全 文 ： 论 著
巨型辐花海葵荧光蛋白类似物基因的原核表达比较
涂洪斌 1　朱俊杰 2　杨文利 2　姜孝玉 2　陈慧萍 2　徐安龙 2
(1广州医学院实验医学研究中心 肿瘤研究所 , 广东 广州 510182;
2中山大学生命科学学院生物化学系 海洋生物功能基因组开放实验室 ,广东 广州 510275)
　　摘要　目的:探讨巨型辐花海葵荧光蛋白类似物基因 hmGFP的生物学特性及应用的可能性。方法:构建
了 hmGFP的两个原核表达载体并进行诱导表达。 结果:低温下 hmGFP获得了功能性表达而发光。深入比较
了重组巨型辐花海葵荧光蛋白类似物基因 hmGFP在两个表达体系中的表达差异 ,其中 pETTRX-hmGFP的重组
蛋白表达水平和可溶性均比 pET21b-hmGFP高。结论:对 pETTRX-hmGFP的表达条件进行了优化 , 为下一步
hmGFP成熟重组蛋白的纯化及其荧光波谱分析奠定了良好基础 。
关键词　巨型辐花海葵;荧光蛋白类似物基因;原核表达
中图分类号　Q786　文献标识码:A　文章编号:1008 - 1836(2005)03 -0001 - 06
ComparativeAnalysis of Recomb inant Expression ofGFP Homolog
from HeteractisM agnifica inE. Coli
TU Hong-bin1 , ZHU Jun-J ie2 , YANGWen-li2 , J IANG X iao-yu2 , CHEN Hui-ping2 , XU An-long2
(1. R esearch Center of Experim ental M edicine, Cancer R esearch Institute, Guangzhou M edica l College, Guangzhou
510182, Ch ina;2. Departmen t of B iochem istry, The Open Laboratory forMarine F unctional Genom ics of S ta te High-
Tech D evelopm ent, Sun Ya t-Sen Un iversity, Guangzhou 510275, China)
Abstrac t　Objective:To gain insight o f bio log ica l cha racte ristics and app lication feasibility for GFP homo log
hmGFP from Heteractism agn ifica. M ethods:Tw o different prokaryo tic expression sy stem s(pET21b and pETTRX) o f
hmGFP we re construc ted and recom binant hmGFP can be both func tiona lly expre ssed under low tem pe ra ture. The
expre ssion difference be tw een pET21b-hmGFP and pETTRX-hmGFP we re fur ther investiga ted. R esu lts:The expression
level and the so lubility o f the recombinant hmGFP pro te in in pETTRX w ere be tte r than that in pET21b. C onc lusion:
The optim al pETTRX-hmGFP expre ssion condition was established for nex t step o f purify ing m a ture recomb inan t
hmGFP pro te in to cha racte rize its fluo rescent spec trum.
K ey words　Heteractism agnifica;GFP hom o log;P rokaryo tic expression
基金项目:广州医学院博士启动基金(025105)
作者简介:涂洪斌(1971. 2 -),男 , 副教授 ,博士。
