全 文 ：中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2015, 37(10): 1386–1393 DOI: 10.11844/cjcb.2015.10.0112
收稿日期: 2015-04-13 接受日期: 2015-08-24
国家自然科学基金面上项目(批准号: 81171063、81072167)资助的课题
#共同第一作者
*通讯作者。Tel: 010-62773628, E-mail: shpzhang@biomed.tsinghua.edu.cn
Received: April 13, 2015 Accepted: August 24, 2015
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No.81171063, 81072167)
#These authors contributed equally to this work
*Corresponding author. Tel: +86-10-62773628, E-mail: shpzhang@biomed.tsinghua.edu.cn
网络出版时间: 2015-10-22 15:41:23 URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/31.2035.Q.20151022.1541.004.html
双亮氨酸模体对NOK/STYK1蛋白的表达及
细胞内分布特征的影响
胡 丹1,2# 姜清波2# 颜廷越2 张淑平2*
(1新疆农业大学动物科学学院, 乌鲁木齐 830052;
2生物膜与膜生物国家重点实验室, 清华大学生命科学学院, 北京 100084)
摘要 NOK(novel oncogene with kinase domain)蛋白是一种新的在结构上比较独特的受体型
酪氨酸蛋白激酶家族(protein tyrosine kinases, PTKs)成员, 具有较强的促肿瘤形成及转移的能力, 并
参与细胞的内吞过程。基因结构序列分析结果表明, 在NOK氨基酸序列中存在多处双亮氨酸模体
(di-leucine motif)。有研究表明, 双亮氨酸模体在细胞的内吞、膜泡运输以及细胞信号分拣等过程
中具有重要作用。为此, 该研究构建了一系列NOK蛋白双亮氨酸模体突变体, 并在HeLa细胞中分
析了其蛋白质表达水平及细胞内分布特征。结果表明, NOK蛋白的不同双亮氨酸模体的突变可导
致NOK蛋白在细胞中表达量的改变。与对照相比, NOKL220P表达量明显提高, 而NOKL237P表达
量降低。从NOK蛋白在细胞内的分布特征来看, 不同双亮氨酸模体的突变同样会引起NOK蛋白在
细胞内分布的改变, 包括NOK蛋白形成聚集体的细胞比例、在细胞中的分布位置以及聚集体的大
小和数量的不同。特别是NOKL203P、NOK237P以及L299P三个位置的突变可以显著地降低NOK
蛋白在细胞中的聚集。不仅如此, 过量表达NOKL41P还表现出了更为明显的核膜定位特征, 而
L220P则表现出了更为明显的质膜定位特征。由此说明, NOK的不同双亮氨酸模体对其蛋白质表
达水平以及在细胞内的定位分布具有重要的调节作用, 该研究为阐明NOK蛋白促肿瘤形成及转移
的分子机理提供了新的见解。
关键词 NOK/STYK1; 双亮氨酸模体; 突变体; 细胞内蛋白质分布形式
Di-leucine Motifs of NOK/STYK1 Affects Its Protein Expression and
Distribution in HeLa Cells
Hu Dan1,2#, Jiang Qingbo2#, Yan Tingyue2, Zhang Shuping2*
(1College of Animal Science, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China; 2State Key Laboratory of Biomembrane and
Membrane Biotechnology, School of Life Sciences, Tsinghua University, Beijing 100084, China)
Abstract NOK/STYK1 is a structurally unique member in receptor tyrosine kinase family (RTKs), which
has strong ability to facilitate tumorigenesis and metastasis. It is also involved in cellular endocytosis. Analysis of
NOK protein sequence revealed that there were several di-leucine motifs. Di-leucine motifs have been reported to
play important roles in cellular endocytosis, vesicle traffi cking, signaling sorting and so on. In the present study,
胡 丹等: 双亮氨酸模体对NOK/STYK1蛋白的表达及细胞内分布特征的影响 1387
a series of mutants of NOK di-leucine motifs were established and their protein expression and cellular distribution
pattern were analyzed in HeLa cells. The results indicated that mutation in different NOK di-leucine motifs caused
different change of NOK protein expression level. The protein expression level of NOKL220P mutant was higher
than wild type NOK whereas NOKL237P was lower than wild type. As to the cellular distribution, some mutants
altered the cellular distribution pattern of NOK protein, including the proportion of dot pattern (DP)-containing cells
to aggregation pattern (AP)-containing cells as well as the localization, the size and the number of NOK aggregates.
