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烟草与罗勒科间远缘杂交育种的研究



全 文 :J.SHANXI AGRIC.UNIV.(Natural Science Edition)
学报(自然科学版)2014,34(1) 003089
收稿日期:2013-09-02   修回日期:2013-10-10
作者简介:杨进文(1974-),男(汉),山西岢岚人,副教授,硕士,研究方向:作物遗传育种。
通讯作者:魏治中,教授。Tel:13835462718;E-mail:zhi_zhong_wei@126.com
基金项目:国家烟草专卖局重点项目(国烟科[1999]432号);育种基金(2004078)
烟草与罗勒科间远缘杂交育种的研究
杨进文,魏治中
(山西农业大学 农学院,山西 太谷030801)
摘 要:利用烟草与药用植物罗勒进行科间远缘杂交,以期培育出含医药成分的新型烟草,以缓解吸烟与健康的矛盾。
采用无性与有性杂交相结合的方法,克服其杂交不孕问题。经酶谱测定,杂种稳定品系含有亲本药用植物的遗传物
质;镜检(F1~F18)细胞染色体呈杂合状态;经医药成分鉴定均含有药用植物亲本中相应的医药成分,并产生了新的医
药成分;烟叶评吸具有药物香气。化学成分测定结果表明,罗勒烟具有低糖,中、高烟碱含量的特点。经卷烟企业验证
其可用性,具有较高的应用价值。
关键词:新型烟草;科间杂交;医药成分
中图分类号:S572  文献标识码:A  文章编号:1671-8151(2014)01-0010-07
Study on Distant Hybridization between Tobacco and Coimum bailicmL
Yang Jinwen,Wei Zhizhong
(College of Agriculture,Shanxi Agricultural University,Taigu Shanxi 030801,China)
Abstract:The distant hybridization between tobacco and medical plants such as Coimum bailicmL is expected to breed a
new-type of tobacco which contains medical ingredients so as to aleviate the adverse effects of smoking.In this study,
the hybridization method of combining the asexuality with sexuality is used to cure the infertility.The results show that
by the measurement of zymogram,the stable strain of the hybrid contains genetic materials from the parental medical
plants.By means of the microscope detection,(F1~F18)cel chromosome takes on heterozygosis.By determination of
the medical ingredients,al stable strains contain corresponding medical ingredients which are from the parental medical
plants,with the production of new medical ingredients and medical aroma.The result of the analysis of chemical ingre-
dients shows that new-type tobacco has characteristics of low-sugar,middle and high nicotine content.It is validated by
cigarette-producing enterprises that new-type tobacco has applicability and comparably high value in utilization.
