全 文 ：天山大黄发根培养物中蒽醌化合物的产生＊
常振战　沈　昕■　果德安　鲁宽科　王沙生■　郑俊华
(北京医科大学药学院 ,北京　100083　■北京林业大学森林生物实验中心)
主题词　大黄/化学　　共生　　蒽醌类/分析
摘　要　目的:探索用发根培养法生产植物次生代谢物的途径。方法:用发根农杆菌 Agrobacterium rhizogenes
9402 所含 Ri质粒遗传转化药用植物天山大黄以诱导发根用纸电泳法检测发根中冠瘿碱的存在;用高效液相色谱
法测定发根中芦荟大黄素 、大黄酸 、大黄酚 、大黄素 、大黄素甲醚 、大黄酚-8-甲醚等游离蒽醌化合物的含量。结果:
诱导出了天山大黄发根 ,并建立了发根离体培养系;从发根中检测到甘露碱 、农杆碱的存在;定量分析发现 ,天山大
黄发根中含有多种蒽醌类成分 ,其中大黄酸 、芦荟大黄素 、大黄素 、大黄酚-8-甲醚的含量分别高于原植物根中的含
量。结论:天山大黄发根能产生与原植物药用部位种类相似的化学成分。
中国图书资料分类法分类号　R931.2
ANTHROQUINONE PRODUCTION IN HAIRY ROOTCULTURES
OF RHEUM WITTROCHII LUNDSTR.
CHANG Zhenzhan# , SHEN Xin , GUO De an , LU Kuanke , WANG Shasheng , ZHENG Junhua
(#School of Pharmaceutical Sciences , Beijing Medical University , Beijing　100083)
MeSH　Rheum /chem　　Symbiosis　　Anthroquinones/anal
ABSTRACT　Objective:To explore the approach to producing plant secondary metabolites using hairy
root culture method.Methods:The medicinal plant Rheum wittrochii Lundstr., was genetically w ith
Ri plasmid harbouring in Agrobacterium rhizogenes 9402 strain to induce hairy roo ts;t ransformed the
opines f rom the hairy roots were assayed by paper elect rophoresis;the contents of f ree anthroquinones
such as aloe-emodin , rhein , chrysophanol , emodin , physcion , 8-O-methylchrysophanol f rom the hairy
roots were quantitatively determined by HPLC technique.Results:The hairy root w as successfully in-
duced and the hairy roo t culture system was set up;The opines assay w as positive fo r mannopine and
agropine;The result of determination show ed that there w ere a lot of anthroquinone constituents in the
rhubarb hai ry root and the contents of rhein , aloe-emodin , emodin or 8-O-methylchrysophanol w ere
respectively higher than those in wild plant root.Conclusion:The hairy root cultures of Rheum wit-
trochii Lundstr.produced similar constitutents as the medicinal site of the w ild plant.
(J Beij ing Med Univ , 1998 ,30:413-415)
　　发根农杆菌 Ri质粒中的 T-DNA转化并整合到
植物细胞核基因组中而诱导产生的发根(hairy root)
具有激素自主型生长的特点 ,并经常保持原植物次
生代谢物的合成能力 ,近年来常用于生产植物次生
代谢产物 、尤其是天然药物的研究[ 1 ～ 3] 。大黄是含
蒽醌类成分的常用生药 ,除《中华人民共和国药典》
规定的 3 种正品大黄外 ,天山大黄(Rheum wit-
trochii Lundst r.)在新疆少数民族地区也作大黄使
用。现代药理实验表明 ,许多蒽醌衍生物 ,如大黄
　　＊　国家自然科学基金(39470849)资助项目 , 国家教委博士点
基金资助课题。
素 、大黄酸 、大黄素-1-甲醚 、大黄素-8-甲醚都具有上
皮生长因子受体酪氨酸蛋白激酶抑制剂活性 ,因而
用植物发根培养法生产蒽醌化合物有可能为开发新
的抗癌药物提供一个新的途径。本文以发根农杆菌
Agrobacterium rhizogenes 9402菌株(其所含 Ri质
粒上整合有选择标记 NPT-Ⅱ基因)感染天山大黄
外植体 ,诱导发根 ,建立发根离体培养系 ,用高效液
相色谱法(high perfo rmance liquid aff initychromato-
g raphy , HPLC)测定发根培养物中芦荟大黄素 、大