The mutants of NOKL203P, NOK237P and L299P signifi cantly reduced the formation of NOK aggregates in cells.
In addition to the above, overexpression of NOKL41 had more distinctive localization on nuclear envelop whereas
overexpression of L220P had more distinctive localization on cytoplasma membrane. Taken together, di-leucine motifs
of NOK mediate its protein expression level and cellular distribution. Therefore, this study provides some new insights
into understanding the molecular mechanism underlying NOK’s facilitation to tuomrigensis and metastasis.
Keywords NOK/STYK1; di-leucine motif; mutant; protein distribution pattern in cell
酪氨酸蛋白激酶(protein tyrosine kinases, PTKs)
是一类具有酪氨酸激酶活性的蛋白质, 对细胞的生
长、发育与功能的调控均起着重要的作用。酪氨酸
蛋白激酶通过催化ATP上的γ磷酸基团转移到许多
重要蛋白质的酪氨酸残基上的反应, 使其发生磷酸
化。根据是否具有跨膜结构域, 这些PTKs可以分为
两大类, 即受体型酪氨酸蛋白激酶(RTKs)和非受体
型酪氨酸蛋白激酶(NRTKs)[1]。RTKs在细胞生长过
程包括细胞迁移、细胞增殖及抑制细胞凋亡等方面
发挥着重要的调节作用[2-3]。
NOK(novel oncogene with kinase domain)基因作
为一个新的RTKs亚家族, 具有原癌基因的特性, 位于
人类第十二号染色体的短臂上, 大小约55 Kb, 由11个
外显子编码422个氨基酸[4]。NOK基因的高表达可以
使裸鼠成瘤, 这提示NOK基因是一个原癌基因[5]。先
前的研究也证实, NOK基因在乳腺癌、卵巢癌、前
列腺癌以及肺癌中高表达[6-8]。Chen等[9]通过蛋白质
序列比对的方式找到了NOK的两个保守的酪氨酸残
基位点327和356, 并构建了NOKY327F和NOKY356F
两个突变体, 通过相关研究发现, 虽然这两个位点不
影响NOK的激酶活性, 但可以完全抑制NOK诱导肿
瘤的生成。NOK羧基末端的第417位氨基酸残基是
一个自主抑制调节位点, 该位点的突变能激活NOK
介导的多条下游信号通路[10-11]。Ding等[12]已证实,
NOK在HeLa细胞中的亚细胞分布具有两种不同的
表达模式: 点状分布(dot pattern, DP)和聚集分布(ag-
gregation pattern, AP)。NOK定位在细胞的早期内吞
体上, 并且有可能促进表皮生长因子受体从早期内
吞体到晚期内吞体以及溶酶体的转运过程。
内含体和溶酶体的跨膜蛋白的分拣是由蛋白
质的胞质结构域内存在的信号所介导的。大多数信
号由一些短的线性序列或者氨基酸残基组成。一些
信号涉及到基于酪氨酸的分拣信号, 并符合NPXY
或YXXØ模体形式。其他一些信号被称为双亮氨酸
基信号, 它们符合XXXL或DXXLL模体形式[13]。所
谓亮氨酸模体的要求是两个连续的亮氨酸或一个亮
氨酸异亮氨酸对的存在, 双亮氨酸模体侧链上游的4
个酸性氨基酸残基对模体是有益的, 但这一点对于
模体的活性不是必需的[14]。信号和识别蛋白复杂的
排列方式, 保证了内含体–溶酶体系统的不同区室的
跨膜蛋白的动态而准确地分布[13]。对WC1(bovine
workshop cluster 1)蛋白的双亮氨酸模体的突变, 影
响了它的内吞作用, 说明双亮氨酸模体与细胞的内
吞作用相关[15-16]。对双亮氨酸模体的结构改变, 可
能导致目标蛋白在内吞体的亚细胞定位的改变以及
蛋白稳定性的改变[17]。通过对NOK基因的氨基酸
比对发现, 其中存在多处双亮氨酸模体。然而对于
