全 文 ：Vol. 32 No. 7
Jul. 2012
第 32卷 第 7期
2012年 7月
中 南 林 业 科 技 大 学 学 报
Journal of Central South University of Forestry & Technology
收稿日期：2012-03-14
基金项目：国家林业公益性行业科研专项 (201104033)
作者简介：吴雪琴 (1987—)，女，四川乐山人，硕士研究生；主要从事分子种群遗传学研究
通讯作者：徐刚标 (1965—)，男，安徽枞阳人，教授，博士；主要从事森林遗传学及林业生物技术研究
观 光 木 Tsoongiodendron odorum Chun 为 木
兰科观光木属常绿大乔木，是单种属古老孑遗树
种，是国家二级重点保护植物 [1]，对研究古代植
物区系、古地理、古气候都有重要的科学价值
[2]。该种分布区很广，湖南、江西南部、福建、广
东、广西、云南东部、海南等地均有零星分布，
其中，以南岭山地种群数量相对较多。近年来，
观光木研究主要集中在生物学特性、育苗造林技
术、生态学特性等方面 [3]，仅见黄久香等 [4-5]采用
RAPD(randomly amplifi ed polymorphic DNA) 研 究
观光木遗传多样性报道，但种群数量少，研究结
果难以代表整个物种的变异水平。
基于 PCR技术的 ISSR( inter simple sequence
观光木 ISSR-PCR 反应体系的建立及优化
吴雪琴 1，徐刚标 1，梁 艳 1，王家庆 2
(1.中南林业科技大学 生命科学与技术学院，湖南 长沙 410004；2.韶关国有河口林场，广东 韶关 512532 )
摘 要： 利用正交设计实验对影响观光木 ISSR-PCR扩增的主要因素 (模板 DNA、引物、dNTPs、Mg2+的浓度，
TaqDNA聚合酶的用量以及退火温度 )进行优化， 建立观光木 ISSR-PCR反应的最佳体系。结果表明 :最佳反应
体系 (20 μL)为 :模板DNA 50 ng，引物 0.4 μmol/L，dNTPs 0.25 mmol/L，MgCl2 2.5 mmol/L，Taq DNA聚合酶 1.25 U。
扩增反应程序为 :94 ℃ 预变性 5 min；94 ℃变性 1 min，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 90 s，35个循环；72 ℃ 延
伸 7 min；4 ℃ 保存。该反应体系的建立，为观光木遗传多样性分析提供了客观可靠的方法。
关键词： 观光木；正交优化； ISSR-PCR；遗传多样性
中图分类号： S718.46 文献标志码：A 文章编号：1673-923X (2012)07-0076-04
Establishment and optimization of Tsoongiodendron odorum ISSR-PCR
reaction system
WU Xue-qin1，XU Gang-biao1，LIANG Yan1, WANG Jia-qing2
(1.School of Life Science and Technology，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004，Hunan，China;
2. State-owned Hekou Forest Farm, Shaoguang 512532, Guangdong, China)
Abstract: Through the orthogonal design experiments, the important factors of the inter-simple sequence repeat PCR (ISSR-PCR)
amplifi cation system, such as DNA template，primers，dNTPs，Mg2+ concentration，dose of TaqDNA polymerase and annealing
temperature fi t for Tsoongiodendron odorum were optimized. The results show that the optimal reaction system by the volume of
20 μL was established as follows: 50 ng DNA template，0.4 μmol/L primers，0.25 mmol/L dNTPs，2.5 mmol/LMgCl2，1.25 U Taq
DNA polymerase. The PCR procedure was: pre-denaturing at 94 ℃ for 5 minutes，35 cycles of denaturation at 94 ℃ for 1 minute，
annealing at 55 ℃ for 30 seconds and extension at 72 ℃ for 90 seconds，with 7 minutes fi nal extension at 72 ℃ and then stored at 4 ℃ .
The orthogonal-based ISSR-PCR reaction system provided a reliable method for genetic diversity analysis in Tsoongiodendron odorum.
