全 文 ：文章编号:1671-2897(2008)07-431-05 ·论著·
九节龙 -Ⅲ经 BAD凋亡途径诱导胶质瘤
U251细胞凋亡
林洪 1　章翔 1＊　程光 1　汤海峰 2　章薇 1　董文鹏 1　甄海宁 1　曹卫东 1　(第四军医大
学:1西京脑科医院神经外科;2西京医院药剂科 , 陕西 西安 710032)
　　摘要　目的　研究九节龙 -Ⅲ诱导胶质瘤 U251细胞凋亡及其内在机制。方法　四甲基偶氨唑蓝
(MTT)分析药物对 U251细胞及胶质细胞增殖的影响;膜联蛋白 V-异硫氰酸荧光素 /碘化丙啶
(AnnexinV-FITC/PI)染色 、Hoechst33342染色和透射电镜检测细胞凋亡;Westernbloting分析Bcl-xL/
Bcl-2相关死亡启动子(BAD)蛋白表达和磷酸化水平。结果　九节龙-Ⅲ以剂量和时间依赖方式抑制
U251细胞活性(P<0.05, IC50 =8.2μg/ml), 诱导染色质浓聚边集 、凋亡小体形成等凋亡改变 , 且浓
度低于 40μg/ml时不抑制胶质细胞活性(P>0.05)。 Westernblotting发现 U251凋亡细胞内 BAD表
达明显增加 、去磷酸化并被裂解。结论　九节龙-Ⅲ 经 BAD去磷酸化和裂解的凋亡途径诱导了胶质
瘤 U251细胞的显著凋亡。
　　关键词　九节龙 -Ⅲ;　恶性胶质瘤;　凋亡;　BAD
　　中国图书资料分类号 　R730.2;R739.4　文献标识码　A
Ardipusilloside-Ⅲ inducedapoptosisinglioblastomaU251celsthroughBADapoptoticpathway
LINHong1 , 　ZHANGXiang1 , 　CHENGGuang1 , 　TANGHaifeng2 , 　ZHANGWei1 , 　DONGWenpeng1 , 　
ZHENHaining1 , 　CAOWeidong1
1DepartmentofNeurosurgery, XijingInstituteofClinicalNeuroscience;2DepartmentofPharmacy, XijingHospital,
FourthMilitaryMedicalUniversity, Xian710032, China
Abstract　 Objective　 ToinvestigatetheinducedapoptosisintheglioblastomaU251 cellsby
ardipusilloside-Ⅲ invitroandtheunderlyingmechanisms.Methods　 3-(4, 5-dimethylthiazol- 2-yl)-2, 5-
diphenyltetrazoliumbromideassaywasusedtodetecttheefectofardipusiloside-Ⅲ ontheproliferationofU251
celsandtheprimaryculturedgliocytes.AnnexinV-fluoresceinisothiocyanate/propidiumiodidestainingmethod,
Hoechst33342 stainandthetransmissionelectronmicroscopewereusedtoobservetheapoptosisofU251 cels.
WesternblotanalysiswasusedtodetectthelevelsoftotalBcl-xL/Bcl-2-associateddeathpromoterhomolog
(BAD)andthephospho-BAD.Results　Ardipusiloside-Ⅲ suppressedtheproliferationofU251celsinadose-
andtime-dependentmanner(P<0.05, IC50 =8.2 μg/ml)andinducedtypicalapoptoticchangessuchas
chromatincondensationandapoptoticbodyformation, however, ardipusiloside-Ⅲ atconcentrationbelow40μg/
mldidnotsuppresstheproliferationofthenormalgliocytes(P>0.05).Westernblotanalysisdemonstratedthe
increasedexpression, evidentdephosphorylationandcleavageofBADwhichgeneratedthetruncatedsmalBADin
U251 cels.Conclusion　Ardipusiloside-Ⅲ caninducesignificantapoptosisthroughBADdephosphorylationand
cleavageinhumanglioblastomaU251cels.
