全 文 ：基金项目：本研究由国家自然科学基金项目(30271093)资助。
分子植物育种，2007，第 5卷，第 3期，第 424-430页
Molecular Plant Breeding, 2007, Vol.5, No.3, 424-430
新基因、新种质、新品种
New Gene & Germplasm
甜杨抗冻转录因子ICE1基因的in silico克隆及其分析
林元震1,2* 张志毅2 刘纯鑫1 郭海3 朱保庆2 陈晓阳1
1 华南农业大学林学院, 广州, 510642; 2 北京林业大学林木花卉遗传育种教育部重点实验室, 北京, 100083; 3 水利部水土保持植物中心, 北京, 100038
* 通讯作者, yzhlin@scau.edu.cn
摘 要 ICE1基因编码类似MYC的 bHLH转录因子，可特异地结合到 CBF3启动子的MYC作用元件
并诱导 CBF/DREB1下游基因的转录表达。本文采用电子克隆的方法，以拟南芥 ICE1蛋白序列为信息探
针，利用杨树 EST数据库和毛果杨基因组序列拼接的结果，设计引物并通过 RT-PCR从甜杨克隆了杨树
的第一个 ICE1基因。其 cDNA长 1 706 bp，含有完整的开放阅读框，可编码 543个氨基酸的MYC类蛋白。
编码蛋白序列含有 bHLH区，核定位信号 (NLS)区，富 S区和转膜区各 1个。Blast分析表明，cDNA序
列及其推导的氨基酸序列均与拟南芥和芥菜的 ICE1存在着较高的同源性，说明所获得的 cDNA可能是甜
杨 ICE1基因 (PsICE1, DQ481236)。通过网络服务器平台进行 PsICE1的功能预测，结果显示 PsICE1含有
bHLH保守功能域，具有多个磷酸化位点和跨膜区域。另外，ICE1的电子表达谱分析结果发现，ICE1几
乎可在植物中整株表达，在多种组织和不同发育过程均表达，这也在一定程度上说明了 ICE1是组成型表达，
以及 ICE1可能在植物的生长发育中也起着重要作用。
关键词 PsICE1, in silico克隆, 甜杨, 转录因子, 抗冻性
in silico Cloning and Analyzing of PsICE1 from Populus suaveolens, A Freez-
ing-resistant Transcription Factor
Lin Yuanzhen1,2* Zhang Zhiyi2 Liu Chunxin1 Guo Hai3 Zhu Baoqing2 Chen Xiaoyang1
1 College of Forestry, South China Agricultural University, Guangzhou, 510642; 2 Key Laboratory for Genetics and Breeding in Forest Trees and Ornamental
Plants, MOE, Beijing Forestry University, Beijing, 100083; 3 Plant Materials for Soil and Water Conservation, Ministry of Water Resources, Beijing, 100038
* Corresponding author, yzhlin@scau.edu.cn
Abstract ICE1 encodes a MYC-like bHLH transcriptional activator, which could specially band to active do-
main of CBF3 promoter and induce transcriptal expression of cold-responsive genes downstream of CBF/DREB1.
In this paper, we made the gene-specifi c primers based on the Populus EST information and P. trichocarpa ge-
nomic sequences, as well as Arabidopsis ICE1 protein sequences, then we got the poplar ICE1 gene (GenBank Ac-
cession: DQ481236) from P. suaveolens by RT-PCR approach. The full length PsICE1 was 1 706 bp with a 1 629
bp open reading frame (ORF) and encoded a MYC-like protein of 543 amino acids. The predicted PsICE1 protein
contained a nuclear localization signal (NLS), a serine-rich region (S-rich), a trasmembrane domain, N-glycosyl-
ation and kinase phosphorylation sites. Blast analysis revealed that PsICE1 was highly homologous to ICE1 from
Arabidopsis thaliana and Capsella bursapastoris, which indicates that the cloned cDNA would be PsICE1 gene.
Functional prediction in net server showed that PsICE1 had a potential basic helix-loop-helix (bHLH) with some
phosphorylation sites and transmembrane domain. Moreover, electronic expression profiles revealed that ICE1
could be expressed in all of plants and as well expressed at the different stages of growth and development, it
might be obvious that ICE1 gene expression would be constitutive and it also might play an important role in the
growth and development of plants.