黄酸 、大黄酚-8-甲醚 、大黄素 、大黄酚 、大黄素甲醚
等游离蒽醌化合物的含量。
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北 京 医 科 大 学 学 报
JOURNAL OF BEIJING MEDICAL UNIVERSIT Y　Vol.30　No.5　Oct.1998
1　材料与方法
　　无菌外植体的获得:天山大黄果实于 1995 年 8
月采自新疆巩乃斯林场 。将果实撕去果翅 ,表面灭
菌后置于 MS(Murashige &Skoog)琼脂培养基上培
养 ,待果实膨胀后于无菌条件下剥出完整胚 ,置 MS
琼脂培养基上培养 , 20 ℃,每天日光灯照射 16 h ,约
第 10天子叶张开 ,第 16天真叶陆续长出。连柄剪
下生长饱满的子叶 、叶子 ,将叶柄和子叶柄切成段
(约长 1 cm)、子叶片和叶片一切为二以造成伤口 ,
用作遗传转化的外植体。
　　发根农杆菌的活化:发根农杆菌 Agrobacterium
rhizogenes 9402菌株(中国科学院遗传研究所惠赠 ,
其所含 Ri质粒上整合有 NPT-Ⅱ基因)在附加 50
mg·L-1卡那霉素的 YMB琼脂培养基上划线培养 ,
挑取单菌落接种于 YMB液体培养基上 , 25 ℃,160
r·min-1振荡过夜 ,继代培养 3次的农杆菌可用于转
化外植体 。
　　发根的诱导 、除菌 、筛选及扩大培养:用于除农
杆菌的头孢霉素 cephalosporin购自中国科学院遗传
所科遗生物技术公司 。将外植体浸于活化的发根农
杆菌菌液中 30 min后取出 ,用无菌滤纸吸干外植体
表面菌液 ,置于 MS琼脂培养基上 ,25 ℃,漫射光下
培养 。经过共培养 ,外植体上便有不定根长出 ,待根
长至 1.5 cm 长时剪下 ,转移到抗性培养基 ,即附有
25 mg·L -1卡那霉素 、200 mg·L-1头孢霉素的 MS
琼脂培养基上培养 ,以除去农杆菌并筛选转化根 ,每
2周继代 1次。阳性克隆即为发根农杆菌 Ri 质粒
转化外植体生成的发根。将完全除菌的发根转移到
MS琼脂培养基扩大培养 ,建立发根离体培养体系 。
　　冠瘿碱分析:用纸电泳法测定转化根的甘露碱
作为转化成功的证据 。甘露碱 mannopine 标准品购
自美国 Sigma公司 。参照 Morgan等[ 4]报道的纸电
泳法检测天山大黄发根中冠瘿碱 ,用天山大黄种子
萌发苗的根作对照。
　　HPLC测定发根中游离蒽醌的含量:芦荟大黄
素 、大黄酸 、大黄素 、大黄酚 、大黄素甲醚等标准品均
购自中国药品生物制品检定所;大黄酚-8-甲醚为作
者自决明发根中分离得到的结晶。作对照的天山大
黄生药于 1995年 8月采自新疆巩乃斯林场。美国
TSP 公司生产 P400 系统 HPLC , FOCUS 检测器 ,
Prodigy ODS C18反相柱(250 mm ×4.6 mm)。将天
山大黄发根及生药样品干燥后粉碎 ,各取粉末 1.0
g ,用超声波提取法以氯仿提取 3次 ,回收溶剂 ,用甲
醇溶解 , 25 ml容量瓶定容 。参考文献[ 5]的方法 ,
采用甲醇-0.1 mol·L-1高氯酸水溶液(体积比 85∶
15)作流动相 ,流速 0.8 ml·min-1 , 检测波长 254
nm ,柱温为室温 ,测定样品的峰面积 ,根据回归方程
计算游离蒽醌化合物的含量 。
2　结果
发根离体培养体系的建立:一般在接种发根农
杆菌10 d后 ,外植体上便有不定根长出 ,见图1 。天
山大黄不同外植体对发根农杆菌的敏感性不同 ,叶
片 、子叶柄的敏感性较强 ,而子叶片 、叶柄的敏感性
很差 ,如表 1。
图 1　天山大黄外植体上产生的发根
Figure 1　Hairy root s producing f rom the explants
of Rheum wit trochii Lundst r.
表 1　发根农杆菌对天山大黄不同外植体的诱导效应
Table 1　Induction effect s of Arobacterium rhizogenes
on the explants of Rheum wi tt rochi i Lundst r.
Explants
Number of
inoculat ing
explants
Number of
rooting
explants
Inducing
rate(%)
Leaf blade 31 16 51.61
Cotyledon blade 49 2 4.08
Petiole 8 5 62.50
Cotyledon stalk 36 0 0
　　从天山大黄外植体上长出的发根初期呈白色 ,
无向地性 ,暴露于空气中的发根有侧生绒毛 ,伸进培
养基中的发根细长 ,并产生分支。发根在完全除菌
后转入 MS 琼脂培养基扩大培养 ,随着培养时间的
增长 ,发根颜色开始变黄 ,逐渐接近大黄生药的颜
色 ,提示天山大黄发根中积累了一定量的蒽醌化合
物 。
　　冠瘿碱的检测:纸电泳结果见图 2。电泳结果
标明:天山大黄发根合成了甘露碱和农杆碱(由于
没有农杆碱标准品 ,按文献[ 3]判定农杆碱的位置),
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JOURNAL OF BEIJING MEDICAL UNIVERS ITY　Vol.30　No.5　Oct.1998
而天山大黄实生苗根中没有检测到冠瘿碱的存在 ,
这证明 Ri质粒 T-DNA冠瘿碱合成基因在天山大黄
发根中得到表达 。T-DNA 已转移并整合到天山大
黄细胞核基因组中。
Lane 1 , Mannopine standard;Lane 2 , Seeding roots;Lane 3 , Trans-
f ormed roots.