Keywords　Ardipusiloside-Ⅲ;　Glioblastoma;　Apoptosis;　BAD
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30370512, 30873402)
作者简介:林洪 ,博士研究生 ,电话:(029)84775330, E-mail:med-
lin@126.com
＊通讯作者:章翔 ,教授 、主任医师 ,电话:(029)84775323, E-mail:
xzhang@fmmu.edu.cn
　　研究表明皂甙具有广泛的抗肿瘤和诱导凋亡的 活性 ,并且对神经元有保护作用。九节龙-Ⅲ是从九
节龙全草中萃取的五萜皂甙 ,其分子结构为 C52 H84
O23(分子量:1076,图 1)。本研究旨在探讨九节龙 -
Ⅲ是否能抑制人恶性胶质瘤 U251细胞增殖并诱导
凋亡 ,分析其内在机制 ,为下一步动物实验和临床研
究奠定基础 。
·431·中华神经外科疾病研究杂志(ChinJNeurosurgDisRes)2008;7(5)
图 1　九节龙-Ⅲ的分子结构
Fig1　Molecularstructureofardipusiloside-Ⅲ
材料与方法
　　一 、材料
九节龙-Ⅲ承西京医院药剂科惠赠 ,纯度 >98%,用
二甲基亚砜(dimethylsulphoxide, DMSO)溶解 ,实验前
用 改 良 Eagle培 养 基 (DulbeccobmodifiedEagle
medium, DMEM)稀释到既定浓度(所含 DMSO浓度均
<1‰无细胞毒性)。U251细胞系本实验室冻存。
DMEM、新生牛血清 、胰酶购自 Gibico公司 。DNAlad-
der试剂盒购自天根生化。Hoechst33342荧光试剂盒
购自碧云天公司。青 、链霉素和四甲基偶氮唑蓝(3-
(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium
bromide, MTT)购自 Sigma公司 。抗 BAD兔多克隆抗
体 、抗磷酸化-BAD兔多克隆抗体 、抗肌动蛋白鼠多克
隆抗体 ,辣根过氧化物酶标记抗兔二抗 ,辣根过氧化物
酶标记抗鼠二抗 , 化学发光自显影 (Enhanced
chemiluminescene, ECL)发光系统均为 Celsignal产
品。酶标仪 、DNA电泳仪和蛋白电泳仪均为 Bio-rad产
品。荧光摄像系统为莱卡公司产品 。凝胶成像系统为
阿尔法公司产品 。
二 、方法
1.细胞培养:U251细胞在含 10%新生牛血清 ,
100U/ml青霉素 , 100μg/ml链霉素的 DMEM培养液
中常规培养 。经医学研究伦理委员会许可 ,神经胶质
细胞取自知情同意的脑创伤患者的受损局部脑组织
碎片的原代培养 ,胰酶消化并反复吹打洗涤成单细胞
悬液 ,离心收集并常规传代培养 。
2.MTT分析:取 U251细胞消化 、洗涤 ,重悬 ,按
5×103 /孔接种于 96孔板。实验设 6、12、24、72 h4
组 ,每组设含 2.5、5、10、20、40 μg/ml九节龙-Ⅲ的 5
个处理组和含 1‰ DMSO的对照组 ,每组设 6个复
孔 ,并设空白对照调零。待细胞进入对数生长期后 ,
换成含既定浓度九节龙 -Ⅲ的培养液继续培养 6、12、
24、72 h,每孔加 20 μL5 g/L的 MTT继续培养 4 h,
去上清 ,每孔加 150μlDMSO振荡溶解 10min。酶标
仪检测各孔 490 nm波长的光密度值。数据采用
SPSS13.0进行统计描述 ,并行 ANOVA方差分析 ,组
间差异采用 Dunnet-t检验。
3.流式细胞仪膜联蛋白 Ⅴ -异硫氰酸荧光素