研究方向:基因工程。
　　作为细胞生物学 、发育生物学和分子生物学的
胞内标记分子 ,来源于水母 (Aequora victoria)的 GFP
基因是目前被克隆并研究得最为透彻和应用最为广
泛的荧光蛋白 ,对水母 GFP基因的一级结构密码
子 、晶体结构以及发光机制等方面进行了研究 [ 1] 。
另外 ,为拓宽 GFP的应用范围 ,用基因工程突变的
方法使最大散射波长漂移而获得不同波长的变异
体 ,但并不成功的红外移的突变体最大发射波长仅
为 529 nm ,这可能是由 w tGFP本身的一级结构和荧
光波谱特征决定的[ 2] 。近年来 , GFP样色素蛋白的
相关基因在其他物种中也先后被分离和克隆 ,主要
有珊瑚虫 、其他多管水母和海葵等 [ 3] 。但到目前为
止 ,新获得的 GFP样色素蛋白的基因中只有来源于
珊瑚虫 Discosoma sp.的红色荧光蛋白 FP583已被用
作为实用的分子标记 (CLONTECH )。从更多的海
洋生物中 ,特别是腔肠动物中分离和克隆具有实用
性和波谱多样性的不同天然荧光蛋白及其基因 ,对
GFP类蛋白的进化 、结构与功能关系和应用研究方
面将大有裨益 。天然存在的波长变异体更有利于荧
光生色基团的结构比较研究及改造 ,对它们的起源 、
1
第 33卷第 3期 广 州医 学院 学报 V o.l 33N o. 3
　2005年 6月 ACADEM IC JOURNAL OF GUANGZHOU M EDICAL COLLEGE Jun. 2005
荧光形成和决定其参数的结构特点等有关机理的深
入研究可能揭示荧光蛋白类似物基因的特性本质 。
最近 , 我们 构 建了 巨型 辐 花海 葵 (Heteractis
magn ifica)触手 cDNA文库 ,并从中分离到一个荧光
蛋白类似物基因 hmGFP的全长 cDNA克隆 [ 4] 。
为进一步了解 hmGFP基因的荧光波谱等生物
学特性 , 我们构建了 pET21b-hmGFP 和 pETTRX-
hmGFP两种原核表达载体 ,并对其在大肠杆菌中的
表达进行了研究和比较 ,进而优化重组 hmGFP诱导
表达的条件 。
1　材料和方法
1. 1　材料
1. 1. 1　质粒和菌株　质粒 pET21b购自 NOVAGEN
公司 ,质粒 pETTRX和宿主菌 E. coli菌株 DH5α、
BL21(DE3)和 BL21p lys(DE3)由本室保存 。
1. 1. 2　工具酶和试剂盒 　KpnI、N otI、Taq DNA聚
合酶和 DNA连接酶为 NEB公司产品 , XL rT th DNA
Po lyme rase购自 PERK IN ELMER ,质粒和 PCR产物
纯化试剂盒为 Q IAGEN公司产品。
1. 1. 3　主要生化试剂　 IPTG、丙烯酰胺 、N , N ’ -亚
甲叉丙烯酰胺等购自 Promega;低分子量标准蛋白
(14 ～ 97 kD)购自生工公司;寡聚核苷酸引物由上
海博亚公司合成;其他试剂为国产分析纯。
1. 2　方法
1. 2. 1　pET21b-hmGFP和 pETTRX-hmGFP表达载
体的构建　以来源于巨型辐花海葵触手 cDNA表达
文库的含荧光蛋白类似物基因 hmGFP的质粒
pcDNA3-hmGFP为模板[ 4] ,针对 pETTRX载体质粒
的引物为
　　　P1:5’ -GGGGTACCCTGGAAGTTCTGTTCCAAGGTCCAATGTATTCTTACATCAAAG-3’
　　　 Kpn I　Prec ision Protease site
　　　P2:5’ -CG GCGGCCGCTCAGGAAATGATCATTTACGAAC-3’
　　　 NotI
针对 pET21b载体质粒的引物为
　　　P3:5’ -CGGGATCCACCGGTCGCCACCATGTATTCTTACATCAAAG-3’
　　　 BamH I　Kozak consensus transla tion in itia tion site
　　　P4:5’ -TGATAGCGGCCGC TTTACGAACTCTCATCAAA-3’
　　　 NotI
PCR扩增 hmGFP基因克隆于 pETTRX融合表达质
粒或 pET21b质粒中。重组表达载体分别用 KpnI /
N otI或 BamH I /N otI进行双酶切鉴定 。 PCR、酶切 、
