全 文 ：电泳方法发现在进展期前列腺癌组织和前列腺癌细胞
株中表达显著下调 。能够明显抑制肿瘤的转移 ,降低
肿瘤细胞的侵袭力。但是对于原发病灶并没有显著影
响。左晓明等[ 8] 应用免疫组化法检测 26例伴淋巴结
转移的乳腺浸润性导管癌和 45例无淋巴结转移的乳
腺癌中的NDRG1的表达状态 ,结果乳腺癌伴淋巴结转
移的标本中 NDRGl的表达率低于无淋巴结转移标本
(P<0.01)。实验表明NDRGl与浸润性导管癌的侵袭
和转移能力密切相关 ,可能是一个候选的肿瘤转移抑
制基因 ,并且可能成为乳腺癌的一个有用的预后指标。
表达下调基因中有代表性的是 Cyr61(NM -
001554)。Cyr61是 CCN 家族具代表性的成员 ,是重要
的细胞基质调节因子 ,处于细胞内 、外信号传导通路下
游 ,调控内皮细胞和成纤维细胞的粘附 、迁移与增殖 ,
诱导血管发生 ,在多种肿瘤的发生 、发展过程中发挥作
用。虽然目前 Cyr61在卵巢癌肿瘤中的表达情况还不
清楚 ,但在其他肿瘤中已有广泛研究。在乳腺癌中 ,
Cyr61过度表达并对肿瘤的发生起促进作用[ 9] 。最近
报道人胰腺癌的腹膜转移癌的癌组织中 Cyr61高度表
达[ 10] 。卵巢癌 Cyr61能够刺激细胞增殖和抑制细胞凋
亡 ,在其的发生过程中起重要作用[ 11] 。
总之 ,理冲生髓饮对卵巢癌细胞生长的影响是个
复杂的过程。它可以通过促进抑癌基因和抑制癌基因
的表达 ,达到抑制肿瘤细胞生长的目的 。理冲生髓饮
这种多靶点作用机制不仅能阐明其抗肿瘤活性的分子
生物学机制 ,同时为以后对该复方进一步优化 、研究提
供了理论依据。
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虫草肾茶胶囊对肾小球系膜细胞增殖的影响
宋立群 ,金丽霞＊ ,宋业旭
(黑龙江中医药大学 ,黑龙江 哈尔滨 150040)
摘　要:目的:研究虫草肾茶胶囊对体外高糖环境下系膜细胞(HMC)增殖的影响 ,探讨其在糖尿病肾病
(DN)防治中的意义 。方法:将常规培养的人肾小球系膜细胞分为正常对照组 、高糖组 、虫草肾茶胶囊
高 、中 、低剂量组及福辛普利组 ,分别于相应处理后 24h ,48h和 72h收集细胞 ,用 4-甲偶氮唑蓝(MTT)
法检测细胞增殖 。结果:高糖有刺激 HMC增殖的效应 ,48h上增殖最明显 ,而在 72h时呈下降趋势 。虫
草肾茶胶囊及福辛普利两种药物血清对高糖刺激下的系膜细胞增殖有明显的抑制作用 ,其中虫草肾茶
胶囊血清对 HMC的抑制作用优于福辛普利血清。且随着虫草肾茶胶囊浓度 、作用时间的增加作用更明
显 ,呈一定的时间 、剂量依赖性关系 。结论:高糖可促进HMC 增殖 ,虫草肾茶胶囊能明显抑制高糖条件
下HMC增殖 ,从而发挥预防肾小球纤维化及硬化的发生 、发展 ,进而延缓DN的进展 。
关键词:虫草肾茶胶囊;人肾小球系膜细胞;增殖
中图分类号:R285.5;R587.1　　　文献标识码:A　　　文章编号:1002-2392(2009)03-0021-03