Key words:New-type tobacco;Hybridization of families;Medical ingredients
  科间远缘杂交是引进外源基因、创造变异、拓
宽烟草品质及抗性育种遗传基础的有效手段之一,
也是形成新物种的重要途径。因此,利用药用植物
与烟草进行科间远缘杂交,培育含医药成分的新型
烟草,以期达到通过吸烟对某些疾病起到一定的缓
解作用,育种实践证明培育这样的新型烟草是可行
的。我国远在殷商时期已利用“燃、熏、吸”中草药
的方法治疗某些疾病,并沿用至今,效果良好。这
说明我国很多中草药具有安全无毒,可以随烟气吸
入人体起到某些治疗作用。我国药物型卷烟研讨
会(1986年8月24日)纪要中指出:“经临床试验,
观察,药物型卷烟对某些疾病具有一定的缓解作
用,因而受到患有某些疾病,但又难以戒除吸烟习
惯的消费者的欢迎”。可以肯定,培育含多种医药
成分的新型烟草,与目前药物型卷烟相比,可以节
省大量中草药,降低卷烟成本费用,其发展前景是
广阔的。新型烟草问世,不仅为烟草育种开辟了新
途径,对生物遗传理论的研究也具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料
  罗勒(唇形科,N=24,Comun bailicuml)含植
DOI:10.13842/j.cnki.issn1671-8151.2014.01.014
物醇、柠檬烯、罗勒烯、β-丁香烯等医药成分,具有
止咳、平喘、抑癌、解毒、消炎、止痛等功效;普通烟
草(茄科 N=24,Nicotiana tobacum L);红花烟:
烤、晒兼用品种,抗逆力强,早熟,产质较好;78-
05:早熟品种,有一定香气,落黄快,抗逆力强。
1.2 方法
采用无性嫁接与有性杂交相结合的方法进行
远缘杂交。
1.2.1 染色体鉴定
取花蕾长度4~9mm,放入混合溶液中(95%
酒精∶氯仿∶冰醋酸=6∶3∶1,体积比),固定24
h,然后投入70%的酒精中,置4℃条件下贮存48
h,制片观察,显微镜下拍照。利用萌发的种子幼
根,长约2mm,将萌发种子整体投入饱和的对二
氯苯溶液中,预处理2h,然后用卡诺氏溶液固定
20h,再转入70%酒精中贮存备用。制片时,将根
尖用5NHCl在常温下解离10min,45%的醋酸
软化15min,再用醋酸洋红染色压片,然后立即观
察体细胞染色体并在显微镜下拍照。
1.2.2 同工酶分析鉴定
采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)法分析脂
酶同工酶和过氧化物酶同工酶。
1.2.3 医药成分测定
检验设备:色-质联机,检测依据:四极质谱分
析方法通则,对其挥发油进行定性、定量分析。
1.2.4 单料卷烟的烟气定性定量检测
采用检测设备为色-质联机,检测依据:四极
质谱分析方法通则。
1.2.5 烟叶化学成分测定
采用化学连续自动分析仪(比色法),原理是依
据光对各种化学成分吸收程度的不同而得到结果。
1.2.6 卷制成品烟气检测及评吸
卷制成品烟气检测由国家烟草质量监督检测
中心进行,卷制成品的评吸由郑州烟草研究院评吸
委员会进行。
2 结果与分析
2.1 远缘杂交
2.1.1 无性与有性杂交相结合
利用砧木影响接穗的新陈代谢,促进雌蕊接受
花粉的代谢作用,采用无性与有性杂交相结合的方
法,结果表明,提高了杂交成功率,并增加了蒴果中
的种子数量及千粒重(表1),反映出该杂交方法有
利于双亲基因间的渐渗和交流。如果结合重复受
粉,其蒴果中种子数量增加更明显。多数杂种一代
回交后,千粒重、种子数量都有增加的趋势。
表1 嫁接后有性杂交对蒴果中种子数量和千粒重的影响
Table 1 The effect of graft and hybridization on tobacco
ftuit
材料
Stuff
单果种子粒数
Seed numbers
千粒重
1000weight/g
红花烟 1371.0  0.0932
罗勒 4.0  3.445
红花烟×罗勒 秕子
(番茄+红花烟)×罗勒 429.0  0.05828
(番茄+红花烟)×罗勒BC1  808.0  0.06457
2.1.2 最佳授粉环境的选择
研究结果表明(表2),烟草与罗勒科间远缘杂
交,在早晨或傍晚温度较低(22~25℃)、相对湿度
较大(70%~80%)的环境条件下,杂交成功率较