回收 、连接 、转化 、质粒的抽提和纯化 ,琼脂糖凝胶电
泳均按 Sambrook等 [ 5]的方法进行。 DNA测序由大
连宝生物工程有限公司完成。
1. 2. 2　hmGFP基因在两种原核系统中的表达　将
重组表达质粒 pETTRX-hmGFP 和 pET21b-hmGFP
分别转化大肠杆菌 BL21(DE3)构成工程菌株 。挑
取单菌落接种于含氨苄青霉素的 LB液体培养基
中 , 37 ℃培养过夜 ,作为种子菌。取种子菌按 1 /50
的比例接种于 Amp+的 LB丰富培养基中 , 37 ℃放
大培养至 A600为 0. 5 ～ 0. 6,加入 IPTG至终浓度为
0. 5mmo l /L,于 25 ℃诱导表达 10 h。取 1mL细菌
培养物用于 SDS-PAGE分析 ,其余的离心沉淀细菌
备用。
1. 2. 3　重组 hmGFP在大肠杆菌中表达条件的优化
　在其他培养条件不变的情况下 ,改变诱导时培养
温度和 IPTG浓度 ,对工程菌株进行诱导表达 ,离心
收集菌体并进行超声破碎 , SDS-PAGE电泳检测表
达重组蛋白质在总菌中的表达情况及在超声上清的
含量 ,以确定最佳诱导条件。
2　结果与分析
2. 1　hmGFP两种重组表达载体的构建
为了确保 hmGFP在原核系统内获得表达 ,我们
同时采用两种表达系统进行载体构建 ,并在设计的
pETTRX系统上游引物中引入 Prescission蛋白酶切
割位点 ,以便在下游纯化时对融合蛋白进行专一性
切割;而 pET21b的引物中则分别引进一个 Kozak共
有翻译起始位点及为符合载体读码框而插入一个碱
基 T。
以 pcDNA3-hmGFP质粒 DNA为模板 ,用相应
的引物扩增 hmGFP 基因片段 (含酶切位点和
Prescission Pro tease或 Kozak识别序列 ), 长为 700
bp左右 ,与预期大小一致 。 PCR扩增产物经双酶切
后分别克隆到 pET21b和 pETTRX表达质粒上 (图
1)。小量制备法提取质粒 DNA鉴定阳性克隆 ,用
2
广州医学院学报 (JGZMC)　2005, 33(3)
Kpn I+Not I和 BamHI+Not I分别酶切两种重组质
粒 ,可切出与 PCR产物大小一致的片段 ,以及与线
性载体 pETTRX (5. 8)和 pET21b(5. 3 kb)大小一
致的片段 , 表明 hmGFP 基因已插入载体质粒
pETTRX和 pET21b (图 2), DNA测序结果表明插
入的外源基因序列正确 ,说明两种 hmGFP原核表达
载体构建准确无误 。
2. 2　重组 hmGFP在两种原核系统中表达的比较
图 1　pET21b-hmGFP和 pETTRX-hmGFP表达质粒的构建
F ig. 1　Construction of pET21b-hmGFP and pETTRX-hmGFP recombinan t p lasm ids
图 2　pET21b-hmGFP和 pETTRX-hmGFP重组表达质粒的酶切鉴定
F ig. 2　Enzym atic d igestion determ ina tion of pET21b-hmGFP and pETTRX-hmGFP recom binan t p lam ids
①Restriction d igestion pa ttern o f recomb inan t p lasm id pET21b-hmGFP　1. pET21b-hmGFP plasm id digested by BamH I and No tI;
2. pET21b-hmGFP plasm id digested by BamH I;3. PCR product o f hmGFP;M:1 kb DNA ladde r
②Restriction d igestion pa ttern o f pETTRX-hmGFP recom binant p lasm id. 　1. pETTRX-hmGFP p lasm id digested by KpnI and No tI;
2. pETTRX-hmGFP plasm id digested by BamH I;3. PCR produc t o f hmGFP;M. 1 kb DNA ladde r
　　pETTRX-hmGFP的 BL21(DE3)基因工程菌在
25 ℃下诱导 10 h,梯度终浓度 IPTG (0、0. 01、0. 1、
