全 文 ：青海野生与栽培麻花艽 psbA-trnH序列的比较
张得钧1，高庆波2，李福安1，李永平1，俞科贤1
( 1．青海大学医学院，青海西宁 810001; 2．中国科学院西北高原生物研究所，青海西宁 810001)
摘要 ［目的］分析野生与栽培麻花艽( Gentiana straminea Maxim． ) psbA-trnH序列的差异，为麻花艽的基源鉴定和品质评价提供分子依
据。［方法］采用 PCR扩增纯化后直接测序的方法，测定野生与栽培麻花艽 cpDNA psbA-trnH 核苷酸序列并作序列同源性分析。［结
果］野生与栽培麻花艽的 cpDNA psbA-trnH片段长度分别为 316和 317 bp，两者之间有 4个碱基的变异。［结论］利用 psbA-trnH区序列
的差异可以鉴别野生与栽培麻花艽。
关键词 麻花艽( Gentiana straminea Maxim． ) ; psbA-trnH区序列;聚合醇链反应; 同源性分析
中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611( 2011) 10 －05780 －02
Comparison of Chloroplast DNA psbA-trnH Sequences between Wild and Cultivated Gentiana straminea Maxim． in Qinghai
ZHANG De-jun et al ( Medical College，Qinghai University，Xining，Qinghai 810001)
Abstract ［Objective］To distinguish Gentiana straminea Maxim． from wild and cultivated plants by comparing chloroplast DNA psbA-trnH se-
quences，so as to provide a molecular basis for orgin identification and quality evaluation．［Method］ cpDNA psbA-trnH sequences of Gentiana
straminea Maxim． were amplified by polymerase chain reaction ( PCR) ，and then sequenced by direct PCR sequencing method for homologous a-
nalysis．［Result］The lengths of cpDNA psbA-trnH of wild and cultivated plants were 316 and 317 bp respectively，and there were 4 variable
sites．［Conclusion］The nucleotide differences of psbA-trnH regions could be used for distinguishing Gentiana straminea Maxim． from wild and
cultivated plants．
Key words Gentiana straminea Maxim． ; psbA-trnH sequences; PCR; Homologous analysis
基金项目 青海大学中青年科研基金项目( 2009-QY-19) 。
作者简介 张得钧( 1975 － ) ，男，青海乐都人，副教授，博士，从事中藏
药资源开发与利用的教学、科研工作，E-mail: djzhang @
nwipb． ac． cn。
收稿日期 2011-01-12
麻花艽 ( Gentiana straminea Maxim． ) 为龙胆科( Genti-
anaceae) 龙胆属( Gentiana) 秦艽组植物，2010 版《中华人民共
和国药典》将其列为正品秦艽之一［1］。麻花艽是传统的中
药，同时也是藏族民间常用的藏药，已有 2000 年的药用历
史，其根和花可入药，具有保肝、健胃、抗炎、升血糖、退热、抗
惊厥，治疗脱毛症和心血管疾病等疗效［2 －6］。psbA-trnH片段
是位于叶绿体 DNA基因组上 psbA基因和 trnH基因之间的
一段非编码序列，不参加转录翻译过程，因而在功能上的限
制较少，变异较为自由，比编码基因能提供更多的系统发育
信息，因此其变异程度相对较高，变异显著且容易扩增和测
序，现已被广泛用于中药材的分子鉴定［7 －10］。目前，未见针
对野生与栽培麻花艽叶绿体 DNA psbA-trnH 序列分析的报
道。鉴于此，笔者采用分子生药学技术对野生与栽培麻花艽
叶绿体 DNA psbA-trnH片段进行研究，旨在阐明栽培与野生
麻花艽的 DNA序列差异，从分子水平上为野生与栽培麻花
艽的鉴别和品质评价提供依据，为麻花艽植物资源的深入开
发利用和药效、药性研究提供数据支持。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 研究对象。野生麻花艽居群样品采自青海省果洛地
区，栽培居群样品采自青海大通栽培基地。从每个采样植株
上采取少量叶片放入采样袋中，硅胶干燥保存。所有标本均
经青海大学医学院魏全嘉教授鉴定，样本详细资料见表 1。
1． 1． 2 主要试剂。聚合酶、缓冲液、dNTP 和纯化试剂盒均
购自上海中科开端生物科技股份有限公司;引物由上海生工
生物工程技术服务有限公司合成;采用 3 × CTAB 法获取总
DNA模板; 超纯水由实验室自制。
表 1 麻花艽材料来源
Table 1 The sources of Gentiana straminea Maxim． materials
居群编号
Population
No．
每居群采集个体数
Sample number
per population
采集地
Collection
site
野生与栽培
Wild and
cultivated
YS 5 青海果洛大武 野生
ZP 5 青海大通 栽培
1． 1． 3 主要仪器。Biometra thermal cycler PCR 扩增仪，由德
国 Eppendorf公司生产; 电泳仪，由北京六一仪器厂生产;
BeckmanD /U530紫外分光光度计，由美国 Beckman 公司生
产; MIKRO/22R冷冻高速离心机，由德国海蒂诗( Hettich) 生
产;凝胶成像系统，由法国 VILBER 公司生产; 超纯水仪，由
法国密理博公司生产。
1． 2 方法