NOK基因中双亮氨基酸的突变是否影响NOK蛋白
的表达及其在细胞内的分布特征, 目前相关的研究
较少。本实验在NOK基因的4处双亮氨酸模体(di-
leucine motif)位点将亮氨酸L突变为脯氨酸P, 旨在
研究它们对NOK蛋白的表达及细胞内分布的影响,
从而进一步研究NOK基因的不同氨基酸位点对其
功能的影响。
1 材料与方法
1.1 主要材料
本研究相关NOK表达载体、细胞系以及细菌
1388 ·研究论文 ·
菌株均为清华大学功能基因组实验室保存。
1.2 主要试剂
PCR mix购自北京华佰泰生物科技有限公司;
DNA Marker购自美国Thermo公司; 限制性核酸内
切酶购自日本TaKaRa公司; T4 DNA连接酶购自美
国NEB公司; 质粒小量提取试剂盒和琼脂糖凝胶
纯化回收试剂盒购自北京博迈德基因技术有限公
司 ; DMEM、0.25% Trypsin-EDTA、Lipofectamine
2000、opti-MEM购自美国Invitrogen公司; FBS购自
上海依科赛生物制品有限公司; 双抗(青霉素和链霉
素)购自德国AppliChem公司; HA单克隆抗体购自北
京康为世纪生物科技有限公司; GAPDH抗体购自美
国Proteintech Group公司; 山羊抗鼠辣根过氧化物酶
标记二抗和TRITC标记山羊抗鼠IgG购自北京中杉
金桥生物技术有限公司; 多聚甲醛购自亚太恒信生
物科技(北京)有限公司; Hoechst 33342、Triton X-100
和BSA购自美国Sigma-aldrich公司。
1.3 双亮氨酸模体突变位点的构建
根据人源NOK基因的氨基酸序列中双亮氨酸
模体的位置 , 在 pcDNA3.0-NOK-HA和 pcDNA3.0-
NOKL203P-HA质粒载体的基础上, 选择四处双亮
氨酸模体作为突变位置, 构建其双亮氨酸模体点突
变载体, 四个突变位置的氨基酸序列号分别为41、
220、237、299, 预构建突变载体分别为pcDNA3.0-
NOKL41P-HA、pcDNA3.0-NOKL220P-HA、pcDNA3.0-
NOKL237P-HA、pcDNA3.0-NOKL299P-HA。采用
overlap的方法构建点突变载体。
引物序列的设计根据NCBI数据库中人源
STYK1(NOK)基因的基因序列, 采用Primer Premier
软件设计引物。N-up: 5′-GCC CAA GCT TGC ACC
ATG GGC ATG ACA CGG AT-3′; N-down: 5′-CGC
GTC GAC AAG CAT GCT ATA GTT GTA GAA GA-
3′; L41P-S: 5′-CAT CCT TCC TGG GGT CAT CCT
GTG G-3′; L41P-AS: 5′-ACC CCA GGA AGG ATG
AGG AAG ATA GT-3′; L220P-S: 5′-TGG TCT TCC
TTA TGA TCT CAC AGA A-3′; L220P-AS: 5′-TCA
TAA GGA AGA CCA TCC ATA GTC AT-3′; L237P-S:
5′-TCC TTC CTG CGC TGG AAT TCC TGC A-3′;
L237P-AS: 5′-CAG CGC AGG AAG GAC CTG CTT
TCC G-3′; L299P-S: 5′-ACG GCT TCC TCT GAG
ACC TGC TAG CA-3′; L299P-AS: 5′-TCA GAG
GAA GCC GTT CTG GGG CAA G-3′。引物由上海
生工生物工程有限公司合成。
以L41P为例。(1)以pcDNA3.0-NOK203L-HA为模
板, 分别以N-up和41P-AS、N-down和41P-S为引物, 进
行PCR反应。PCR反应体系: 2×PCR mix 25 μL, 上游
引物和下游引物各1 μL, 模板质粒0.1 μL, 加ddH2O补
足至50 μL。反应条件: 94 °C 1 min; 94 °C 30 s, 58.5 °C
30 s, 72 °C 80 s, 30个循环; 72 °C 10 min; (2)以上述
两种PCR产物为模板, 以N-up和N-down为引物, 进
行PCR反应。PCR反应体系: 2×PCR mix 25 μL, 上
游引物和下游引物各0.5 μL, 上述两部分PCR产物各