(AnnexinV-fluoresceinisothiocyanate, AnnexinV-
FITC)和碘化丙啶(propidiumiodide, PI)双染检测凋
亡率:分别消化收集 3.7、8.2 μg/ml九节龙-Ⅲ处理
12、24 h组和 DMSO对照组 U251细胞 ,调整细胞浓
度至 1×107 /ml,加入预冷的结合缓冲液 100 L重悬
细胞 ,置冰浴;加入 5μlAnnexinV-FITC和 5μlPI于
细胞悬液 ,轻轻混匀;试管置于 4℃避光染色 10 min;
补加 490 μl结合缓冲液混悬细胞 ,流式细胞仪进行
检测 ,分析用药后细胞凋亡的百分比 。
4.凋亡细胞的 Hoechst33342荧光检测:实验设
6、12、24、48h4组 ,每组设含 3.7、8.2 μg/ml九节龙 -
Ⅲ处理组和 DMSO对照组 ,按荧光染色试剂盒说明书
方法逐步进行后 ,荧光显微镜下摄片 。
5.凋亡细胞的透射电镜观察:消化收集 DMSO
对照组 U251细胞和 8.2 μg/ml九节龙-Ⅲ处理 24 h
的 U251细胞 ,细胞计数 l×106 ～ l×107 , l500 rpm离
心 15min后 , 4%戊二醛固定 ,按常规 TEM样品做程
序性处理 ,行透射电镜观察 。
6.Westernblot分析:实验设 DMSO对照组和
8.2μg/ml九节龙-Ⅲ处理 6、12、24h组 。用放射免疫
沉淀分析(radioimmunoprecipitationassay, RIPA)裂解
液(150 mMNaCl, 1% NP-40, 0.5%去氧胆酸钠 ,
0.1%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺 , 50 mMTris-HCl,
10mMEDTA, 1mM原钒酸钠 、1mM苯甲基磺酰氟化
物(phenylmethylsulfonylfluoride, PMSF)裂解各组细
胞(4℃, 30 min),离心收集上清即为各组蛋白样品
(4℃, 12 000rpm, 30 min)。蛋白样品经 12%十二烷
基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 ,转膜(硝基纤维
素膜 , 0.22 μm)。将膜封闭 ,一抗孵育过夜(4℃,轻
摇),洗膜并二抗孵育 1 h,最后用 ECL系统暗室发光
显影并摄像。蛋白电泳的结果用 BandScan4.3分析
灰度值并作统计分析 。一抗分别为:抗 BAD兔多抗
抗体 、抗磷酸化-BAD兔多抗抗体 、抗肌动蛋白鼠多抗
抗体;二抗分别为辣根过氧化物酶标记抗兔二抗 ,辣
根过氧化物酶标记抗鼠二抗。
结　　果
　　一 、九节龙-Ⅲ显著抑制 U251细胞活性 ,且不抑
制人神经胶质细胞(图 2)
·432· 中华神经外科疾病研究杂志(ChinJNeurosurgDisRes)2008;7(5)
图 2　九节龙-Ⅲ对 U251细胞和神经胶质细胞活性的影响
Fig2　Efectofadipusiloside-Ⅲ onthecelviabilityofthehuman
glioblastomaU251celsandtheprimaryculturedhumangliocytes
＊P<0.05;＊＊P<0.01
九节龙 -Ⅲ以剂量和时间依赖方式显著抑制
U251细胞的增殖活性。 U251细胞活性经 5 μg/ml
九节龙 -Ⅲ处理 6 h即可降低到 71.3%(n=10, P<
0.05),而经 40 μg/ml九节龙-Ⅲ处理 72 h后则降至
12.6%(n=10, P<0.01)。九节龙-Ⅲ处理 U251细
胞 24h的 IC50为 8.2μg/ml。此外 ,浓度低于 40 μg/
ml的九节龙-Ⅲ并不抑制神经胶质细胞活性 , 40 μg/