0. 25、0. 5和 1 mmo l /L)条件下 ,总菌体在自然光下
均呈现鲜艳的黄绿色(图 3 - B1),紫外光下菌体激
发出明亮稳定的荧光 (图 3 - B2)。 pET21b-hmGFP
工程菌在相同条件下诱导表达后 ,离心收菌发现 ,在
不同 IPTG终浓度 (0. 1、0. 25、0. 5和 1 mmol /L)诱
导的 pET21b-hmGFP总菌体在自然光下呈现浅黄绿
色 (图 3 - A1), 紫外光也可激发出明亮荧光 (图
A2);但不同于 pETTRX-hmGFP的是 ,在 IPTG终浓
度为 0和 0. 01 mmo l /L时 pET21b-hmGFP的菌体未
见颜色变化。 SDS-PAGE分析也显示 , 含 pET21b-
hmGFP工程菌的诱导表达带比 pETTRX-hmGFP工
程菌诱导出的预期特异表达产物带浅淡 (图 3 -A3、
B3)。 pET21b-hmGFP和 pETTRX-hmGFP的诱导表
达差异 ,说明 hmGFP在获得微量表达就能激发较强
的荧光且在 pETTRX融合表达系统中表达量高 (图
3)。为此 , 我们选择 pETTRX-hmGFP及其转化菌
BL21(DE3)或 BL21plys(DE3)为下一步用于大量表
达和纯化的表达载体及菌株 。值得注意的是 , 在
IPTG浓度为零时 , pETTRX-hmGFP仍有较高的本底
表达 ,而 pET21b-hmGFP则无 ,这可能是因为 BL21
(DE3)菌株在无诱导剂情况下 ,仍能表达微量的 T7
RNA聚合酶从而导致一定程度的基因转录所至 ,而
担体蛋白 TRX的存在似乎增强了这种本底转录。
3
第 3期　涂洪斌 ,等 .巨型辐花海葵荧光蛋白类似物基因的原核表达比较
图 3-A1　pET21b-hmGFP的 IPTG浓度梯度 25
℃诱导表达菌体(自然光下)
F ig. 3-A1　Diffe rent concentrations of IPTG on the
expression o f pET21b-hmGFP (under natura l ligh t)
1 ～ 6:0, 0. 01, 0. 1, 0. 25, 0. 5 and 1 mmo l /L IPTG
图 3-B1　 pETTRX-hmGFP的 IPTG浓度梯度 25
℃诱导表达菌体(自然光下)
F ig. 3-B1　Diffe rent concen trations of IPTG on the ex-
pression of pETTRX-hmGFP (under natural light)
1～ 6:0, 0. 01, 0. 1, 0. 25, 0. 5 and 1 mmo l /L IPTG
图 3-A2　pET21b-hmGFP的 IPTG浓度梯度 25 ℃
诱导表达菌体(UV光下)
F ig. 3-A2　 Differen t concen tra tions of IPTG on the
expression o f pET21b-hmGFP (under UV light)
1 ～ 6:0, 0. 01、0. 1, 0. 25, 0. 5 and 1 mmo l /L IPTG
图 3-B2　pETTRX-hmGFP的 IPTG浓度梯度 25℃
诱导表达菌体(UV光下)
F ig. 3-B2　D iffe rent concentrations o f IPTG on the
expression o f pETTRX-hmGFP (under UV light)
1 ～ 6:0, 0. 01, 0. 1, 0. 25, 0. 5 and 1 mmo l /L IPTG
图 3-A3　 pET21b-hmGFP的 IPTG浓度梯度诱导
表达菌体 SDS-PAGE电泳 (25 ℃)
F ig. 3-A3　SDS-PAGE ana ly sis of the expressions of
pET21b-hmGFP induced w ith d iffe rent concen tra tion
IPTG on 12% ge l(25 ℃)
1 ～ 6:0, 0. 01, 0. 1, 0. 25, 0. 5 and 1 mmo l /L IPTG
图 3-B3　pETTRX-hmGFP的 IPTG浓度梯度诱导
表达菌体 SDS-PAGE电泳 (25 ℃)
