全 文 ：第 20卷 第 7期
Vol.20 No.7
2014年 7月
July.2014Guiding Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy
壮丽含笑活性成分的提取分离及
抗菌活性的研究
柳吉玲
（梧州红十字会医院，广西 梧州 543002）
[摘要] 用溶剂提取和色谱技术进行分离（柱层析LSC，薄层层析TLC）壮丽含笑中具有抗菌活性的活性段，并用琼脂打孔
法和二倍稀释法测定其活性段对标准金黄色葡萄球菌、标准大肠埃希菌、标准铜绿假单胞菌、标准白色念珠菌以及临床分离
得到的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的体外抑菌效果。利用活性导向继续分离有活性的色谱段并追踪到活性单体。这对从植
物中寻找抗MRSA的活性成分具有指导意义。
[关键词] 壮丽含笑；含笑属；MRSA（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌）；MIC（最低抑菌浓度）；MBC（最低杀菌浓度）
[中图分类号] R284.2 [文献标识码] A [文章编号] 1672-951X（2014）07-0080-03
Extraction on Chemical Composition of Michelia Lacei and Research
on its Antibiotic Activity
LIU Ji-ling
(Wuzhou Red Cross Hospital, Wuzhou Guangxi 543002)
[Abstract] To extract with organic solvents and separate by chromatographic techniques (column chromatography, LSC;
thin layer chromatography, TLC), the antibacterial active extract and section from Michelia lacei extract activity were studied.
And the agar diffusion method and double dilution method were used to determine antibacterial activity against standard
Staphylococcus aureus, Methicillin -resistant Staphylococcus aureus isolated from clinical samples, standard Escherichia coli,
standard Pseudomonas aeruginosa, and standard Candida albicans in vitro experiments. Active-oriented method was applied to
separate active chromatographic section and finally to obtain the active monomer. This experiment is helpful for finding anti-
MRSA ingredients from plants.
[Key words] Michelia lacei; Michelia L MRSA（Methicillin Resistant Staphylococcus aureus）； IC (minimum inhibitory
concentration); MBC (minimum bactericidal concentration)
近年来，抗生素在感染性疾病的治疗中做出了巨大贡献，
但同时随着其在临床上的长期、广泛使用，尤其是不合理应
用，使得毒副作用日益突出，细菌对抗生素耐药的现象也越
来越严重，单一的使用抗生素已经不能满足广大病人的需
要，人们渐渐开始重新关注中药的抗菌及其与抗生素联合抗
菌的作用[1-3]。含笑属是木兰科含笑族（tribe Michelieae）含笑
亚族（sutribe Micheliinae）植物，约有80种，是木兰科中的第二
大属。分布于亚洲热带及亚热带。我国约有70种，主要产于西
南部至东部，以西南部较多；适宜生长于温暖湿润气候、酸性
土壤，为常绿阔叶林的重要组成树种[4-5]。而壮丽含笑（Micheli－
a lacei）为含笑属（Michelia）植物中较原始而特殊的种类[6]，为
常绿乔木，分布于我国云南西南部，生于海拔1500 m的林中，
枝粗壮，花梗具佛焰苞状苞片约5枚，心皮狭卵圆形具3-4 mm
的花柱等特征。含笑花具有祛淤生新,活血止痛之功效[7]。临床
上主要用于治月经不调，痛经，胸胁间作痛。
含笑属中主要含有单萜和倍半萜以及它们的含氧衍生
物，含量较大且结构种类繁多，且倍半萜类化合物的含氧衍
生物多有较强的香味和生物活性[7-8]。其中分离出的大多数倍
半萜内酯，如匙叶桉叶油醇、小白菊内酯 [9-10]被证明有抗菌、
抗癌等生理活性。另有部分学者研究含笑花、叶、根茎的挥
发油并对其成分进行分析鉴定，发现含笑挥发油的成分主要
为倍半萜类化合物[11]。含笑花挥发油化学成分包括醇类、烯烃
类化合物及少量烷烃及酯类。含量最高的化合物为：橙花叔