取1 μL并稀释100倍后各取1 μL, 加ddH2O补足至
50 μL。反应条件: 94 °C 1 min; 94 °C 30 s, 60 °C 30 s,
72 °C 80 s, 20个循环; 72 °C 10 min。
1.4 细胞的培养
HeLa细胞培养于10%胎牛血清的DMEM培养
基中(含100 U/mL青霉素和链霉素), 放置于37 °C、
5% CO2培养箱中培养, 细胞密度达到80%时传代, 平
均2 d传代1次, 取对数生长期的细胞进行各项实验。
1.5 细胞的转染
HeLa细胞接种于6孔板中, 每孔细胞数为3×105,
24 h后用Lipofectamine 2000转染试剂将对照质粒和
目的质粒转染到HeLa细胞中, 于37 °C、5% CO2培
养箱中培养。6 h更换新鲜的完全培养液, 转染完成。
36 h后观察或收取细胞。
1.6 点突变载体蛋白质水平检测(Western blot)
收取6孔板中的细胞, 用200 μL SDS在冰上裂解细
胞20 min, 加100 °C沸水煮8 min, 于4 °C、12 000 r/min
离心5 min, 取上清液进行SDS-PAGE电泳, 转硝酸纤
维素膜, 5%脱脂牛奶封闭2 h。一抗孵育, 4 °C过夜,
TBST洗4次, 每次7 min, 辣根过氧化物酶标记的二
抗于室温孵育2 h, 然后用TBST洗4次, 每次7 min, 最
后曝光显影。
1.7 点突变载体细胞定位的检测
将细胞铺于放有盖玻片的6孔板中, 接种细胞数
为3×105, 接种细胞后24 h按照前述方法转染, 36 h后用
PBS洗2次, 固定液(4%多聚甲醛)室温固定20 min, 之
后PBS洗2次, 每次5 min, 穿透液(0.2% Triton X-100的
PBS)室温穿透10 min, 然后用PBS洗2次, 每次5 min,
封闭液(含1% BSA的PBS)37 °C封闭1 h。加0.2%
BSA-PBS稀释的一抗, 4 °C孵育过夜, PBS洗2次, 每
次5 min, 加0.2% BSA-PBS稀释的二抗, 室温避光孵
育2 h。加1 mL PBS稀释的Hoechst 33342, 室温避光
胡 丹等: 双亮氨酸模体对NOK/STYK1蛋白的表达及细胞内分布特征的影响 1389
孵育15 min。最后PBS洗4次, 每次5 min, 用50%甘
油-PBS将盖玻片固定到载玻片上, 指甲油封边, 激光
共聚焦显微镜观察并拍照。
1.8 统计学处理
数据采用GraphPad Prism 5统计软件进行处理,
以mean±S.D.表示, 两组间比较采用t检验, P<0.05
为差异具有显著性。
2 结果　
2.1 点突变载体的构建结果验证
将构建的表达质粒pcDNA3.0-NOKL41P-HA、
pcDNA3.0-NOKL220P-HA、pcDNA3.0-NOKL237P-
HA和pcDNA3.0-NOKL299P-HA经Hind III和BamH I
双酶切后经琼脂糖凝胶电泳, 结果如图2所示。将获
得质粒送北京博迈德基因技术有限公司测序, 测序
结果显示各突变位置测序正确。
2.2 不同双亮氨酸模体对NOK蛋白表达水平的
影响　
将HeLa细胞分别转染pcDNA3.0-HA、pcDNA3.0-
NOK-HA、pcDNA3.0-NOKL41P-HA、pcDNA3.0-
NOKL220P-HA、pcDNA3.0-NOKL237P-HA、
pcDNA3.0-NOKL299P-HA及pcDNA3.0-NOKL203P-
HA质粒, 通过Western blot检测目的蛋白质的水平
(图2)。用Image J对NOK-HA/GAPDH蛋白定量, 并
用GraphPad Prism作图(图3)。NOK基因及其双亮氨
酸基序点突变的蛋白质表达量是对该基因及其突变
载体从DNA开始, 经转录和翻译, 并最终表达为蛋
白质的全过程的最终诠释。结果发现, NOK基因及
M: marker; L41P: 41位点突变载体; L220P: 220位点突变载体; L237P:
237位点突变载体; L299P: 299位点突变载体。
M: marker; L41P: pcDNA3.0-NOKL41P-HA; L220P: pcDNA3.0-
NOKL220P-HA; L237P: pcDNA3.0-NOKL237P-HA; L299P:
pcDNA3.0-NOKL299P-HA.