F ig. 3-B3　SDS-PAGE ana ly sis of the expre ssion of
pETTRX-hmGFP induced w ith differen t concentra tion
IPTG on 12% ge l(25 ℃)
1 ～ 6:0, 0. 01, 0. 1, 0. 25, 0. 5 and 1 mmo l /L IPTG
图 3　巨型辐花海葵荧光蛋白类似物基因 hmGFP在 pET21b和 pETTRX系统中的表达
F ig3　 The prokaryotic expression of fluorescen t prote in hom ologous gene hmGFP from Rad ian thus macroodactylus by
pET21b and pETTRX expression system
4
广州医学院学报 (JGZMC)　2005, 33(3)
2. 3　pETTRX-hmGFP在大肠杆菌中表达条件的优化
进 一 步 摸 索 pETTRX-hmGFP 的 BL21p ly s
(DE3)基因工程菌的表达条件 ,结果表明温度对
重组 hmGFP蛋白功能性表达有一定影响 ,分别在
37 ℃、28 ℃、22 ℃和 19 ℃进行诱导表达的菌液 ,
经离心后发现菌体的颜色分别是无 、由浅入深的
绿色 。继续用终浓度分别为 0、0. 1、0. 3、0. 5和 1
mmo l /L的 IPTG ,在 28℃、22℃和 19 ℃诱导 hmG-
FP融合表达 ,从 SDS-PAGE分析结果 (图 4)看 ,除
28 ℃诱导菌的表达量与 IPTG浓度梯度相关并同
菌体的绿色深浅相符外;22 ℃和 19 ℃诱导温度
下 ,不同 IPTG浓度的表达量和可溶性差不多但比
28 ℃诱导菌高 。这说明低温有助于 hmGFP以正
确的功能性构象折叠从而提高 TrX-hmGFP融合蛋
白可溶性 。由此 ,在既考虑成本又能获得较高表
达量和较高溶解性的重组蛋白的情况下 , 确定如
下优化表达条件:0. 1 mmo l /L IPTG浓度 、22 ℃的
诱导温度诱导 12 h左右 。
图 4A　pETTRX-hmGFP的 IPTG浓度梯度诱导表达 SDS-
PAGE电泳(19 ℃)
F ig. 4A　 SDS-PAGE analy sis o f the exp ression o f pETTRX-
hmGFP induced w ith diffe rent concentrations o f IPTG on 12%
gel(19 ℃)
C:to tal pro teins o f transfo rm ed BL21p lys(DE3)ce lls w ithou t
IPTG inducation;1, 3, 5: the supernatant pro teins o f bacteria l
induced w ith 0. 5, 0. 1, 0. 05 mmo l /L IPTG after sonica tion;
2, 4, 6: the to tal prote ins o f bacteria l induced w ith 0. 5, 0. 1,
0. 05 mm o l /L IPTG;M:m o lecular we ight standards
图 4B　 pETTRX-hmGFP的 IPTG浓度梯度诱导表达 SDS-
PAGE电泳(22 ℃)
F ig. 4B　SDS-PAGE analysis o f the expression o f pETTRX-hmG-
FP induced w ith different concentrations of IPTG on 12% ge l(22
℃)
C: to tal pro teins of transform ed BL21ply s(DE3) cells w ithou t
IPTG inducation;1, 3, 5, 7: the to tal pro te ins o f bac te rial in-
duced w ith 0. 1, 0. 3, 0. 5, 1 mmo l /L IPTG a fte r sonication;
2, 4, 6, 8: the supe rna tan t pro te ins of bac te rial induced w ith 0.