醇（76.37％）、紫穗槐烯（6.38％）、δ-杜松烯（4.26％）、α-胡椒烯
（1.40％）[12]。程永现等通过初步的药理筛选，发现壮丽含笑
的脂溶性提取物对两种人肿瘤细胞株HCT-8及SIHa的抑制效
果较好，在此基础上他们从壮丽含笑嫩枝的乙醇提取物中分
离得到6个化合物，包括5个倍半萜及1个苯丙素苷。其中5个
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DOI:10.13862/j.cnki.cn43-1446/r.2014.07.030
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是倍半萜类化合物分别为香树醇、异香树醇、匙叶桉叶油醇
（spathuleno1）、小白菊内酯（Parthenollde）和11，13-de-hy－
dro1anuginolide[13]。且研究表明其中的spathulenol有中等抗真
菌活性[14]，Parthenollde有较强的细胞毒活性、5-HT拮抗作用
和抑制平滑肌收缩作用等。但壮丽含笑的抗菌活性，尤其是
抗耐药菌活性的研究暂未见报道。本次实验主要是从天然药
物壮丽含笑中分离提取出活性段或活性单体，针对细菌做药
敏实验，考察其抗菌活性，这对从植物中寻找抗MRSA的活性
成分具有指导意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 仪器 薄层层析硅胶板（青岛海洋化工厂分厂，规格：50
mm×100 mm，活度：三色分开，厚度：0.20-0.25 mm，批号：
20071101）、HHS-Ⅱ电热恒温水浴锅（山西省文水医疗器械
厂）、SB-2000减压旋转蒸发器（上海爱明仪器有限公司）、
WFH-203三用紫外分析仪（上海精科实业有限公司）、SHB-
Ⅲ 循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）、
FA1004N电子天平（上海精密科学仪器有限公司）、托盘天平。
微生物培养皿、Ⅳ型微量加样器（上海求精生化仪器有限公
司）、PYX-PHS-4050搁水式电热恒温箱（上海市跃进医疗器
械一厂）、CHA-213电子显微镜（日本OLYMPUS）、YXQ-
SG41-280电热手提压力蒸汽消毒器（上海医用核子仪器厂）、
SW-CJ-IB净化工作台（苏州净化设备厂）、移液枪。
1.1.2 试药 壮丽含笑的干燥嫩枝叶（由成都军区昆明总医
院提供）。国际标准菌株：金黄色葡萄球菌（ATCC25923）、大
肠埃希菌（ATCC25922）、铜绿假单胞菌（ATCC27853）、白色念
珠菌（ATCCY0109）（中国药品生物制品检定所提供）；耐甲氧
西林金黄色葡萄球菌：MRSA 92、MRSA 135、MRSA 144、
MRSA 8（成都军区昆明总医院药学部微生物室提供）。石油
醚、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、正丁醇、蒸馏水、二甲基亚砜（天津
化学试剂有限公司，批号：W20060720）、M-H水解酪蛋白琼
脂（杭州天和微生物试剂有限公司，批号：091104）、M-H肉汤
（杭州天和微生物试剂有限公司，批号：20100413）、沙保罗氏
琼脂（杭州天和微生物试剂有限公司，批号：080826）、80-100
目硅胶、200-300目硅胶（青岛海洋化工厂分厂，批号：00591）。
1.2 方法
1.2.1 实验溶液的配制 取壮丽含笑粗粉（3920 g），用80%
乙醇冷浸（第1次1周，后4次各浸泡3 d），合并提取液，回收乙
醇，得浸膏（355 g）。加蒸馏水（355 mL）溶解后用石油醚、乙酸
乙酯、正丁醇依次与水层进行萃取得不同极性的样品，回收
溶剂。各层样品减压旋蒸蒸干并用无水乙醇把残存水分带
走。各取50 mg用1000 μL二甲基亚砜溶解完全后做标准菌
的抑菌试验并观察。将乙酸乙酯层（39.3 g）进行硅胶柱层析，
以不同比例的洗脱剂进行梯度洗脱。把乙酸乙酯层样品刮出
用少量甲醇溶解并与80-100目的硅胶以1∶1比例混合均匀，放
入通风橱中风干后研磨成细粉待用。以拌样后样品: 硅胶
（200-300目）=1∶20比例用800 g硅胶（200-300目）装柱，边倒
入硅胶边敲打层析柱，使硅胶紧实后上样，保证硅胶面及样
品面均匀平整。用石油醚、乙酸乙酯及乙酸乙酯甲醇系统进
行度洗脱，根据薄层层析点样情况进行合并。
1.2.2 活性观察 通过药物敏感性实验结果显示壮丽含笑
的乙酸乙酯萃取相的N段的活性较强，因此对以组分再进行
硅胶柱层析，以不同比例的氯仿和甲醇作为洗脱剂梯度分别
洗脱N段，结果得到11个不同极性的组分。（见图1）
图1 分离过程
1.3 体内药物敏感性试验
1.3.1 琼脂打孔法(初筛) 药液的制备：取样品（各50 mg），
用二甲亚砜作溶媒，配成1 mL的药液。取制备好的MH琼脂培
养基进行编号打孔，直径为5 mm。以无菌棉签试取已制备好
的细菌浓度为1.5亿CFU/mL的7种菌株（3株标准和4株耐药）
和真菌浓度为1×106CFU/mL的1株真菌（1株标准白色念株菌）
均匀涂布于相应的培养基上，用加样枪将已配好的药液约50
μL按编号加入孔中。将培养皿置于35℃恒温箱中培养18-24
h后取出观察，用直尺测量抑菌圈直径，记录实验结果。根据
药理学试验方法, 抑菌圈＜10 mm的为抗药，＝10 mm的为轻度
敏感，11-15为中度敏感，＞16 mm的为高度敏感，由初筛结果