图1 pcDNA3.0-NOK-HA的点突变载体酶切产物电泳结果
Fig.1 The pcDNA3.0-NOK-HA and its mutations enzyme
electrophoresis results of PCR products
M
bp
1 500
1 000
500
L41P L220P L237P L299P
WT: 野生型NOK载体; L203P: 203位点突变载体; L41P: 41位点突变
载体; L220P: 220位点突变载体; L237P: 237位点突变载体; L299P:
299位点突变载体。
WT: pcDNA3-NOK-HA; L203P: pcDNA3.0-NOKL203P-HA; L41P:
pcDNA3.0-NOKL41P-HA; L220P: pcDNA3.0-NOKL220P-HA; L237P:
pcDNA3.0-NOKL237P-HA; L299P: pcDNA3.0-NOKL299P-HA.
图2 不同点突变载体的蛋白表达
Fig.2 The protein expression of WT and the
differnent mutations
WT
NOK-HA
GAPDH
L203P L41P L220P L237P L299P
WT: 野生型NOK载体; L41P: 41位点突变载体; L203P: 203位点突变
载体; L220P: 220位点突变载体; L237P: 237位点突变载体; L299P:
299位点突变载体。*P<0.05, **P<0.01, 与WT组比较。
WT: pcDNA3.0-NOK-HA; L41P: pcDNA3.0-NOKL41P-HA; L203P:
pcDNA3.0-NOKL203P-HA; L220P: pcDNA3.0-NOKL220P-HA;
L237P: pcDNA3.0-NOKL237P-HA; L299P: pcDNA3.0-NOKL299P-
HA. *P<0.05, **P<0.01 vs WT group.
图3 蛋白表达结果的定量分析
Fig.3 The quantitative analysis of protein expression results
2.0
1.5
1.0
0.5
0
H
A
/G
A
PD
H
**
*
W
T
L2
03
P
L4
1P
L2
20
P
L2
37
P
L2
99
P
其突变体的蛋白质表达存在明显差异, 说明对NOK
基因不同位点的点突变, 可能对其在从DNA到蛋白
质的某个过程产生了一定的影响, 并最终反应为蛋
白质表达量的改变。与WT相比, NOKL220P蛋白质
表达量明显增多(P=0.008), NOKL237P蛋白质表达
量明显减少(P=0.040)。这说明NOK基因的220位点
所处的双亮氨酸模体的点突变使NOK蛋白质表达
量增加, 推测220位的突变可能改变了NOK蛋白质
的内吞作用, 并降低了NOK蛋白质的降解。而237位
所处的双亮氨酸模体的点突变使NOK蛋白质表达
量降低, 这提示我们, 这三处位点的突变可能改变了
NOK蛋白质的内吞作用与运输功能。
2.3 不同双亮氨酸基序对NOK蛋白在细胞内分
布特征的影响
将 HeLa细胞分别转染pcDNA3.0-HA、pcDNA3.0-
NOK-HA、pcDNA3.0-NOKL41P-HA、pcDNA3.0-
1390 ·研究论文 ·
HA Hoechst 33342 Merge HA Hoechst 33342 Merge HA Hoechst33342 Merge
W
T
A
P
D
P
A
P
D
P
A
P
D
P
A
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D
P
A
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D
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A
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D