Key words: Tsoongiodendron odorum；orthogonal design；ISSR-PCR; genetic diversity
repeat)标记已成功地应用于种群遗传结构分析，
与 RAPD标记相比，ISSR比 RAPD重复性好 [6]。
为了建立观光木 ISSR-PCR反应的最佳体系，本研
究利用正交设计实验对影响观光木 ISSR-PCR扩增
的重要因素进行优化，旨在为采用 ISSR标记研究
观光木种群遗传多样性奠定实验基础。
1 材料与方法
1.1 材 料
材料于 2011年 4月底采集于贵州省黎平县。
采回的观光木新鲜叶片置于 -70 ℃冰箱中保存。
参照加拿大哥伦比亚大学（UBC）2006年公布的
DOI:10.14067/j.cnki.1673-923x.2012.07.030
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ISSR引物序列，由上海英俊生物技术有限公司合
成。经初步筛选出的 854号引物，即 (TC)8RG作
为此次反应体系优化实验的固定引物。
1.2 方 法
1.2.1 基因组 DNA提取与检测
观光木叶片基因组 DNA提取，采用改良
的 CTAB 法及参考文献 [4-8] 并略作改动。用
Eppendorf公司的 Biophotometer核酸蛋白分析仪
检测 DNA含量和纯度，用 0.8%琼脂糖凝胶电泳
检测提取的总 DNA质量，用 G-BOX紫外凝胶成
像系统观察 DNA是否污染并拍照记录。
1.2.2 ISSR-PCR扩增
以提取的观光木 DNA样品为模板，进行
ISSR-PCR扩增。扩增程序参考相关文献 [7]:94 ℃预
变性 5 min，接着进行 35个循环 :94 ℃变性 1 min，
53 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 90 s；循环结束后，72 ℃
延伸 7 min，4 ℃保存。
反应体系总体积为 20 μL，其中包括 1×PCR
Buffer，其它成分 (模板 DNA、dNTPs、Mg2+、引
物、TaqDNA聚合酶 )按照试验设计所分析的浓度
加入，不足 20 μL用超纯水补足。
1.2.3 ISSR-PCR扩增体系的单因素试验设计
为保证试验的准确性、可重复性和 ISSR-PCR
扩增效果，本实验对模板 DNA，Taq DNA聚合
酶、Mg2+、dNTPs、引物等 5个主要影响因子进行
优化筛选，通过单因素实验设计 (模板 DNA10～
60 ng、Taq DNA聚合酶 0.5～ 1.75 U、Mg2+ 1.0～
3.5 mmol/L、dNTPs 0.1～ 0.35 mmol/L、引物 0.1
～ 0.6 μmol/L)，分别设置 6个梯度，以基本扩增
体系为基础，每次改变一个因素，以确定该因素对
ISSR结果的影响。
1.2.4 ISSR-PCR扩增体系的正交试验设计
根据单因素实验的结果，设计正交试验方案，
最终确定 ISSR-PCR扩增的最佳反应体系。
1.2.5 ISSR-PCR扩增产物的检测
扩增产物采用 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，缓
冲液 1×TAE，电压 5 V/cm。当溴酚蓝指示剂距离
前沿约 2～ 3 cm时停止电泳，用 G-BOX紫外凝
胶成像系统观察并拍照记录。
2 结果与分析
2.1 DNA纯度与浓度
将 提 取 的 基 因 组 DNA 稀 释 100 倍， 在
UnicoTM UV-2102PC型紫外分光光度计上检测
260 nm和 280 nm的吸光值，计算所提取 DNA的
纯度和浓度。结果如表 1所示，所提取的 DNA的
OD260nm/OD280nm值在 1.6和 2.0之间，浓度和纯度
都符合 ISSR标记技术对 DNA质量的要求 [8]。
表1 DNA的紫外检测结果
Table 1 The ultraviolet absorption test of DNA
样品来源 OD260nm OD280nm OD260nm/OD280nm DNA浓度 /(μg·mL-1)
贵州黎平县 0.340 0.191 1.78 851
2.2 模板 DNA用量对 ISSR- PCR扩增结果的影响
20 μL PCR反应体系，设定 6个模板 DNA浓
度 (ng/20 μL)梯度 (10、20、30、40、50、60)，扩
增检测结果 (如图 1)表明 :在其它条件一致的情
况下，DNA模板量对 PCR扩增的影响较小，模板
DNA在 10～ 60 ng内均能扩增出条带。在浓度低
于和等于 40 ng时，扩增的条带亮度相对较低，清
晰度不高且条带较少。模板浓度50 ng与60 ng相比，
50 ng/20 μL扩增出的条带清晰明亮，多态性最高。
因此适宜的模板 DNA浓度为 50 ng/20 μL。
图1 不同模板 DNA浓度对ISSR-PCR的影响
Fig 1 Effects of different template concentrations on ISSR-PCR
2.3 Taq DNA聚合酶浓度对 ISSR-PCR扩增结果
的影响
Taq DNA聚合酶的用量对扩增反应起着决定
性的影响作用。本实验设置了 6个 Taq DNA聚
合酶浓度 (U)梯度 (0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、
1.75)，结果 (见图 2)表明：在 20 μL 反应体系
中，Taq DNA 聚合酶在 6 个递度范围内均得
到清晰的扩增条带，酶浓度在 1 .25U 时扩增
得到的条带最多，因此适宜的 Taq DNA聚合酶浓
度为 1.25 U/20 μL。
吴雪琴，等：观光木 ISSR-PCR反应体系的建立及优化78 第 7期