ml九节龙 -Ⅲ作用人神经胶质细胞 24 h后 ,细胞活性
仍保持在 81.7%以上(n=10, P>0.05)。在一定剂
量窗内 ,九节龙 -Ⅲ抑制胶质瘤细胞的同时不损害脑
内大量存在的神经胶质细胞 ,表现出良好的安全性 。
二 、九节龙-Ⅲ诱导 U251细胞凋亡的流式细胞仪
分析(图 3)
图 3　九节龙-Ⅲ诱导 U251细胞凋亡的百分率
Fig3　ApoptoticratesofU251MGcelstreatedwithardipusiloside-Ⅲ
(%)
A:Normalcontrol;B:3.7μg/mlardipusiloside-Ⅲ treatedfor12hours;
C:3.7 μg/mlardipusiloside-Ⅲ treatedfor24 hours;D:8.2 μg/ml
ardipusiloside-Ⅲ treatedfor12 hours;E:8.2 μg/mlardipusiloside-Ⅲ
treatedfor24hours
3.7、8.2μg/ml处理 12、24h后的 U51细胞的凋
亡率(包括早期及晚期凋亡)分别为 20.2%、22.7%、
31.7%、60.8%,坏死率分别为 1.7%、2.6%、3.8%、
8.9%。九节龙-Ⅲ导致 U251细胞产生明显凋亡作
用 ,呈剂量和时间依赖性。
三 、九节龙-Ⅲ处理后细胞内染色质发生显著浓
聚边集 、并生成凋亡小体(图 4)
图 4　Hoechst33342细胞核染色(免疫荧光染色 , ×400)
Fig4　Hoechst33342celnucleusstain(immunofluorescencestainiag, ×
400)
A:Celcondensationandfractureofmarginalchromatin;B:Thelobulated
gemmulesofthecelnucleus;C:Apoptoticbody.Alpicturesweretaken
usinga×60objective.
Hoechst33342细胞核染色(×60)表明九节龙 -
Ⅲ处理的细胞内染色质形态发生剂量和时间依赖性
变化 ,染色质浓聚 、边集 、核裂解 、细胞核分叶状芽突
形成 ,最终演变成凋亡小体 。
四 、九节龙-Ⅲ作用的 U251细胞超微结构发生显
著的凋亡改变(图 5)
图 5　U251细胞超微结构的透射电镜观察
Fig 5 　 MicromorphologyofU251MG celsobserved byelectron
microscopy.
A:PedomorphismofnormalU251 celswithgenerousorganeles(×3
700);B:Vacuolescontainedcytoplasmandnucleolusfractionsbuddingof
thecytomembrane(×15 000);C:Marginalchromatincondensation(×7
500).
九节龙 -Ⅲ作用的 U251细胞超微结构发生显著
凋亡改变。透射电镜检查到细胞微绒毛消失 ,溶酶体
增多 ,染色质浓聚边集 。此外我们还观察到很多包含
细胞膜 、细胞浆和部分裂解后的细胞核的泡状结构以
出芽的方式从细胞膜破出。这些破出的泡状结构最
终将演变为凋亡小体 。
·433·中华神经外科疾病研究杂志(ChinJNeurosurgDisRes)2008;7(5)
五 、九节龙-Ⅲ处理后 U251细胞内 BAD表达增
加 ,并发生显著去磷酸化和裂解(图 6)
图 6　蛋白印迹分析
Fig6　Werternblotanalysis
Werternblot分析揭示了 BAD凋亡途径与九节
龙 -Ⅲ诱导的 U251细胞凋亡之间的关系。 BAD总蛋