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L4
1P
L2
03
P
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20
P
L2
37
P
L2
99
P
NOKL203P-HA、pcDNA3.0-NOKL220P-HA、pcDNA3.0-
NOKL237P-HA和pcDNA3.0-NOKL299P-HA质粒,
转染后36 h进行免疫荧光染色, 用激光共聚焦显微
镜观察并拍照, 使用Photoshop和Image J进行图像分
析处理, 并统计每组图片的DP与AP的比例, 统计数
据用GraphPad Prism作图, 结果如图4和图5所示。使
用Image J进行总荧光强度的测定, 数据用GraphPad
Prism作图, 如图6所示。
对AP与DP的分布, 本文定义如下: (1)如果一个
细胞中聚集点的直径大于或者等于2 μm, 我们将这
个细胞定义为AP(聚集分布); (2)如果一个细胞中的
聚集点的直径大于1 μm但小于2 μm, 但是可见明显
的聚集分布, 且聚集的个数大于3, 我们将这个细胞
定义为AP(聚集分布); (3)如果一个细胞中的聚集点
的直径小于0.5 μm, 我们将这个细胞定义为DP(点状
分布)。
从WT的细胞定位发现, 其聚集分布(AP)与点
状分布(DP)的比例大致相当, 在50%左右, 呈现出
NOK蛋白的两种分布形式在细胞内的分布情况, 即
点状分布与聚集分布的平衡, 其细胞的核膜定位不
明显。对于L41P的AP与DP的比例与WT相比差异
不明显, 而AP和DP的细胞核膜定位明显, 这是L41P
与WT以及其他突变体相比最明显的特征, 特殊的核
膜定位特征可能与NOK蛋白的跨膜运输的功能有
关。而L220P的AP与DP的比例与WT相比差异不明
显, 其AP和DP的细胞核膜定位以及细胞膜定位明
显, 这是L220P的典型特征, 并且AP比例较DP有所
增加, 这都说明了220位点所处的双亮氨酸基序重要
的生物学功能, 可能与细胞的膜泡运输和内吞作用
等功能相关, 并可能参与NOK蛋白的促进肿瘤形成
的过程。L203P、L237P、L299P的AP与DP的比例
与WT相比存在明显的差异, AP的比例明显减少, DP
的比例明显增多, 这说明这三个位点的突变对NOK
蛋白在细胞的定位情况及AP与DP的比例产生了巨
大的影响, 从而改变了NOK蛋白的内吞作用, 可能
增加了NOK蛋白的降解。
NOK及其突变体所在细胞内的聚集分布的位置
有所不同, 其中WT、L203P、L220P、L2237P、L299P
的聚集分布更靠近细胞核, 而L41P的聚集分布远离
细胞核, 即对NOK蛋白聚集方面, 对41位的点突变
造成对NOK蛋白的聚集分布位置的改变。
总荧光强度的高低是蛋白表达量的一个标尺,
从细胞定位层面反映了NOK蛋白及其突变体的表
达情况。根据NOK蛋白及其突变体的细胞定位以
及总荧光强度分析, 其聚集分布的大小和数量有显
著不同, 结合本文关于AP和DP的定义以及AP与DP
的比例分布, 可以得出220位点突变的聚集分布的大
小和荧光强度明显大于WT和其他突变体, 进一步
证实了220位点在影响NOK蛋白表达方面的重要作
用, 其很可能与肿瘤的形成有关。而41位突变由于
其AP比例比DP高, 导致其总荧光强度比WT高, 结合
其特殊的核膜定位分布, 可知41位点突变对NOK蛋
WT: 野生型NOK载体; L41P: 41位点突变载体; L203P: 203位点突变载体; L220P: 220位点突变载体; L237P: 237位点突变载体; L299P: 299位点
突变载体。标尺=10 μm。
WT: pcDNA3.0-NOK-HA; L41P: pcDNA3.0-NOKL41P-HA; L220P: pcDNA3.0-NOKL220P-HA; L237P: pcDNA3.0-NOKL237P-HA; L299P:
pcDNA3.0-NOKL299P-HA. Scale bars=10 μm.