高。选择低温、高湿环境进行人工授粉是烟草与药
用植物科间杂交的重要条件之一,如果结合重复授
粉,更利于提高杂交的成功率 。
表2 不同温度和湿度条件下杂交成功率比较
Table 2 Comparation of cross successful ratio in different temperature and moisture
材料
Stuff
温度
Temperature/℃
相对湿度
Relative
humidity/%
杂交花数
Hybrid flower
numbers
成果数
Fruit numbers
成功率
Success
rate/%
(78-05+红花烟)
×罗勒
15~17  70~80  41  11  26.8
22~25  60~70  31  3  9.6
22~25  70~80  45  19  44.4
22~25  71~80  31  13  41.9
30~33  70~80  41  3  0
22~25  81~90  37  5  13.5
1134(1) 杨进文等:烟草与罗勒科间远缘杂交育种的研究
2.1.3 烟草品种杂交亲本的选择
烟草远缘杂交实践表明,利用烟草品种与罗勒
进行科间远缘杂交,常因烟草品种不同,杂交成功
率差异很大。有些品种杂交后,蒴果中种子数量的
多寡差异悬殊(表3)。有些烟草品种杂交后,能结
蒴果,但无种子。因此,深入探讨烟草品种杂交后
的亲和性,对开展烟草远缘杂交育种至关重要。
表3 不同烟草品种的杂交效果
Table 3 Effect of hybridization on different tobacco varieties
材料
Stuff
杂交花数
Hybrid flower number
成果数
Fruit numbers
成功率
Success rate/%
(猪耳朵+宾县柳叶尖)×罗勒 27  2  7.4
(猪耳朵+红花大金元)×罗勒 30 秕子
(苛岚小叶+净叶黄)×罗勒 26 秕子
(代县小叶+晋太56)×罗勒 23 秕子
(浑源小叶+龙烟二号)×罗勒 22  6  27.2
(黑老虎+红花烟)×罗勒 25  9  36.0
2.2 杂种的育性及其性状表现
2.2.1 杂种植株部分不育
杂种F3 之前的群体中约5%的植株只开花不
结种子。开花期间,花易落,并有部分花蕾枯萎,花
序小,一般每个花序只有1~3朵花,但花朵大,雌
蕊2枚,雄蕊5~6枚。
2.2.2 杂种植株完全能育
F3 以前的群体能育植株中,其主要植物学性
状具有不同程度变异,主要表现为生育期缩短,烟
草与罗勒杂交的部分杂种后代中,花朵大,雌蕊6
枚,雄蕊1~3枚,花冠有裂缝,花冠弯曲。在能育
的植株中,约70%的植株花序较大,且松散,生育
期与亲本之一的烟草相近;靠近花序的一片叶子较
大且呈月牙形,并围绕花序生长;腋芽生长势强,腋
芽数量多,这与药用植物罗勒的特性有直接关系。
杂种F3 代之前,蒴果大、果柄长、花萼大、蒴果中种
子数量较少,一般500~1200粒。F7 代之后这种
变异很少见,杂种F7~F12的部分株系,在30℃左
右环境条件下开花、结蒴果并有种子,15~20℃的
环境条件下,易落花、落果,甚至只开花不结种子,
花朵小,花柱短,但人工回交授粉后易结蒴果并有
少量种子。
2.2.3 杂种主要农艺性状的表现
根据育种目标对杂种后代的逐代选择,F10以
后其主要农艺性状,如植株高度、叶片大小、单株叶
数、生育期、株型等与亲本之一的烟草相似,只有个
别性状倾向于药用植物亲本,如叶形、叶色深绿、腋
芽生长数量多、叶片脆等,见图1。这些现象在烟
草与药用植物科间杂种后代及其稳定品系中,屡见
不鲜。
图1 烟草与罗勒科间杂种性状变异
Fig.1 Variation of Traits distant hybrid between tobacco and Coimum bailicmL
2.3 细胞染色体的鉴定
镜检结果表明(图2):杂种F1,回交一代至二
代及其稳定品系,其细胞染色体皆呈杂合状态,但
不同的杂交组合及其后代,细胞染色体的杂合程度
21 山 西 农 业 大 学 学 报(自然科学版) 2014
相差较大。如(番茄+红花烟)×罗勒,该杂交组合
F1 花粉母细胞染色体数目有10个类型:分别为
N=20,22,24,260,32,34,36,38。该杂交组合的双
亲花粉母细胞染色体皆为N=24。而F1 中N=24
的只占30%左右,并且在一些细胞染色体中有非整
