全 文 ：文章编号:1001 － 4829(2012)05 － 1916 － 04
收稿日期:2012 － 05 － 15
作者简介:张福平(1978 －) ，男，讲师，从事家禽育种研究，E-
mail:zfu-1010@ 126． com。
贵州柳源香鸡 mtDNA控制区的遗传多样性分析
张福平1，朱秋劲2，王文涛1，蹇世舟3
(1．贵州大学 高原山地动物遗传育种与繁殖省部共建教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025;2． 贵州大学生命科学学院，贵州 贵
阳 550025;3． 三都水族自治县农村工作局，贵州 黔南州 558100)
摘 要:为研究柳源香鸡与瑶山鸡、黔东南小香鸡的亲缘关系，探讨柳源香鸡的起源和品种遗传多态性，采用 mtDNA D-loop序列变
异对柳源香鸡、瑶山鸡和黔东南小香鸡进行遗传多态性的研究。结果表明:A、G、C 和 T 等 4 种核苷酸的平均比例分别为 25． 22
%、13． 51 %、25． 82 %、35． 45 %;共发现 29 个变异位点(不包含种内变异位点) ，占分析位点总数的3． 71 %，其中18 个转换，11 个
颠换;具有 29 种单倍型，其中有 11 种共享单倍型。群体遗传多态性与亲缘关系分析表明，柳源香鸡个体具有瑶山鸡、黔东南小香
鸡的遗传贡献。
关键词:柳源香鸡;瑶山鸡;黔东南小香鸡;线粒体 DNA控制区;遗传多样性
中图分类号:S831． 2 文献标识码:A
Analysis of Genetic Diversity of mtDNA Control
Region in Liuyuan Chicken from Guizhou
ZHANG Fu-ping1，ZHU Qiu-jin2，WANG Wen-tao1，JIAN Shi-zhou3
(1． Key Laboratory of Animal Genetic，Breeding and Reproduction in the Plateau Mountainous Region，Ministry of Education，Guizhou
Guiyang 550025，China;2． College of Life Science，Guizhou University，Guizhou Guiyang 550025，China;3． Bureau of Countryside of
Sandu Shui People Autonomous Country，Guizhou Qiannan 558100，China)
Abstract:In order to research the genetic relationship of Liuyuan Chicken，Yaoshan Chicken，Qiedongnan Chicken，and the origin and ge-
netic diversity of Liuyuan Chicken，PCR and direct sequencing methods were used to analyze a part of mtDNA D-loop in Liuyuan Chicken，
Yaoshan Chicken and Qiandongnan Chicken． The results showed that the average nucleotide compositions of those three kinds of chicken
were A 25． 22 %，G 13． 51 %，C 25． 82 %，T 35． 45 % ． There were 29 polymorphic sites accounting for 3． 71 %，in which only transition
and transversion were found 18 and 11，respectively． Moreover，11 haplotypes were shared in 29 haplotypes among some chicken popula-
tion． Then Liuyuan Chicken was related to Yaoshan Chicken and Qiandongnan Chicken by analyzing．
Key words:Liuyuan chicken;Yaoshan chicken;Qiandongnan chicken;mtDNA control region;Genetic diversity
动物线粒体是重要的遗传信息载体，其 DNA是
共价闭合的环状 DNA，作为分子遗传标记，具有分
子结构简单、严格母系遗传、与核基因无共同序列、
无重组、碱基替换率低等特点［1 ～ 2］。线粒体 DNA控
制区是非编码基因区，在进化过程中受环境的选择
压力小，表现出进化速率快和母系遗传等特点，在鸟
类的分类研究中常用作种系发生的分子标记［3 ～ 5］。
柳源香鸡(原名三都土鸡)是经长期自然和三
都县水族人民人工选育而成的特色种质资源，主产
于三都水族自治县及周边地区。目前已有一定规
模，建立了保种场、选育场。2011 年全县推广柳源