收稿日期:2009-01-30　　修回日期:2009-04-02
基金项目:黑龙江省教育厅科学技术研究项目(编号:11511357)
作者简介:宋立群(1957-),男 ,教授 , 博士后 ,博士研究生导师 ,主要从
事中医药治疗肾系疾病的研究。
＊通讯作者:金丽霞(1980-),女 ,博士研究生 ,主要从事中医肾病的临
床与科研工作。 E-mail:jinlixia1980@163.com
　　糖尿病肾病(diabetic nephropathy ,DN)是糖尿病特
有的慢性微血管并发症 ,由此导致的慢性肾功能衰竭
不断增加 ,严重危害着人类的健康。目前 DN 的发病
机制尚未完全明了 ,但长期的高血糖是引起 DN的始
动因素和中心环节[ 1] 。肾小球系膜细胞(Mesangial cell ,
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Mc)为肾小球固有细胞 ,有实验证实高糖可刺激其活
化 ,进而产生收缩 、增生 、合成并分泌多种炎症介质和
基质成分 ,促进肾小球硬化[ 2 ,3] 。
虫草肾茶胶囊由发酵冬虫夏草菌粉 、猫须草(别名
肾茶)、黄芪 、制大黄 、草豆蔻 、水蛭 6味药物组成 ,具有
健脾益肾 、化瘀排毒 、芳化湿浊等作用。早期动物实验
证实它可以减轻蛋白尿 ,达到肾保护的目的[ 4] ,但其对
MC的作用机制在体实验条件下未能阐明 。本实验采
用血清药理学方法和 HMC体外培养技术观察虫草肾
茶胶囊对高糖培养的人肾小球系膜细胞(HMC)增殖的
影响 ,为进一步阐明虫草肾茶胶囊改善 DN的作用机
理提供新的实验依据 。
1　材料和方法
1.1　主要实验材料及试剂　人肾小球系膜细胞株由
哈尔滨医科大学附属第二医院肾内科焦军东教授惠
赠。虫草肾茶胶囊由黑龙江中医药大学药学院协助制
备。发酵冬虫夏草菌粉由江西金水宝制药有限公司提
供 ,其余药材饮片购自黑龙江中医药大学附属第一医
院。福辛普利(蒙诺):规格:10mg 片;批号:070511 ,由
中美上海施贵宝制药有限公司生产。改良型 RPMI-
1640培养基 ,HyClone公司(美国),购自赛默飞世尔生
物化学制品(北京)有限公司。4 -甲基偶氮唑蓝
(MTT)、胎牛血清:HyClone;胰酶:美国 Sigma 公司;一
次性塑料培养瓶 , 96孔板:美国 Corning 公司;37℃5%
CO2恒温培养箱:美国 REVCO公司;倒置显微镜:CKZ
日本Olympus;4℃冰箱:青岛海尔股份有限公司;电热
恒温振荡水槽:DKZ 系列 ,上海一恒科学仪器有限公
司;液氮生物容器:成都液氮容器厂;净化工作台:苏州
净化 。
1.2　实验方法
1.2.1　含药血清的制备　健康 SD大鼠 50只 ,随机分
为5组 ,即:正常对照组(不给药)、高糖组 、虫草肾茶低
剂量组(相当于生药 0.375g mL 只)、虫草肾茶中剂量
组(相当于生药 0.75g mL 只)、虫草肾茶高剂量组(相
当于生药 1.5g mL 只)、福辛普利组(配制成浓度为 0.