1, 0. 3, 0. 5, 1 mm o l /L IPTG;M:m o lecular we ight standards
图 4C　pETTRX-hmGFP的 IPTG浓度梯度诱导表达 SDS-PAGE电泳
(28 ℃)
F ig. 4C　SDS-PAGE analysis of the expre ssion o f pETTRX-hmGFP in-
duced w ith different concen tra tions o f IPTG on 12% ge l(28℃)
C:tota l prote ins o f transfo rmed BL21ply s(DE3)ce llsw ithout IPTG ind-
uca tion;1, 3, 5, 7:the superna tant p ro te ins of bacte ria l induced w ith1,
0. 5, 0. 3, 0. 1 mmo l /L IPTG after sonica tion;2, 4, 6, 8: the to tal pro-
teins of bacteria l induced w ith 0. 5, 0. 3, 0. 1 mmo l /L IPTG;M:m o-
lecu la rwe igh t standards
图 4　包含 pETTRX-hmGFP重组质粒的 BL21p lys(DE3)工程菌诱导表达条件
F ig. 4　Effec t of d ifferen t cond it ion on the expression of pETTRX-hmGFP in stra in BL21p lys(DE3)
5
第 3期　涂洪斌 ,等 .巨型辐花海葵荧光蛋白类似物基因的原核表达比较
3　讨　论
1994年 Chalfie首次在异源细胞中表达了能激
发绿色荧光的 GFP, 从而开创了 GFP应用之先
河 [ 6] 。为探讨巨型辐花海葵荧光蛋白类似物基因
hmGFP应用的可能性和生物学特性 , 我们进行了
hmGFP的原核表达研究 ,结果表明 hmGFP插入了
两个不同表达系统均在异源的原核 E. coli中实现
了稳定的功能性表达 (图 3),说明 hmGFP的环三肽
自催化合成不需要巨型辐花海葵额外来源的底物和
共因子 ,发光生色基团的形成并非种属特异性的 ,而
是可以通过利用广泛存在的细胞成分或自催化而发
生 ,这说明 hmGFP具备了可用于活细胞内基因表达
和蛋白定位的报告作用的基本条件 。另外 ,观察发
现高表达 hmGFP的宿主菌仍然生长得很好 ,显示
hmGFP蛋白对细胞没有明显的毒性作用。还值得
一提的是 hmGFP重组蛋白具有巨型辐花海葵触手
一样的自然光下可见鲜亮绿色的特性 ,蛋白质自身
颜色的可视性 ,由于不需要借助于仪器设备 ,简化了
hmGFP自身研究过程中的检测 ,因而非常利于蛋白
质功能表达和纯化研究的直接观察。利用 hmGFP
重组蛋白自然光下可见的特点 (图 3),我们还将
hmGFP应用于有关表达载体的改造 ,就启动子的效
率 (promo ter)、多克隆位点及核糖体结合位点
(RBS)、高效的起始密码子和终止密码子 、基因编码
区 、编码阻遏蛋白的调节基因以及抗性基因和复制
原点等转录和翻译过程的各种表达元件的组成方面
加以完善(Data not shown here)。
实验中还发现 , pET21b-hmGFP的可溶性 、表达
量方面比 pETTRX-hmGFP 低 , 事实上 , pET21b和
pETTRX具有基本类似的表达元件 。这种同一个基
因不同表达系统的差异可能是因为前者以包涵体表
达为主 ,后者由于融合伴体 Trx的存在 ,可能起到了
诸如阻止包涵体的形成 、保护目的蛋白免遭细菌蛋
白酶的降解 ,又能帮助外源蛋白的正确折叠 ,因而使
胞内表达的蛋白具有较好的可溶性 ,生物活性更接
近天然蛋白等作用 。同时 , pET21b-hmGFP的表达
量虽不高 ,但也可诱导出自然光下可见的绿色和紫
外光下激发的强烈荧光 ,也说明了重组 hmGFP具有
荧光特性较强的特点 。在表达条件的优化研究中 ,
我们还发现 hmGFP在低温条件下较易获得功能性
表达 。据分析 ,低温条件不仅可以减缓 mRNA的翻
译速率 ,从而使结构复杂的蛋白质多肽有更充足的
时间折叠 、提高溶解性 ,而且还能促进富含半胱氨酸
的蛋白质在翻译后通过氧化作用形成二硫键 。此
外 ,低温下表达的另一个优点是可以限制细菌蛋白
水解酶对外源蛋白质的降解作用 ,这对于蛋白质合
成的初期尤为重要 [ 7] 。有意思的是 , hmGFP的较低
的功能性表达温度与海葵生存环境温度 (25 ～ 28
℃)基本一致 [ 8] 。
总之 ,本文有关巨型辐花海葵荧光蛋白类似物
基因的原核表达比较和诱导表达条件优化的研究部
分揭示了 hmGFP的生物学性质 ,预示着 hmGFP作
为标记分子的应用前景;也为下一步 hmGFP成熟重
组蛋白的纯化及其荧光波谱分析 、生物学特性及应
用研究奠定了良好基础 。
参考文献
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(收稿日期　2005 -06 - 03)
6
广州医学院学报 (JGZMC)　2005, 33(3)