白的表达在整个凋亡过程中明显增加 。我们检测到
凋亡细胞蛋白中磷酸化 BAD(Ser136位点)水平在
8.2μg/ml九节龙-Ⅲ作用 6 h后即轻微下降 ,而 24 h
后则下降至 78.4% ±0.1%(P<0.01)。此外 , BAD
蛋白(23kDa)还被下游激活的酶解信号切割出小分
子片断(15 kDa)的截短型 BAD(truncatedBADsmal
unit, tBADS)。 tBADS/actin水平在九节龙-Ⅲ作用 6
h后即开始上升 , 24 h后升至 87.8% ±0.2%
(P<0.01)。
讨　　论
　　包括手术切除 、放化疗的常规治疗手段对恶性胶
质瘤(WHO4级)并不完全奏效 ,术后残存肿瘤往往
不可避免的侵袭瘤周组织而造成肿瘤复发 [ 1, 2] 。恶
性胶质瘤往往对放化疗产生耐受 ,因此很多针对恶性
胶质瘤的药物研发获取了极大的吸引力[ 3] 。大量实
验研究 、流行病学调查和人体临床试验提示皂甙类化
合物具有重要的抗肿瘤作用 [ 4, 6] ,并且在作为免疫佐
剂治疗 [ 7] 、发挥神经保护功能 [ 8]方面效果显著。
体外研究发现九节龙 -Ⅲ皂甙能以剂量和时间依
赖方式有效抑制人恶性胶质瘤 U251细胞的增殖活
性 ,而与此同时九节龙 -Ⅲ在一定剂量窗内并不会抑
制脑内作为支持细胞的正常神经胶质细胞的活性。
这为九节龙 -Ⅲ在以后的体内研究和临床试验的剂量
和时间设计提供了有益的借鉴。研究证实九节龙-Ⅲ
引发了包括细胞皱缩脱壁 、染色质凝聚边集和凋亡小
体形成等一系列凋亡形态改变 ,故而我们认为九节
龙 -Ⅲ对恶性胶质瘤的抑制作用主要是通过诱导细胞
凋亡产生的 。
BAD在内源性线粒体凋亡途径中发挥了中枢作
用 [ 9 ～ 11] 。凋亡信号和药物处理信号都由 BAD整理
并转呈至线粒体外膜 ,藉此触发半胱天冬酶 caspase
依赖性凋亡进程[ 12 ～ 14] 。 BAD在人体内呈组织特异
性分布 ,脑内含量最高 [ 15] 。恶性胶质瘤 U251、U87、
U138细胞和神经母细胞瘤 SH-SY5Y细胞内磷酸化
BAD的表达增加 ,提示其为恶性胶质瘤发生的重要
原因 [ 16 ～ 18] 。接受上游凋亡信号后 , BAD迅速去磷酸
化并自细胞浆转位至线粒体外膜 。非磷酸化 BAD强
烈干扰 BCL-xL-BAX聚合物的稳定性 ,将 BAX从中
置换出来。解离后的 BAX作用于线粒体外膜形成通
透性改变孔道 ,导致线粒体膜电位变化和 Cytc、AIF
外流 , BAX结合 Apaf-1(apoptosisactivationfactor, 凋
亡激活因子)并与 ATP、pro-caspase9、Cytc一起形成
凋亡体 , 触发整个凋亡事件的发生 [ 19] 。我们采用
Westernblot法分析了九节龙 -Ⅲ诱导的凋亡进程中
细胞内 BAD磷酸化水平和总体表达水平的变化。结
果表明九节龙 -Ⅲ作用后细胞中 BAD的总体表达水
平上升而磷酸化 BAD的表达水平呈时间依赖性迅速
下降。研究还观察到随着凋亡时间的延长 , tBADS的
表达水平稳步上升 。研究认为 tBADS各磷酸化位点
很少被磷酸化 ,从而具有更强的促凋亡能力[ 20] 。我
们的实验结果与上述研究是一致的 ,这表明 BAD去
磷酸化和酶解凋亡途径参与了九节龙-Ⅲ诱导的恶性
胶质瘤细胞凋亡 ,是其重要的内在机制。
研究证实九节龙 -Ⅲ通过诱导恶性胶质瘤细胞凋
亡发挥显著的抗肿瘤活性 ,并且 BAD去磷酸化和酶
解凋亡信号途径是其重要的内在分子机制。结果表
明九节龙-Ⅲ具有良好的应用前景 ,并值得在体外实
验和临床试验中深入研究 。
参　考　文　献
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