1． 2． 1 基因组 DNA 的提取。采用 3 × CTAB 法提取总
DNA，参照文献［11］的步骤进行。
1． 2． 2 PCR扩增。
1． 2． 2． 1 反应体系。PCR反应总体积为 25 μl，内含 2． 5 μl
10 × PCR 缓冲液( 含 Mg2 + ) ，0． 2 μl dNTP ( 10 mmol /L) ，各 1
μl正反引物( 5 pmol /L) ，0． 2 μl ( 1． 5 U) Taq DNA 聚合酶，
0． 5 μl ( 约 10 ng) 总 DNA模板和 20 μl三蒸水。
1． 2． 2． 2 反应程序。94 ℃预变性 4 min; 94 ℃变性 50 s，58
℃退火 50 s，72 ℃延伸 50 s，35个循环; 72 ℃延伸 7 min。
1． 2． 2． 3 操作步骤。PCR扩增采用通用引物“psbAF”( 5’-
GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3’) 和“trnHR”( 5’- CGCG-
CATGGTGGATTCACAAATC-3’) ［7］扩增叶绿体 DNA psbA-
trnH序列，扩增反应在 Biometra thermal cycler PCR 扩增仪上
进行。所得的 PCR扩增产物进行 1． 5%的琼脂糖凝胶电泳，
用紫外荧光成像系统拍照，纯化试剂盒纯化，然后送往北京
三博远志生物技术有限责任公司进行双链测序，测序引物为
责任编辑 侯美灵 责任校对 卢瑶安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2011，39( 10) : 5780 － 5781
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2011.10.181
“psbAF和“trnHR”。
1． 2． 3 同源性分析。序列对位排列用 Clustal X 软件自动完
成后，适当手工校正。在 MEGA 软件中进行比对，并计算( A
+ T) 和( G + C) 含量。运用 DnaSP 软件统计变异位点，比较
野生与栽培麻花艽的序列特点。
2 结果与分析
按照“1． 2． 2”方法对野生与栽培麻花艽 cpDNA psbA-
trnH序列进行 PCR扩增，所得产物按照“1． 2． 3”方法进行同
源性分析，结果见表 2 ～ 3。由表 2 可知，野生与栽培类群麻
花艽的 cpDNA基因的 psbA-trnH片段长度分别为 316和 317
bp。统计结果表明 psbA-trnH 序列中碱基频率存在明显偏
差，其中 G 含量最低，A 含量最高，G + C 含为 20． 8% ～
21． 2%，显著低于其相应的 A + T含量。由表 3可知，野生与
栽培类群麻花艽的 psbA-trnH有 4 个变异位点: 1 处插入 /缺
失，位于 311位点处; 2处碱基转换，分别为 30 bp位点处的 C
与 T转换和 306 bp位点处的 A与 G转换; 1 处碱基颠换，位
于 292 bp位点处。
表 2 野生与栽培麻花艽 cpDNA psbA-trnH碱基量
Table 2 Base ratio of cpDNA psbA-trnH of wild and cultivated Genti-
ana straminea Maxim．
样本编号
Sample No．
长度∥bp
Length
cpDNA psbA-trnH∥%
T C A G G + C
YS-1 316 32． 9 11． 1 46． 2 9． 8 20． 9
YS-2 316 32． 9 11． 1 46． 2 9． 8 20． 9
YS-3 316 32． 9 11． 1 46． 2 9． 8 20． 9
YS-4 316 32． 9 11． 1 46． 2 9． 8 20． 9
YS-5 316 32． 9 11． 1 46． 2 9． 8 20． 9
ZP-1 317 33． 1 11． 0 46． 1 9． 8 20． 8
ZP-2 317 33． 1 11． 0 46． 1 9． 8 20． 8
ZP-3 317 33． 1 11． 0 46． 1 9． 8 20． 8
ZP-4 317 33． 1 11． 0 46． 1 9． 8 20． 8
ZP-5 317 33． 1 11． 0 46． 1 9． 8 20． 8
表 3 Cp DNA psbA-trnH序列排列情况
Table 3 The base in variable sites of cp DNA psbA-trnH sequence
居群编号
Population No．
变异位点 Variable site
12 30 292 306 311
YS － C T A T
ZP － T G G －
3 结论与讨论
近年来，叶绿体 DNA 非编码区的序列由于其进化速率
较快，已开始被应用到药用植物鉴定与品质研究中。在试验
初期曾选择 cpDNA trnL-F、cpDNA rpl20-rps12、cpDNA trnS-G
和 nrDNA ITS进行扩增，结果显示野生与栽培麻花艽 cpDNA
trnL-F和 cpDNA rpl20-rps12序列的差异不明显，不能有效地
将野生与栽培麻花艽分开。而 cpDNA trnS-G序列中有过多
的 POLY结构，测序成本较高，不适合鉴别野生与栽培麻花
艽，nrDNA ITS存在较多的叠峰，若想确定某一位点碱基的正
确性，必须先进行克隆，然后再测序，增加了试验的难度，同
时成本增加，也不适合用于鉴别野生与栽培麻花艽［8］。而研
究所得的野生与栽培麻花艽 psbA-trnH序列的碱基存在一定
的差异，说明麻花艽在引种栽培过程中产生了变异，使物种
更进化，这与王东等人的观点一致［12］。同时，psbA-trnH序列
长度适中，容易扩增、测序成本较低，可以将野生与栽培麻花
艽区分开，能有效地鉴别野生与栽培麻花艽，在实际生产中
能够解决物种鉴定等方面所遇到的实际问题。
参考文献
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檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
54 －55．
(上接第 5779 页)
好的精密度和准确度，检出限低，简便、快速、基体干扰少等
优点，测定结果令人满意，可用于中药材中锑元素的测定。
参考文献
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187539 卷 10 期 张得钧等 青海野生与栽培麻花艽 psbA-trnH序列的比较