Keywords PsICE1, in silico cloning, Populus suaveolens, Transcription factor, Freezing resistance
425
低温是限制植物分布与生长的重要环境因素之
一，而且低温冻害是全球农林业普遍存在的自然灾
害，给全世界农林业造成了巨大的损失，全球每年
因低温伤害造成农作物的损失高达数千亿美元，已
引起各国政府和学者的普遍关注。多数植物在与寒
冻漫长的抵御过程中，逐渐进化形成了一套感受及
传导寒冷信号的系统，并能产生一系列适应低温
的变化，以增强抗冻性。Weiser (1979)首次提出植
物在适应低温的过程中基因表达发生改变的观点。
Guy等 (1985)也研究发现冷驯化能诱导和增强一些
基因的表达，使多种基因表达发生改变。这类基因
所表达的蛋白称为低温诱导蛋白。近年来，国内外
在植物抗冻方面开展了大量工作，研究结果表明冷
诱导基因在植物抗低温和冷驯化过程中起着重要的
作用 (Thomashow, 1999)。这些冷诱导基因编码的产
物可以分为两类，一类是与植物抗寒性的提高直接
相关的功能性蛋白，比如一些涉及脂类代谢、糖代
谢以及抗氧化的酶，分子伴侣，抗冻蛋白，其它起
渗透调节作用的物质；另一类是调控性蛋白，参与
寒冷信号传导的调控、抗寒基因表达的调控和抗寒
蛋白活性的调节，比如 CBF1 (Shinozaki et al., 2003)。
一些冷诱导基因往往都含有 DRE/CRT顺式作
用元件，核心序列为 CCGAC，常可被转录因子
CBFs或 DREB1s家族识别、结合进而启动下游低
温应答基因和脱水答应基因的转录表达 (Stockinger
et al., 1997)。有趣的是，CBFs或 DREB1s本身也
受低温诱导，然后才就进一步诱导含有 DRE/CRT
作用元件的下游基因的表达。因此，低温胁迫下的
基因表达网络是一个级联连锁反应过程。CBFs或
DREB1s基因的超表达，可在室温下启动下游基因
的表达，并提高转化植物的耐寒能力。在放入低温
环境后不到 15 min，CBF/DREB1才开始转录，可
见 CBF/DREB1基因本身也是由低温诱导的。因
此 Gilmour等 (1998)提出了一种假说，认为存在
一种转录因子 ICE (inducer of CBF expression)，在
正常温度环境下以非活化状态存在，而当植物面
临低温胁迫时，ICE蛋白或与之相作用的蛋白被激
活，并识别 CBF/DREB1基因的启动子，进而诱导
CBF/DREB1基因的转录。Chinnusamy等 (2003)首
次化学诱导基因突变的方法分离出低温诱导的组成
型突变体 ice1，发现突变体 ice1极大抑制了 CBF3
的表达以及降低了一些受 CBFs调控的下游基因的
表达，而且突变体的耐寒力明显下降。他们进一
步采用图位克隆法分离了 ICE1基因，它编码类似
MYC的 bHLH转录因子，可特异地结合到 CBF3
启动子的MYC作用元件，并诱导 CBF3调控的下
游基因的表达。另外，ICE1基因是组成型表达，但
它的超表达可在低温下增强 CBF3的转录表达并提
高转基因植株的耐寒能力。因此，ICE1基因在拟
南芥的抗寒中起着关键性的调控作用。最近，Lee
等 (2005)采用基因芯片的方法从整个转录组水平
上研究了 ICE1在拟南芥耐寒及其在基因表达调控
中的作用，ice1突变体影响了一些低温胁迫早期应
答基因以及受 ABA或生长素调控基因的表达，进
一步验证了 ICE1在植物低温胁迫应答中起着关键
性的核心作用。Wang等 (2005) 采用 Race法从芥
菜 (Capsella bursapastoris)中分离到一个新的 ICE1
基因 Cbice53，与拟南芥 ICE1基因高度同源，低
温和盐胁迫处理可提高 Cbice53的表达。国内学者
Huang和 Sun (2005)首次将拟南芥 ICE1通过农杆
菌介导法成功转入柠檬 (Citrus Limon)，关于转基因
植株的抗寒性检测正在进行中。迄今，ICE1基因仅
从拟南芥 (Chinnusamy et al., 2003)和芥菜 (Wang et
al., 2005)中分离到，未见有其它植物的报道，尤其
是木本植物。
甜杨 (Populus suaveolens)属青杨派，主要分布
在中国大兴安岭东北及漠河一带，其生存区的年平
均气温为 -3.8℃，冬季气温为 -40.5~-27.4℃，极
端最低气温为 -46.9℃，是研究木本植物抗冻性及
有关抗冻基因克隆问题的理想材料。本文采用电子
克隆的方法，以拟南芥 ICE1蛋白序列为信息探针，
从毛果杨基因组中找到与之高度同源的毛果杨基因