375mg mL的水溶液),各给药组大鼠每日每次给与相
应药液 4mL ,1次 d灌胃 ,各组大鼠自由饮食 ,连续 7d ,
在末次灌胃 2h 后麻醉 ,在无菌条件下经腹主动脉采
血 ,离心取血清 ,56℃水浴 30min灭活补体 ,经 0.22μm
孔径的针头滤器过滤除菌 ,分装冻存备用。
1.2.2　系膜细胞的培养　将人肾小球系膜细胞株接
种在装有适量改良型 RPMI-1640 培养液(含 10%胎
牛血清)的培养瓶中 ,置 37℃、含 5%CO 2 饱和湿度的
孵育箱内培养 ,细胞生长状况良好 ,呈单层贴壁生长。
每1 ～ 2d换液一次 ,每 2 ～ 3d以 0.25%胰蛋白酶消化
并计数后传代。采用对数生长期的细胞制成一定浓度
的单细胞悬液 ,接种于 96孔板置于培养箱培养 。待细
胞基本融合 ,换用无血清(0.5%FCS)改良型 RPMI-
1640培养液同步 24h ,然后随机分组 , 分别培养 24h 、
48h 、72h 。
1.2.3　实验分组　正常对照组(常规培养 ,仅 10%正
常大鼠血清)、高糖组(常规培养 ,10%正常大鼠血清+
30mmol L D-glucose)、虫草肾茶低剂量组(10%虫草肾
茶低剂量含药血清+30mmol L D-glucose)、虫草肾茶
中剂量组(10%虫草肾茶中剂量含药血清 +30mmol L
D-glucose)、虫草肾茶高剂量组(10%虫草肾茶高剂量
含药血清+30mmol L D-glucose)、福辛普利组(10%福
辛普利含药血清+30mmol L D-glucose)。
1.2.4　MTT 法检测不同处理因素对肾小球系膜细胞
增殖的影响　长满的HMC用 0.25%胰蛋白酶消化后 ,
再用培养液稀释为单个细胞悬液 ,以 4×104 细胞密度
接种于 96孔培养板 。细胞完全贴壁后 ,用无血清的
RPMI-1640培养液同步化细胞 24h ,实验分组同 1.2.
3 ,每组浓度设6个复孔 ,共接种 3个板(24h 、48h和 72h
各一块板),其他条件相同 。将培养板移入 CO 2 孵箱
中 ,分别培养到预定时间后 ,每孔加入MTT 溶液 15μL ,
37℃避光继续孵育 4h ,终止培养。吸去孔内上清液 ,
每孔加入 150μL DMSO溶解液振荡 10min ,待结晶物充
分溶解后 ,酶标仪上检测各孔光吸收值(A490)。
1.2.5　统计学处理　实验数据用 SPSS13.0统计软件
进行统计分析 ,以( x ±s)表示 ,多组数据间比较用
ANOVA分析 ,以 P <0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　不同浓度葡萄糖对人肾小球系膜细胞株 HMC增
殖的影响(见表 1)
表 1　不同浓度葡萄糖对 HMC 增殖的影响( x±s , n=6)
组别 24h 48h 72h
正常对照组 0.324±0.059 0.937±0.093 0.945±0.090
高糖组 0.542±0.116■■ 1.286±0.069■■ 1.224±0.076■■
　　注:同时间与正常对照组比较 , ■■P<0.01。
由表 1可见 ,与正常对照组比较 ,高糖(30mmol L)
对HMC在培养 24h 、48h 和 72h 时段均有刺激系膜细
胞增殖的效应 ,差异有统计学意义(P <0.01)。尤在
48h时间点上增殖最明显 , 而在 72h 时呈下降趋势。
由此可见 ,葡萄糖对系膜细胞增殖呈现一定的浓度依
赖性和时效性。
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2.2　各种处理因素作用下HMC增殖的情况(见表 2)
表 2　各种处理因素作用下 HMC 的增殖情况( x±s , n=6)
组别 24h 48h 72h
正常对照组 0.324±0.059 0.937±0.093 0.945±0.090
高糖组 0.542±0.116■■ 1.286±0.069■■ 1.224±0.076■■
虫草肾茶高剂量组 0.379±0.057＊ 1.005±0.065＊＊ 0.844±0.095＊＊