2.4 Mg2+浓度对 ISSR-PCR扩增结果的影响
Mg2+是 Taq DNA聚合酶的激活剂，酶对 Mg2+
的浓度非常敏感，其浓度将直接影响Taq酶的活性，
本实验设置了 6个Mg2+浓度 (mmol/L)梯度 (1.0、
1.5、2.0、2.5、3.0、3.5)，由扩增结果 (如图 3)可知：
在不同浓度下扩增出多态性条带有明显差异，浓度
在 2.0 mmol/L时，扩增的条带最多且清晰明亮；浓度
大于 2.0 mmol/L或小于 2.0 mmol/L时，均有部分条带
缺失，因此选择适宜的Mg2+浓度为 2.0 mmol/L。
较大差异。浓度越高的扩增出的条带越不清晰，浓
度过低的扩增的条带也不理想，浓度为 0.20 mmol/L
时，扩增的条带相对较多且清晰。因此选择适宜
的 dNTPs反应浓度为 0.20 mmol/L。
图 2 不同 Taq DNA聚合酶浓度对 ISSR-PCR的影响
Fig.2 Effects of different Taq DNA polymerase
concentrations on ISSR-PCR
图 3 不同 Mg2+浓度对 ISSR-PCR的影响
Fig.3 Effects of different Mg2+ concentrations on ISSR-PCR
2.5 dNTPs浓度对 ISSR-PCR扩增结果的影响
dNTPs是 PCR反应的原料，其浓度取决于扩
增片段的长度。本实验设计了 6个浓度 (mmol/L)
梯度 (0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35)，扩增结
果 (如图 4 )表明 :在不同浓度下，扩增的结果有
图 4 不同 dNTPs浓度对 ISSR-PCR的影响
Fig.4 Effects of different dNTPs’s concentrations on ISSR-PCR
2.6 引物浓度对 ISSR-PCR扩增结果的影响
引物用量对扩增产物的质量有着至关重要的
影响。本实验设计了 6个引物浓度 (μmol/L)梯度
(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6)，扩增结果 ( 见
图 5)表明 :不同的引物浓度对扩增结果有较大的
影响，浓度越低扩增条带越不清晰，且有部分条
带缺失，浓度在 0.4～ 0.6 μmol/L时，扩增效率
逐渐增高，条带较清晰，引物浓度为 0.6 μmol/L
时，条带相对最多最清晰，因此适宜的引物浓度
为 0.6 μmol/L。
图 5 不同Primer浓度对 ISSR-PCR的影响
Fig.5 Effects of different primer concentrations on ISSR-PCR
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2.7 ISSR-PCR正交实验结果
由单因素实验结果，按照正交试验表 L18(35)
设计 5因素 3水平实验进一步优化反应体系，结
果如图 6所示。在单因素优化的基础上，进行正
交设计实验能够扩增出较清晰的条带。在 18个处
理组中，第 8组设计的实验数据扩增的效果最好，
谱带最多而且清晰明亮，多态性高。
图 6 ISSR-PCR正交设计电泳图谱
Fig.6 Band patterns of orthogonal design of optimal ISSR-
PCR system
2.8 退火温度对 ISSR-PCR的影响
不同的引物有不同的退火温度，引物 UBC854
以其 Tm(Tm:56)值为中心，设置 6个退火温度梯
度 (53、54、55、56、57、58 ℃ )进行 PCR扩增，
由结果 (如图 8)得出，引物 UBC854在 55 ℃时，
扩增出的条带多而亮，而低于或者高于 55 ℃，
扩增的条带相对较少且亮度浅。因此，退火温度
的高低也直接影响着扩增反应的结果，观光木
ISSR反应体系中引物 UBC854最适宜的退火温度
为 55 ℃。
图 7 不同退火温度对 ISSR-PCR的影响
Fig.7 Effects of different annealing temperatures on ISSR-PCR
13个样品所提取的 DNA采用 L18(35)中第 8组设
计的数据进行 PCR扩增，扩增结果如图 8所示。
从图 8可知 :条带的多态性与清晰度好，说明该体
系能很好地满足观光木的 ISSR遗传多样性研究。
图8 其他13个样品扩增结果
Fig.8 Electrophoresis of PCR products of all 13 plant materials
3 结 论
ISSR 扩 增受模板、TaqDNA聚合酶、Mg2+、
dNTPs、引物等因素影响，退火温度的高低也直接影响
着扩增反应的结果，不同引物的最适退火温度不同。
本研究通过正交试验设计对影响观光木 ISSR-PCR扩
增的重要因素进行优化，建立了观光木 ISSR-PCR反
应的最佳体系 (20 μL):模板 DNA 50 ng、 TaqDNA
聚合酶1.25 U、MgCl2 2.5 mmol/L、dNTPs 0.25 mmol/L、
引物 0.4 μmol/L。扩增反应程序：94 ℃ 预变性 5
min；94 ℃变性 1 min，55 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 90 s，
35个循环；72 ℃ 延伸 7 min；4 ℃ 保存。该反应体系
的建立为观光木种质资源分类、遗传多样性分析以及
分子谱系地理学研究提供了更客观可靠的方法。
参考文献 :
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[本文编校：吴 毅 ]
2.9 最优体系的验证
为了验证优化后的体系，选取观光木的另外