选出的抑菌圈最大的段测定其MIC和MBC。
1.3.2 倍比稀释法测定MIC和MBC 根据打孔法得到的实验
结果及样品的量，采用倍比稀释法测定活性较好的样品的
MIC和MBC。从打孔法得到的结果并查阅文献估算测定MIC时
的首孔浓度，计算所需的样品的量并称取，用不超过30%的
DMSO溶解，然后加入适量的培养液配成1024 μg/mL的溶液，
震荡器混匀。在超净化工作台上，取无菌96孔板（紫外灭菌），
在每个板的第1列（即最左边一列）用加样枪加入200 μL培养
液作为阴性对照，最后一列加入100 μL培养液和100 μL菌液
（即最右边一列）作为阳性对照；从第二列到第十一列采用倍
比稀释法加入药液（每列先各加100 μL培养液，从第二列开
始加入20 mg/mL的药液100 μL，混匀后吸出100 μL加入下一
孔，依序倍比稀释，弃去最后的稀释液体100 μL），然后在第
二列到第十一列每孔加入100 μL菌液，混匀。最后放置于35
℃恒温箱中培养18-24 h后取出进行观察，肉眼可见清澈透明
者视为无菌生长（实验前药液清亮透明），药液不澄清的需涂
玻片在显微镜下加以观察，以无细菌生长的最低药物浓度为
该药物的最低抑菌浓度（MIC）。
确定MIC后，把上述每排MIC前3孔用接种环移种于琼脂平
板作为次代培养（真菌用沙保罗氏平板）。经35℃培养18-24 h
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后观察在接种平板上生长菌落不超过5株即为最低杀菌浓度
（MBC）。记录各活性组分的MIC和MBC值。
2 实验结果
2.1 壮丽含笑不同溶剂萃取段的初筛结果 见表1。
表1 壮丽含笑不同溶剂萃取段对四种标准菌株的抑菌试验
结果 [抑菌圈直径:（mm）]
萃取相 浓度 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 铜绿假单胞菌 白色念珠菌
（mg/mL） ATCC25923 ATCC25922 ATCC27853 ATCCY0109
石油醚 50 12.0 10.0 -- --
乙酸乙酯 50 19.0 -- 9.0 8.0
正丁醇 50 22.0 6.0 12.0 10.0
水 50 19.0 -- 10.0 7.0
注：“-”表示无明显的抑菌圈。
2.2 壮丽含笑乙酸乙酯部分粗分物的药敏性试验结果 见
表2。
表2 壮丽含笑乙酸乙酯部分粗分物对四种标准菌株和四种
耐药菌株的抑菌试验结果 [抑菌圈直径：（mm）]
浓度 金黄色 铜绿假 大肠 白色 MRSA MRSA MRSA MRSA
分离段 葡萄球 单胞菌 埃希 念珠
(mg/mL) 菌 菌 菌 144 135 8 92
A(0.0563g)
B(2.4311g)
C(0.2942g)
D(2.9769g)
E(3.8518g)
F(1.4850g)
G(2.4567g)
H(1.5446g)
I(1.2905g)
J(3.0100g)
K(2.4147g)
L(6.1715g)
M(3.0000g)
N(1.6157g)
O(1.7116g)
P(2.0732g)
3 讨 论
本实验通过取壮丽含笑粗粉用80%乙醇冷浸提取，回收乙
醇，得浸膏。加适量蒸馏水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁
醇萃取，回收溶剂。结果显示，四个萃取部位都对标准金黄色
葡萄球菌（ATCC25923）有抑制作用，抑菌圈直径在12-22 mm
之间，对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径正丁醇萃取部位最大，
乙酸乙酯和水层萃取部位次之，石油醚层的活性最差。但由
于水层和正丁醇层的物质极性较大，不易分离，所以选择活
性较好的乙酸乙酯层进行下一步分离。且根据初筛结果可知，
乙酸乙酯层对所测菌株有较好的抗菌作用，其对标准金黄色
葡萄球菌（ATCC25923）为高度敏感，对标准铜绿假单胞菌
（ATCC27853）为中度敏感，对标准白色念珠菌(ATCCY0109)
为轻度敏感。可见壮丽含笑乙酸乙酯层具有较好的抗菌活性。
再由乙酸乙酯层分离纯化获得A-P共16个组分，将不同
溶剂萃取段对四种标准菌株和四种耐药菌进行药敏实验。实
验结果可以看出，壮丽含笑乙酸乙酯层的粗分段抗菌活性（抑
菌圈直径：15 mm）与萃取段（抑菌圈直径：19 mm）相比，抗菌
活性有所减小。这可能是因为壮丽含笑本身含有较多的成分，
这些成分之间可能存在着协同的作用，导致初筛时含笑的抑
菌效果较好，而上了硅胶柱细分得到较纯的物质后的抗菌活
性却不是很好，具体的各成分之间的作用还有待做进一步研
究。但也可以看出，分离得到的B段和N段对不同菌株有着不
同的抑菌活性, 尤其是N段，不仅对金黄色葡萄球菌作用较
强，对耐药菌MRSA 144，MRSA 135，MRSA 8，MRSA 92也有较
好的抑菌效果，这表明壮丽含笑的乙酸乙酯部分中对标准金
黄色葡萄球菌活性较大的化合物对耐甲氧西林金黄色葡萄
球菌也有一定的活性,为未来从植物中寻找抗MRSA的活性成
分奠定了一定的基础。
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（收稿日期：2013-11-12 编辑：李海洋）
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