虫草肾茶中剂量组 0.518±0.106■■ 1.161±0.074■■＊ 1.046±0.061■＊＊
虫草肾茶低剂量组 0.539±0.079■■ 1.204±0.057■■＊ 1.082±0.105■＊
福辛普利组 0.446±0.099■ 1.071±0.071■＊＊ 0.959±0.077＊＊
　　注:同时间与正常对照组比较 , ■P<0.05 , ■■P<0.01;同时间与
高糖组比较 , ＊P<0.05 , ＊＊P<0.01。
由表 2可见 ,与正常对照组比较 ,高糖(30mmol L)
对人肾小球系膜细胞在培养 24h 、48h 和 72h时段均有
刺激系膜细胞增殖的效应 ,有明显差异(P <0.01)。
在培养的 24h 时段 ,与高糖组比较 ,虫草肾茶中剂量
组 、虫草肾茶低剂量组及福辛普利组 HMC的增殖未受
到明显抑制(P>0.05),而虫草肾茶高剂量组 MTT 值
降低 ,可有效抑制 HMC 的增殖(P <0.05)。但随着作
用时间的延长 ,48h 和 72h 时段虫草肾茶高 、中 、低剂
量组及福辛普利组均可有效的抑制 HMC 增殖(P <
0.05 , P <0.01),且虫草肾茶高剂量组在抑制系膜细
胞增殖方面优于福辛普利组。
3　讨论
DN为 DM的微血管并发症之一 ,近年来 ,DN已成
为发达国家终末期肾功能衰竭(end-stage renal dis-
ease ,ESRD)的首要病因 ,我国 DN 的发病率也逐年上
升。DN的发生 、发展是多因素综合作用的结果 ,其中
糖代谢紊乱 、肾脏血流动力学的改变 、多种细胞因子的
作用以及遗传背景均起重要作用。依照国际糖尿病联
合会(International Diabetes Federation)糖尿病肾病统计
地图频率表明 DN 以惊人的比率在增加。全世界有
2.46亿人受累 , 如果现在的形式没有得到控制 , 到
2025年 ,这个数据将达到 3.8亿。流行病学表明超过
90%是Ⅱ型糖尿病 ,这与大量的人口老化 、饮食和肥胖
以及久坐的习惯相关[ 5] 。
糖尿病肾病是糖尿病的主要并发症之一 ,以肾脏
硬化病变为主 ,主要表现肾小球系膜细胞增殖 ,基底膜
增厚 ,系膜基质增多 。而系膜细胞是肾小球中功能最
活跃的细胞 ,具有多种功能 ,在多种致病因素作用下 ,
系膜细胞可发生异常的增殖 ,同时伴有系膜基质的增
多 ,最终导致肾小球硬化 ,所以系膜细胞是研究肾小球
硬化发病机制的热点之一 , 也是实验研究的重点和
热点 。
Wolf等[ 6] 的实验提示 ,高糖对肾小球系膜细胞增
殖可能起双向调节作用 ,在培养早期(24 ～ 48h),高糖
促进肾小球系膜细胞增殖 ,此后高糖对肾小球系膜细
胞增殖起抑制作用。高糖作为糖尿病肾病最主要的致
病因素 ,可引起肾小球系膜细胞内一系列的改变。针
对这些改变发生的机制进行研究 ,对于发现糖尿病肾
病的发病机制 ,有效的预防与治疗糖尿病肾病具有重
要的意义 。
本实验采用体外培养的人肾小球系膜细胞 ,观察
虫草肾茶胶囊对 HMC增殖的影响 ,从细胞水平探讨其
延缓肾小球硬化的作用机制 ,为糖尿病肾病及由此导
致的 CRF 的中医药临床治疗提供了依据。本实验研
究结果表明 ,高糖环境下 ,肾小球系膜细胞增殖 ,高糖
在培养 24h 、48h 和 72h 时段均有刺激 HMC 增殖的效
应 ,48h 时间点上增殖最明显 ,而在 72h 时呈下降趋
势。提示高糖诱导HMC增殖可能有一定的时间限度。
且在一定程度上说明了高糖通过促进细胞增殖从而推
动DN进展。虫草肾茶胶囊及福辛普利两种药物血清
对高糖刺激下的系膜细胞增殖有明显的抑制作用 ,其
中虫草肾茶胶囊血清对 HMC的抑制作用优于福辛普
利血清。且随着虫草肾茶胶囊浓度 、作用时间的增加 ,
抑制作用更明显 ,呈一定的时间 、剂量依赖性关系 ,其
具体机制及它的肾脏保护作用可能还存在其他途径 ,
有待进一步研究 。
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