图4 不同双亮氨酸模体点突变对NOK蛋白在细胞内分布特征的影响
Fig.4 The distribution of the different di-leucine motif mutations on the NOK protein
胡 丹等: 双亮氨酸模体对NOK/STYK1蛋白的表达及细胞内分布特征的影响 1391
白功能改变的特异性。L203P、L237P、L299P聚集
分布的大小与WT相比没有明显差异, 但聚集分布的
数量和比例显著减少, 由于其点状分布与WT相比更
加均匀, 导致其总体荧光强度与WT相比并无明显差
异, 这说明NOK蛋白的AP和DP的分布形式在细胞
内受到了各突变位点的影响, AP与DP在细胞内维持
着某种平衡, 这三个位点的突变并未打破这种平衡。
3 讨论　
RTKs在生物功能的完成过程中具有重要的作
用, 其功能的失调会导致生物体的一系列疾病[18]。
NOK基因作为新的RTKs亚家族, 它的生物活性与生
物体的各项生命活动息息相关。NOK具有较强的促
进肿瘤形成和转移的能力, 携带NOK基因的BaF3细
胞能使裸鼠迅速成瘤、转移到多个器官并导致裸鼠
短期死亡[5], 所以对NOK蛋白不同的双亮氨酸基序
位点的点突变可能在不同程度上影响到其促进肿瘤
形成和转移的能力。
本研究成功地对NOK基因不同的双亮氨酸模
体位点进行点突变, 研究结果指出不同的点突变导
致NOK基因的蛋白质表达量存在差异, L220P蛋白
质表达量比WT明显升高, 而L237P蛋白质表达量比
WT降低, 这说明对NOK基因不同的双亮氨酸模体
位点的点突变, 可能改变了NOK蛋白质的内吞作用
以及蛋白质的稳定性, 并最终改变了蛋白质表达量。
结合突变位置是双亮氨酸模体位点, 其生物学功能
与细胞的内吞、膜泡运输以及细胞信号分拣等过程
有关, 推测不同的双亮氨酸模体位点的突变可能在
不同程度上改变了NOK蛋白特有的与内吞以及膜
泡运输路径相关的结构域或信号通路, 从而改变了
其跨膜物质运输的功能并影响了其蛋白质的表达。
结合已有研究, NOK的过量表达能够促进肿瘤的形
成, 由NOK的不同位点的点突变在蛋白质表达水平
上发生了改变, 推测NOK的双亮氨酸模体点突变很
可能在改变蛋白质内吞作用以及稳定性方面, 通过
改变蛋白质的表达量, 参与了NOK蛋白的促进肿瘤
形成的相关机制, 以上数据可以为研究NOK相关的
肿瘤形成机理提供新的思路。关于不同亮氨酸突变
体对NOK蛋白稳定性影响的分子机制将是我们今
后重点研究的问题, 我们将在后续的实验中进一步
结合多种实验方法以确定其作用机制。
过量表达NOKL41P的细胞定位呈现明显的核
膜定位特征, 而L220P则表现出了更为明显的质膜
定位特征。细胞核膜定位一直受到人们的广泛关注,
而细胞核膜相关定位的改变与基因的功能改变是息
息相关的[19]。L41P呈现明显的核膜定位, 推测41位
氨基酸的点突变可能影响了其跨核膜的物质运输,
结合NOK基因具有典型的跨膜区, 提示我们41位亮
氨酸所处的双亮氨酸模体可能影响到NOK基因的
跨核膜运输的相关结构域, 从而改变了其核膜定位
情况。同理, L220P的细胞定位呈现明显的质膜定位,
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WT: 野生型NOK载体; L41P: 41位点突变载体; L203P: 203位点突变
载体; L220P: 220位点突变载体; L237P: 237位点突变载体; L299P:
299位点突变载体。*P<0.05, 与WT组比较。
WT: pcDNA3.0-NOK-HA; L41P: pcDNA3.0-NOKL41P-HA; L220P:
pcDNA3.0-NOKL220P-HA; L237P: pcDNA3.0-NOKL237P-HA;
L299P: pcDNA3.0-NOKL299P-HA. *P<0.05 vs WT group.