组序列，通过 Softberry网站的 FGENESH预测、拼
接以及结合杨树的 EST数据库，利用 RT-PCR从甜
杨中克隆了第一个杨树 ICE1基因，并进行了相关
序列分析和结构预测，为研究其在甜杨抗冻中基因
表达的调控作用机制奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料
采取多年生甜杨 (P. suaveolens)幼苗的嫩枝条作
为外值体，消毒后接种到启动培养基 (改良MS + BA
0.5 mg/L + NAA 0.1 mg/L)上，培养温度 (25±2)℃，
光照 16 h/d，光照强度 2 200 Lux。等启动培养基的
芽萌动并长出 1~2片小叶，这时将芽转接到增殖培
养基 (改良MS + BA 0.3 mg/L + NAA 0.1 mg/L + GA
0.1 mg/L)快繁，然后接到生根培养基 (1/4改良MS +
甜杨抗冻转录因子ICE1基因的in silico克隆及其分析
in silico Cloning and Analyzing of PsICE1 from Populus suaveolens, A Freezing-resistant Transcription Factor
426 分子植物育种
Molecular Plant Breeding
IBA 0.1 mg/L + NAA 0.1 mg/L)上进行生根 (林元震
等, 2004)。甜杨的生根无菌苗就可作为 RNA提取的
试材。
1.2 甜杨总 RNA的提取
采用 CTAB法制备总 RNA (Lin et al., 2004)。甜
杨组培苗，4℃处理 24 h后，取 1 g加 10% PVPP，
用液氮研磨成细末，加入 15 mL 65℃预热的 CTAB
提取液 [2% CTAB, 3% PVP-40, 25 mmol/L EDTA, 2.0
mol/L NaCl, 100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) and 3% β-
巯基乙醇 ]，振荡 1 min，65℃继续水浴 5 min。向
上述混合液中加入等体积氯仿抽提 2次，每次振荡
10 min，18℃ 12 000×g离心 20 min。取上相，加 1/3
体积 8 mol/L LiCl，混匀，4℃沉淀过夜。12 000 ×g
4℃离心 20 min，用 800 μL 0.5% SDS溶解沉淀，加
等体积的氯仿抽提 2次。取上清，加 2倍体积 -20℃
预冷的 100%乙醇，-20℃放置 2 h。12 000 ×g 4℃离
心 20 min，70%漂洗沉淀 2~3次后，晾干沉淀，用
适量 DEPC处理后的 ddH2O溶解。
1.3 杨树 ICE1全长基因的电子克隆
以 TAIR数据库 (http://www.arabidopsis.org/)拟
南芥 ICE1氨基酸序列 (AAP14668)为信息探针，
Blastp搜索毛果杨基因组数据库 (http://genome.jgi-
psf.org/Poptr1/Poptr1.home. html)，下载所匹配分
值高的杨树基因组序列，在 Softberry网站 (http://
www.softberry.com/berry.phtml)进行基因结构分析，
所得外显子拼接的新序列就是预期的杨树 ICE1
基因，而后对新序列，Blastn搜索 NCBI的杨树
ESTs，用 Clustal W 1.83多序列比对寻找高度保守
区域设计引物，扩增甜杨 ICE1基因。
1.4 甜杨 ICE1基因的 RT-PCR扩增、克隆及其鉴定
以甜杨组培苗 4℃处理 24 h的总 RNA为模板，
采用 Access One-Step RT-PCR (Promega)试剂盒进
行 RT-PCR。正义引物为 ICE02U (5-AAAAAAGA
CTGGAAAAAAACCATGC-3)，反义引物为 ICE02D
(5-TCCCGTCAATAGGCAACTGAAGTTC-3)。 扩
增程序：第一链 cDNA合成 48℃ 45 min；PCR二
次扩增，94℃预变性 4 min，94℃ 变性 30s、57℃
退火 1 min、68℃ 延伸 2 min，30次循环，68℃ 最
后延伸 10 min。获得的 cDNA片段采用 Winzard
PCR Preps DNA Purifi cation System 试剂盒回收，然
后克隆至 pGEM-T Easy载体。挑取阳性克隆交由上
海基康生物技术有限公司测序。
1.5 甜杨 ICE1蛋白序列的结构分析
首 先 在 ART 数 据 库 (http://smart.embl-heide.