香鸡 100 万羽。该鸡体型较小，结实紧凑，单冠平
头。公鸡颈羽金黄色，主翼羽黑色，鞍羽红色，背羽
红黑或红黄色，腹羽黑色。母鸡颈羽黄麻，尾羽和主
翼羽黑色，鞍羽、背羽、腹羽黄麻。目前有关柳源香
鸡的研究极少，陆宽等［6］对柳源香鸡鸡肉的水分、
灰分、蛋白质、粗脂肪、脂肪酸、氨基酸和维生素的含
量进行了测定，结果表明:柳源香鸡具有良好的营养
价值，利于人体吸收，味美质高。为研究柳源香鸡与
瑶山鸡、黔东南小香鸡的亲缘关系，探讨柳源香鸡的
起源和品种遗传多态性，进而为柳源香鸡的进一步
开发利用提供理论依据，笔者等采用 mtDNA D-loop
序列变异对柳源香鸡、瑶山鸡和黔东南小香鸡进行
6191
西 南 农 业 学 报
Southwest China Journal of Agricultural Sciences
2012 年 25 卷 5 期
Vol. 25 No. 5
DOI:10.16213/j.cnki.scjas.2012.05.080
了遗传多态性的研究。
1 材料与方法
1． 1 供试材料
1． 1． 1 鸡 试验用的柳源香鸡、瑶山鸡和黔东南小
香鸡由贵州省黔东南地区相关鸡种保种场提供(柳
源香鸡、瑶山鸡和黔东南小香鸡代码分别以 L、Y、X
开头，数字为翅号)。柳源香鸡、瑶山鸡和黔东南小
香鸡的样本数分别为 20、15 和 18 只。
1． 1． 2 试剂 主要试剂有 TIANamp Blood DNA Kit
试剂盒(大连宝生物) ，引物 L400 (5’-ATTTATT-
GATC GTCCACCTCACG-3’)、PHDH(5’-CATCTT-
GGCATCTTCAGTGCC-3’) (上海生工合成) ，肝素
钠、三羟甲基氨基甲烷、丙烯酰胺和 N，N-甲叉双丙
烯酰胺(北京鼎国)。
1． 1． 3 仪器与设备 超纯水仪(Casada LS，美国
Pall Life Science 公司) ，电子天平(FX-320，日本
METTLER TOLEDO 公司) ，凝胶成像系统(UV-
1000，北京宾达英创科技有限公司) ，紫外分光光度
计(BECKMAN NanoDrop-1000，美国 NanoDrop Technol-
ogies公司)，PCR仪(ABI 5100，美国 ABI公司)和格兰
仕微波炉(Wp700L17，中国顺德格兰仕公司)。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 PCR反应及测序 血样预处理。从鸡翅的
静脉采血 0． 5 ～ 1． 0 mL，肝素钠抗凝后于 4 ℃保存
备用。采用 TIANamp Blood DNA Kit 试剂盒提取血
样中的 DNA，用特异引物 L400(5’-ATTTATTGATC
GTCCACCTCACG-3 ’)、 PHDH (5 ’-CATCTTG-
GCATCTTCAGTGCC-3’)［7 ～ 8］进行线粒体 DNA 控制
区基因扩增(L、H 代表轻链和重链)。PCR 反应体
积为 25 μl，反应液中含 DNA样品 2 μl，上下游引物
各 0． 8 μl，2 × Taq PCR MasterMix 试剂 12． 5 μl，
ddH2O 8． 9 μl。PCR循环参数(30 循环)为 94 ℃预
变性 3 min，94 ℃变性 30 s，62 ℃复性 30 s，72 ℃延
伸 1 min，最后 72 ℃延伸 4 min。用 2 %琼脂糖凝胶
1 ～ 2 泳道为瑶山鸡，3 ～ 5 泳道为柳源香鸡，6 ～ 8 泳道为黔东南小香
鸡
lane 1 － 2，3 － 5 and 6 － 8 indicated Yaoshan Chicken，Liuyuan Chicken
and Qiandongnan Chicken，respectively
图 1 3 种鸡总 DNA琼脂糖凝胶检测
Fig． 1 The total DNA agarose gels electrophoresis from 3 different chick-
ens
1 ～ 3 泳道为瑶山鸡，4 ～ 6 泳道为柳源香鸡，7 ～ 9 泳道为黔东南小香鸡
Lane 1 － 3，4 － 6 and 7 － 9 indicated Yaoshan Chicken，Liuyuan Chicken
and Qiedongnan Chicken，respectively
图 2 3 鸡种 mtDNA控制区的 PCR 扩增产物琼脂糖凝胶检
测
Fig． 2 Agarose gels electrophoresis on the products of PCR amplification of
mtDNA control region from 3 different chickens
检测 PCR 产物。扩增产物经 TIANgel Midi Purifica-
tion Kit试剂盒回收纯化后进行测序，测序由上海生
工完成。
1． 2． 2 序列分析 对原始序列利用 Vector NTI
Suite 8 对 DNA序列进行对位排列，并经人工仔细核
查后，利用 DnaSP 4． 0 提取变异位点。利用 MEGA
4． 0 统计碱基组成［9］，以红色原鸡为外群(GenBank
登录号:NC_007236) ，构建 NJ分子系统发生树。