图5 DP、AP比例的统计分析
Fig.5 The statistical analysis of DP and AP proportion
WT: 野生型NOK载体; L41P: 41位点突变载体; L203P: 203位点突变
载体; L220P: 220位点突变载体; L237P: 237位点突变载体; L299P:
299位点突变载体。***P<0.001, 与WT组比较。
WT: pcDNA3.0-NOK-HA; L41P: pcDNA3.0-NOKL41P-HA; L220P:
pcDNA3.0-NOKL220P-HA; L237P: pcDNA3.0-NOKL237P-HA;
L299P: pcDNA3.0-NOKL299P-HA. ***P<0.001 vs WT group.
图6 总荧光强度分析
Fig.6 The statistical analysis of the total fluorescence intensity
1392 ·研究论文 ·
提示我们220位亮氨酸所处的双亮氨酸基序可能与
NOK跨质膜运输相关的结构域有关。NOK蛋白为
跨膜蛋白, 对其41位、220位双亮氨酸基序位点进行
点突变后, 促进了它们在核膜和质膜上的定位, 改变
了NOK蛋白原有的与核膜与质膜相关的定位情况,
可能对细胞的跨膜物质运输和细胞膜上的多种受体
相关的信号通路有一定的影响。
在RTKs家族中已经发现有些受体是以聚集体
的方式行使功能的。比如EGFR, 当与EGF结合后,
导致EGFR的聚集, 使受体以聚集体的形式参与到
细胞内结构域之间的相互作用和激酶活性的调节
过程中[20]。由此推测, NOK蛋白的聚集形式AP可能
与NOK蛋白的激酶活性有关, 并参与NOK激酶的受
体活化与磷酸化过程。我们的前期研究结果证明,
NOK蛋白形成的AP这种分布形式在体内和体外都
是存在的, 并在子宫颈癌和乳腺癌的癌症组织中发
现了NOK在癌症组织中的表达量比癌旁组织高, 而
在癌症组织中高表达的NOK其分布形式也趋向于
AP形式[12]。本研究的结果显示, L220P的AP聚集程
度比WT增加, 结合L220P对应的总荧光强度显著高
于WT, 推测220位亮氨酸可能对NOK蛋白的激酶活
性和促进肿瘤形成相关的机理方面发挥着重要的作
用。L203P、L237P、L299P的细胞定位中DP呈现
了均匀的散点分布, 所占比例相对较高, 而其AP比
例明显较少, 推测对这三处双亮氨酸模体的点突变
很可能会起到抑制肿瘤形成的作用, 我们将在后续
的实验中继续验证它们对NOK蛋白激酶活性的影
响及其参与肿瘤形成相关的作用机制。
本研究在pcDNA3.0-NOK203L-HA的基础上构
建了NOK基因的四个双亮氨酸模体点突变载体, 并
验证了其在蛋白质水平和细胞水平的表达情况。其
中, 不同突变体的蛋白质水平表达与WT相比存在明
显差异, L220P的蛋白表达量明显高于WT, 而L237P
的蛋白表达量低于WT。而在细胞内分布特征上, 不
同突变体也表现出了与WT不同的细胞定位, L41P
明显的核膜定位, L220P明显的质膜定位以及它的
AP聚集量增多, L237P均匀的散点分布, 这些表型说
明NOK基因的不同的双亮氨酸模体位点可能影响
了细胞的内吞作用和运输功能, 并改变了NOK蛋白
与肿瘤形成方面相关的作用机制。我们也将在后续
的实验中进一步深入地研究这些突变体与不同的细
胞器标志物共定位情况, 来进一步探究它们影响细
胞内吞作用及运输的机理。而NOK具有原癌基因的
特性, 也预示着可以在后续实验中进行不同突变体
的裸鼠成瘤实验, 从动物学水平检测不同突变位点
对NOK基因的成瘤能力的影响, 从而进一步探究它
们影响NOK基因的原癌基因特性, 希望能够从这个
切入点指导肿瘤的治疗。
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