
Fig.4 Effects of different annealing temperature on PCR
利用筛选出的 5对 cpDNA非编码序列引物，
对观光木从江天然种群 17株个体进行 PCR 扩增，
凝胶电泳结果见图 5。由图 5可知，5对 cpDNA
非编码序列引物能扩增出清晰的目的片段，表明
筛选出的 PCR扩增体系适合于观光木分子谱系地
理学研究。
3 结 论
PCR扩增结果受反应体系中模板 DNA、引
物、Taq DNA 聚合酶、Mg2+ 及 dNTP 浓度的影
响 [12-16]。本研究通过单因素与正交设计试验相结
合的方法，得到了观光木 cpDNA非编码区序列引
物最适 PCR扩增反应体系。利用优化的 PCR反应
体系，筛选出适合观光木分子谱系地理学研究的
rpl32-trnL、psbJ-petA、3′rps16-5′trnK、atpI-atpH
和 petL-psbE 5对 cpDNA非编码区序列引物。其中，
rpl32-trnL扩增的目的片段长度为 1 200～ 1 400
bp，psbJ-petA 扩增的目的片段长度为 1 100 ～
1 300 bp，3′rps16-5′trnK扩增的目的片段长度为
750～ 850 bp，atpI-atpH扩增的目的片段长度为
111第 34卷 中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
1 100～ 1 300 bp，petL-psbE扩增的目的片段长度
为 1 100～ 1 300 bp。本研究为后续扩增产物的回
收、测序以及进一步开展观光木分子谱系地理学
研究奠定了基础。
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[本文编校：谢荣秀 ]
M:D2000 DNA marker
图 5 各引物 PCR扩增产物电泳图谱
Fig.5 Electrophoretogram for PCR amplifi cation products of each primer