2 结果与分析
2． 1 3 种鸡总 DNA和 PCR产物的检测
(1)由图 1 可见，基因组 DNA 集中整齐，DNA
提取效果良好。
(2)由图 2 可见，PCR 扩增条带集中、整齐，说
明，PCR产物量较高，而且特异性良好。
H1 ～ H29 表示单倍型编号，圆点表示与单倍型 H1 有相同碱基，数字
表示单倍型变异位点
H1 － H29 represented the haplotypes’number． Dots indicated that the
same nucleotide and number showing the variation positions
图 3 3 个鸡群体线粒体 DNA控制区的单倍型及变异位点
Fig． 3 Haplotype and variation sites of mtDNA control region from 3 dif-
ferent chickens
71915 期 张福平等:贵州柳源香鸡 mtDNA控制区的遗传多样性分析
表 1 3 个鸡群体线粒体 DNA控制区序列的碱基含量
Table 1 Nucleotide composition of mtDNA control region from 3 different chickens
物种
Species
碱基含量(%)Nucleotide composition
A T G C
柳源香鸡 Liuyuan chicken 25． 20 35． 40 13． 55 25． 85
瑶山鸡 Yaoshan chicken 25． 29 35． 42 13． 44 25． 84
黔东南小香鸡 Qiandongnan chicken 25． 19 35． 52 13． 53 25． 76
t －检验 t-test t = 1． 24，P = 0． 102 t = 1． 46，P = 0． 119 t = 1． 37，P = 0． 112 t = 1． 28，P = 0． 110
2． 2 3 种鸡 mtDNA D-loop区序列的变异
用 Vector NTI Suite 8 对原始 DNA 序列进行对
位排列和剪切对齐后发现，柳源香鸡、瑶山鸡和黔东
南小香鸡 53 个个体线粒体 DNA控制区序列大小约
为 780 bp，以其中任一单倍型 H1 作为标准进行分
析，确定了 29 种单倍型，其中 9 种为共享单倍型。
由图 3 可见，共有 29 个变异位点，占分析位点总数
的 3． 71 %，包括 18 个转换(分别是 12 次 T-C 间转
换，6 次 A-G间转换)和 11 个颠换(A-T 间 3 次，A-
C间 6 次，G-C间 2 次) ，没有检测到 G-T间的颠换。
2． 3 3 种鸡 mtDNA D-loop区序列的碱基组成
由表 3 可见，柳源香鸡、瑶山鸡和黔东南小香鸡
线粒体控制区序列 A、G、C 和 T 等 4 种核苷酸的平
均比例为 25． 22 %、13． 51 %、25． 82 %和 35． 45 %。
其中，T 含量最高，表现出 mtDNA D-loop 区碱基组
成的偏倚性。3 种地方鸡群体的 mtDNA D-loop 序
列中 C 和 T 间的转换较多，但 t-检验显示，3 种鸡
mtDNA控制区的碱基含量差异不显著。
2． 4 3 种鸡 mtDNA D-loop序列的系统发生树
依据测定的序列，以红色原鸡为外群，构建柳源
香鸡、瑶山鸡和黔东南小香鸡的 NJ 分子系统发生
树。从图 4 可以看出，柳源香鸡群体分为 3 部分:大
部分聚为一支;小部分与黔东南小香鸡或瑶山鸡聚
为一支。
3 结论与讨论
(1)试验结果表明，柳源香鸡、瑶山鸡和黔东南
小香鸡线粒体控制区全序列的 A + T 含量均高于 G
+ C，这与鸡的 mtDNAD-loop区是 A + T富含区相一
致［10 ～ 11］。
图 4 3 种鸡群体 mtDNA D-loop序列 NJ分子系统树
Fig． 4 NJ phylogenetic tree constructed from mtNDA D-loop identified in 3 chicken populations
8191 西 南 农 业 学 报 25 卷
(2)试验结果还表明，柳源香鸡群体大部分个
体聚为一支，说明，其具有自身相对独立的线粒体遗
传特征。部分个体在分子系统树上与其他 2 种贵州
地方鸡种聚在一起，这可能是由于柳源香鸡保种群
组建时，鸡只均是以外貌特征为主从农户手中收集
而来，3 种鸡产地相邻，有血缘混杂情况出现。
(3)贵州有着丰富的地方鸡种资源，2006 年由
贵州省农业厅组织调查的贵州地方鸡种就有 9 个。
传统的分类主要以体型外貌特征及产地为依据。但
随着外来鸡种的引进，以及各地交通条件改善，不同
地区的鸡种均有不同程度的混杂，许多地方品种逐
步减少甚至濒危或灭绝(如高脚鸡、威宁鸡) ，从表
观特征区分存在一定的片面性，所以应加强基础研
究，借助分子生物学技术对这些鸡种进行合理的分
类、保存、选择，组群、育种。
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(责任编辑 王 海)
91915 期 张福平等:贵州柳源香鸡 mtDNA控制区的遗传多样性分析