图 2　天山大黄发根中冠瘿碱的检测
Figure 2　Opine detection from hairy root s of Rheum wi tt rochi i Lundst r.
　　发根中游离蒽醌化合物含量的测定:按照前述
的高效液相色谱条件 ,6 种标准品游离蒽醌化合物
———大黄酸 、大黄素 、芦荟大黄素 、大黄素甲醚 、大黄
酚 、大黄酚-8-甲醚都能从天山大黄发根中定量测
出 ,见表 2。
表 2　天山大黄发根和生药中游离蒽醌化合物含量比较
Table 2　Content comparation of f ree anth roquinonesin hairy roots
and wild plant root s of Rheum wi tt rochi i Lundst r.
　Free anthroquinone Hairy root s(μg·g -1)
Wild plant roots
(μg·g -1)
Aloe-emodin 27.27 11.69
Rhein 42.12 19.42
8-O-methylchrysophanol 20.18 10.49
Emodin 26.99 19.23
Ch rysophanol 163.41 3269.91
Physcion 75.08 1305.24
　　HPLC分析:在天山大黄发根中含有多种蒽醌
化合物 ,其中有的化合物 ,如芦荟大黄素 、大黄酸 、大
黄酚-8-甲醚 、大黄素 、大黄酚在发根中的含量比在
作对照的生药中的含量还要高 。
3　讨论
外植体在感染发根农杆菌后长出的不定根上仍
有农杆菌存活 ,需要在继代培养基中附加头孢霉素
以除去农杆菌。但头孢霉素不仅可以消灭细菌 ,而
且对不定根的生长有抑制作用 ,因此头孢霉素的浓
度应控制在较低而除菌效果良好的水平上 ,200 mg
·L-1即可达到这一效果 。外植体在感染发根农杆
菌后长出的不定根未必就是 Ri质粒转化根 ,需要在
继代培养基中附加卡那霉素筛选转化根 , 25 mg·
L -1的卡那霉素适于筛选转化根又不抑制转化根的
正常生长。因此选用附加 25 mg·L-1卡那霉素 、200
mg·L-1头孢霉素的 MS 培养基除菌并筛选转化根。
本实验所用发根农杆菌 Agrobacterium rhizo-
genes 9402含有农杆碱型 Ri质粒 ,其 T-DNA 分为
T L-DNA和 TR-DNA 两段 , 冠瘿碱合成基因位于
TR-DNA 上。转化时 TR-DNA转移并整合进植物核
基因组 ,转化根才能产生冠瘿碱。实验中从天山大
黄发根中检测到了甘露碱和农杆碱的存在 ,由此证
明 TR-DNA 获得转移 。
Ri质粒 T-DNA 上有编码生长素合成的基因
(aux 基因),发根能自主合成生长素。因此发根在
不添加任何外源植物激素的培养基上能自主生长。
这对生产“绿色”天然药物有很大价值 ,具有植物细
胞悬浮培养 、愈伤组织培养所不可比拟的优越性。
本实验中天山大黄发根中某些活性成分的含量甚至
高于生药中的含量 。这些特点展现出了用植物发根
培养法工业化生产天然药物的光明前景。
作者曾观察了单根天山大黄发根在液体培养基
中的增殖情况。将长约 1.5 cm 的单根发根从外植
体上切下 ,直接浸入附加有 200 mg·L-1头孢霉素的
MS 液体培养基中 ,25 ℃, 120 r·min-1振荡培养 ,待
完全除菌后将发根转移到 MS 液体培养基继续培
养 。1个月后 ,发根细长且生出许多侧根 ,总长增殖
约 20倍 。除根尖为白色外 ,发根其余部分呈褐黄
色 ,说明天山大黄发根在液体培养中也能产生并积
累一定量的蒽醌化合物 。天山大黄发根的液体培养
有待进一步研究。
参 考 文 献
1 Zhibi HU , Alfermann AW.Diterpenoid product ion in hai ry root cul-
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2 张荫麟 ,宋经元 ,吕桂兰 ,等.丹参毛状根培养的建立和丹参酮的
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素的生物合成.生物工程学报 , 1995 , 11(4):315～ 320
4 Morgan AJ , Cox PN , Turner DA , et al.Transformation of tomato
using an Ri plasmid vector.Plant S ci , 1987 , 49(1):37～ 50
5 洪筱坤 ,王智华 ,李琴韵 ,等.含大黄的中成药中蒽醌类化合物的
多组分定性定量研究.中成药 , 1996 , 18(4):38～ 39
(1997-12-08收稿)
(本文编辑:王　蕾)
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