倍体存在,当采用药用植物亲本罗勒(N=24)回交,
其回交一代(BC1)在染色体数目类型中,F1 的染色
体数目类型N=24由30%左右增加到61.10%。从
F8~F15有许多株系的主要农艺性状渐趋稳定,主要
农艺性状的标准差和变异系数与对照烟草品种G-
28和NC95基本接近。F18代的细胞染色体仍呈杂
合状态。这种现象在烟草与紫苏(唇形科)、薄荷(唇
形科)、土人参(马齿苋科)、黄芪(豆科)的科间远缘
杂交种后代中具有普遍性。
图2 罗勒及其杂种后代稳定品系的染色体数目
Fig.2 Chromosome numbers of stable lines between Coimum bailicmL and hybid progeny
2.4 酶谱测定
为确定药用植物亲本罗勒的遗传信息是否已
进入杂种后代中,对稳定品系及其双亲进行了酶谱
测定。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)方法,对
酯酶同工酶进行多次分离、分析。结果表明(图
3),共16条谱带,其中,子代罗勒烟与父本有5条
共同带,三者有3条共同带。即父母本的遗传物质
分别遗传给了子代,由于双亲基因互作,子代产生
了新带,说明罗勒烟是红花烟和罗勒杂交的后代。
实验重复3次,结果相同。
图3 罗勒烟及其双亲酯酶酶谱
Fig.3 Esterase isozyme zymogram figure of Coimum bailicmL Tobacco
2.5 医药成分的测定
测定结果表明(表4,由吉林大学基础医学院
化验测定):烟草与药用植物科间远缘杂交后,药用
植物的医药成分遗传给杂种后代的能力是不同的。
由于双亲基因互作,杂种后代稳定品系罗勒烟产生
了新医药成分(松油醇和金合欢烯)及香料成分(古
云烯-γ-环氧化物)。
3134(1) 杨进文等:烟草与罗勒科间远缘杂交育种的研究
表4 罗勒烟及其亲本医药成分测定
Table 4 The determining rerult of medicinal components coimum bailicmL.tobacco and parents
名称
Name
母本烟含量
Female parent
tobacco/%
罗勒烟含量
Coimum bailicmL.
tobacco/%
罗勒叶含量
Coimum bailicmL.
leaf/%
作用及用途
Function and purpose
柠檬烯 - 微量 微量 对肺炎双球菌,甲型链球菌等有抑制作用
β-丁香烯 - 0.08  0.85 平喘镇咳
罗勒烯 - 微量 0.08 解热解毒活血止痛
香薷酮 - 0.4  10.68 具有特殊香气
α-松油醇 - 0.67 - 止咳平喘
金合欢烯 - 0.1 - 消炎止咳
古云烯-γ-环氧化物 - 0.04 - 香味料
2.6 化学成分的测定
灵丘县4个普通烤烟样品及垣曲县5个烤烟
品种与在该地区连续3年种植的罗勒烟,对其进行
比较(表5)。在灵丘种植的罗勒烟,总糖4.11%,
烟碱3.06%;在垣曲种植的罗勒烟,总糖14.83%,
烟碱2.51%,分别比普通烟草品种的总糖含量低
29.92%和 11.76%,而 烟 碱 分 别 高 2.22% 和
0.26%,反映出罗勒烟具有低糖,中、高烟碱的特点。
表5 普通烤烟与罗勒烟化学成分的比较
Table 5 The comparing of chemical components of tobacco and medicinal tobacco
地区
Area
类型
Type
总糖/%
Overal
sugar
烟碱/%
Overal
alkali
总氮/%
Overal
nitrogen
糖/碱
Ratio of
sugar and
alkal
氮/碱
Ratio of
nitrogen
and alkal
钾/%
Kalium
氯/%
Chlorine
钾/氯
Ratio of
kalium and
chlorine
灵丘县
烤烟平均值 34.03  0.84  1.13  40.05  1.27  1.21  0.36  3.36
罗勒烟 4.11  3.06  2.59  1.64  0.87  1.24  0.96  2.62
垣曲县
烤烟平均值 26.56  2.25  1.47  11.80  0.65  1.56  0.32  4.88
罗勒烟 14.83  2.51  1.63  5.91  0.64  1.00  0.17  6.40
  罗勒烟烟味发酵前后测定结果表明(表6):新
型烟草在发酵后总糖,总碱,总氮,挥发碱等化学成
分比发酵前均有所提高,而普通烟草品种在发酵后
上述化学成分比发酵前有所降低。这说明新型烟
草与普通烟草品种是有区别的。
根据漯河卷烟厂利用罗勒烟烟叶3年试制与
评吸结果,并未发现独特的药物香气等内在质量的
变化。
表6 发酵后新型烟草的化学成分
Table 6 The chemical components of novel tobacco before and after fermentationresult
名称
Name
处理
Disposal
氯/%
Chlorine
总糖/%
Overal
sugar
总碱/%
Overal
alkali
糖/碱
Ratio of sugar
and alkali
总氮/%
Overal
nitrogen
挥发碱/%
Volatilization
alkali
罗勒烟
发酵前 3.23  10.0  3.05  2.81  2.36  0.50
发酵后 2.56  12.3  3.76  3.27  2.54  0.52
2.7 单料烟烟气的检测
对新型烟草烟叶,用单料烟卷制成的烟支,燃
烧后,检测烟气的医药成分种类及含量,结果表明:
产生了一系列新的对人体有益的医药成分,如表7
所示。
41 山 西 农 业 大 学 学 报(自然科学版) 2014
表7 单料烟烟气医药成分的测定
Table 7 The determining result on cigarette gas of single material tobacco
材料
Stuff
医药成分
Medicinal component
百分含量/%
Percentage content
作用
Function
罗勒烟 表木栓醇 0.53 抗炎
D-柠檬烯 0.25 镇咳,祛痰,对肺炎球菌,甲型链球菌,有强抑制作用。
维生素E  0.07
用于治疗习惯性流产,不育症及进行肌营养不良,
肌萎缩性脊髓索硬化等。
2.8 罗勒烟的可用性鉴定
可用性是衡量烟草品种的利用价值和育种水
平的重要标志。罗勒烟经省内外试验和示范,推
广,其产量与普通烟草品种相似,而药物香气,颇受
欢迎。
2.8.1 产、质量情况
罗勒烟,一般单叶重6~8g,产量1800~2100
kg·hm-2(表8)。漯河卷烟厂利用3年的时间,
对其进行反复探索,在卷烟配方中,新型烟草比例
达到10~15%,卷制成品吸食口味既有烤烟型香
烟的优良品质,又透出一种诱人的药物香味,试制
出“大得利”牌香烟,经试销,好评如潮。
表8 罗勒烟的产、质量情况
Table 8 The complexion of output and quality on coimum bailicmL.tobacco
地区
Areal
名称
Name
单叶重/g
Leaf weight
上部
Top
中部
Middle
下部
Lower
产量
Yeild
/kg·hm-2
烤后外观情况
Exteriorcase after toaste
颜色
Colour
油分
Oil share
身份
Status
备注
Remark
山西农大 罗勒烟 6.1  7.4  3.5  1957.5 桔黄 有 稍厚 有灌溉条件连作19年
灵丘县 罗勒烟 5.5  6.5  4.0  1950.0 正黄 有 稍厚 有一定灌溉条件
垣曲县 罗勒烟 6.3  7.6  4.0  1650.0 正黄 有 稍厚 旱地
2.8.2 烟气检测结果
国家烟草质量监督检测中心对“大得利”牌卷
烟进行检测,结果见表9。对照和2种样品烟气中
烟碱含量分别为1.52,1.10和1.31mg·支-1;焦
油含量分别为17.7,11.2和11.1mg·支-1;CO
含量分别为16.7、12.6、12.9mg·支-1。说明2
种样品在烟碱、焦油、CO的含量中,都比对照低。
这表明焦油含量10mg·支-1,烟碱含量1.1mg
·支-1上下。目前,“大得利”牌香烟属于低焦油卷
烟类型。
表9 烟气检测结果
Table 9 Test result on Smoking
项目
Item
烟碱
Nicotinamide/mg·支-1
焦油
Tar/mg·支-1
CO
/mg·支-1
水分
Moisture/mg·支-1
总粒相物
TPM/mg·支-1
对照 1.52  17.7  16.7  2.17  21.37
样品1低焦油 1.10  11.2  12.6  1.07  13.32
样品2浓(香)味 1.31  11.1  12.9  0.95  13.32
2.8.3 评吸结果
迄今,卷烟成品的评吸以鉴定其质量的优劣,
目前尚无法代替,也是比较科学的方法。漯河卷烟
厂利用罗勒烟等新型烟草在卷烟配方中的科学配
伍,使“大得利”牌香烟,呈现出香气细腻柔和,口感
纯正舒适,余味甜润丰满,药物香气流畅的品质特
征。经郑州烟草研究院评吸委员会评吸,结果列于
表10。罗勒烟经上述医药成分测定,烟气检测及
评吸,化学成分分析,初步认为,他们具有4个显著
特点:含医药成分,有特殊香气,中、高烟碱与低糖,
可用性较理想。
5134(1) 杨进文等:烟草与罗勒科间远缘杂交育种的研究
表10 评吸结果
Table 10 Result of appraising inhale
项目
Item
光泽
Luster
香气
Aroma
协调
Harmony
杂气
Mixed gas
刺激性
Catalyzing nature
余味
Atertaste
合计
Summation
1大得利 5.00  31.43  4.93  13.86  14.00  16.71  85.9
2大得利 5.50  32.29  5.00  13.57  14.00  16.57  86.9
3大得利 5.50  32.29  4.93  13.86  13.71  16.43  86.7
4大得利 5.50  32.71  5.21  14.00  14.29  16.86  88.6
3 结论与讨论
(1)利用药用植物与普通烟草科间进行远缘杂
交,首次采用无性嫁接和有性杂交相结合的方法,
解决了科间远缘杂交不亲和的难题。选育出罗勒
烟稳定品系。由于各性状的遗传力不同,烟草主要
农艺性状的变异范围有差别,性状稳定的快慢也不
一致。为此,按照育种目标,对单株性状的选择采
取了早代(F1~F7)宽松,晚代(F8 开始)严格的原
则,决定单株或群体的取舍。
(2)单料烟评吸结果表明:罗勒烟分别具有特
殊的香气,为卷烟产品的开发和设计特殊风格的卷
烟提供了新的原料。
(3)罗勒烟经医药成分测定、烟气检测及评吸
和化学成分分析初步认为:罗勒烟含医药成分;有
特殊药物香气;烟碱含量中、高,糖含量低;烟叶可
用性较理想。
(4)罗勒烟的烟叶在发酵前后其化学成分的变
化与普通烟草品种烟叶是有区别的。熟悉这一特
点,对卷烟企业用料是有益的。当前,利用化学成
分鉴定烟叶的质量指标,采用糖碱比(10∶1),氮碱
比(1∶1)。一般认为,氮碱比增大,烟叶颜色变淡,
烟气吃味逐渐减少,接近1∶1,则烟气严重不足,
低于1∶1时,烟味较浓,但刺激性逐渐增加。据漯
河卷烟厂试制结果可知,并未发现罗勒烟独特的药
物香气等内在质量的变化,反映出利用上述化学成
分指标鉴定罗勒烟叶质量,值得今后进一步探讨。
(5)烟草与药用植物科间杂交育种后代F1 到
F18的细胞染色体均呈杂和状态。这可能是由于控
制性状的主要染色体和非主要染色体共处同一细
胞中,从而使杂种后代的主要农艺性状与烟草相
似,只有个别性状倾向药用植物亲本。其化学成分
中既有烟草固有的化学成分(尼古丁等),也含有微
量的医药成分柠檬烯,β-丁香烯,罗勒烯等以及香
料成分香薷酮等。
(6)前人对远缘杂交的研究认为远缘杂交分3
种类型:一类是子代中有双亲的两类染色体的异源
双二倍体杂种,子代的外部性状常表现为双亲中间
型,如八倍体小黑麦;第二类是在母本染色体组的
的基础上,通过添加或代换的方式增加了异源染色
体的个别片段的成分,如某些小偃麦。第三类是亲
缘关系更远,如水稻,玉米,高粱等杂交的后代,在
光学显微镜下观察其染色体数目、形状和大小与母
本相似,基本上属于母本类型。如高粱稻,外形与
水稻相似,后代杂种与水稻基本相同,但在株、穗型
等方面的表现却不同于母本。这种现象从经典遗
传学理论上很难解释,但从局部DNA分子观察,
部分基因间的结构却可能保持一定的亲和性。因
而,当远缘DNA片段在母本复制过程中,有可能
被重组而使子代出现变异,因此,从分子水平上分
析,能取得成功的远缘杂交的大多数是DNA片段
的交换。本试验的杂种后代,主要农艺性已基本稳
定,但其细胞染色体仍呈杂合状态,这一问题仍需
要深入研究。
参 考 文 献
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61 山 西 农 业 大 学 学 报(自然科学版) 2014