berg.de/)进行结构功能域的分析。其次，通过
NCBI网站 BLAST后，选择与甜杨 ICE1同源性较
高的其它植物 ICE1转录因子用 Clustal W 1.83进行
多重比对。同时，以甜杨 ICE1蛋白为信息探针，
Blastp搜索毛果杨基因组数据库。
1.6 甜杨 ICE1基因的功能预测
在 Profi leScan服务器进行结构位点 (Prosite)、
膜体 (Motif)分析。电子表达谱分析以目的基因序
列检索 NCBI数据库，获得待分析序列的 UniGene
编号后，就可通过参与形成 UniGene Cluster的序列
的组织 /细胞来源间接地分析序列在何种组织中表
达，体现在字段“cDNA sources”中。
2 结果与分析
2.1 甜杨 ICE1基因全长 cDNA的序列分析
根据设计的引物 ICE02U和 ICE02D，以合成
的第一链 cDNA为模板进行 PCR扩增，获得一条 1.7
kb左右特异的预期 cDNA片段，测序结果表明目的
基因 cDNA长 1 757 bp，具有一个最大完整编码框，
可编码 560个氨基酸，分子量为 61.3 kD，等电点
pI为6.31 (图1)。编码的氨基酸序列中，Ser含量最高，
达 11.79%，Leu含量其次 (为 11.43%)，Gly含量居
第三 (8.39%)，含量最低的是 Trp (为 0.36%)，非极
性 (疏水)氨基酸含量为 36.08%，极性 (亲水)氨基
酸含量为 63.92%。可见，所编码的 ICE1蛋白为亲
水性蛋白，这与冷调节蛋白 (cold regulated proteins，
CORPs)的氨基酸组成相似 (林元震, 2006)。另外，
PsICE1序列中含有 7个 Cys，分别位于第 41、111、
205、463、493、521和 535位氨基酸 (图 1)，预示
PsICE1可能含有二硫键，这对维持其结构稳定及功
能行使具有重要意义。ART数据库 Smart分析表明，
PsICE1含有富 S区，NLS区和转膜区 (图 1)，表明
PsICE1可能为转录因子，通过 NLS区和转膜区的
作用进入细胞核启动调控基因的表达。
Blast结果表明，甜杨与拟南芥、芥菜 ICE1蛋
白质序列的同源性分别为 44%、43%。同时，以
PsICE1为信息探针搜索杨树基因组，发现在基因
组中有两个同源区域，分别位于 LG_VII和 LG_XV
染色体上 (图 2)，品配碱基为 1 857 bp和 1 683 bp，
这可能就是毛果杨 ICE1基因组所在的位置，经软
427甜杨抗冻转录因子ICE1基因的in silico克隆及其分析in silico Cloning and Analyzing of PsICE1 from Populus suaveolens , A Freezing-resistant Transcription Factor
图 1 甜杨PsICE1基因的cDNA和编码蛋白序列
注: PsICE1的始终密码子, 富S区, NLS区和转膜区分别用下划线+粗体, 下划线, 阴影和阴影+粗体表示
Figure 1 The cDNA sequence and its coding amino acid sequence of PsICE1
Note: The start and end condons, S-rich domain, NLS and transmembrane segments of PsICE1 are indicated with underlined+bold,
underlined, shadowed and shadowed +bold, respectively
图 2 甜杨ICE1 cDNA片段与杨树基因组的Blast分析
Figure 2 Blast analysis of P. suaveolens cDNA in poplar genome
428 分子植物育种
Molecular Plant Breeding
件预测所编码的蛋白命名为 PtICE1和 PtICE2。对
上述 ICE蛋白序列作进一步的同源性分析，甜杨
ICE1与毛果杨假想 ICE蛋白序列同源性高达 90%，
多重比对结果显示 (图 3)，甜杨与拟南芥、芥菜以
及毛果杨假想的 ICE1蛋白质序列在 C端高度保守，
该区域即为 bHLH功能区。
上述结果表明甜杨 cDNA序列可能是植物
ICE1基因家族的一个新成员，命名为 PsICE1，基
因登记号为 DQ481236。
2.2 新蛋白Motif、Prosite分析
在 Profi leScan服务器进行结构位点 (prosite)、
膜体 (motif)分析。结果显示 PsG6PDH中存在 7
种结构位点：6个 N- 糖基化位点 (N-glycosylation
site)，1个依赖 cAMP和 cGMP的蛋白激酶磷酸
化位点 (cAMP- and cGMP-dependent protein kinase
phosphorylation site)，6个蛋白激酶 C磷酸化位点
(protein kinase C phosphorylation site)，7个酪蛋白
激酶Ⅱ磷酸化位点 (casein kinase Ⅱ phosphorylation
site)，1个酪氨酸激酶磷酸化位点 (tyrosine kinase
phosphorylation site)，10个 N- 十四酰化位点 (N-
myristoylation site)，2 个 氨 基 化 位 点 (amidation
site)，1个膜脂蛋白脂附着位点 (prokaryotic mem-
brane lipoprotein lipid attachment site) 和 1 个 MYC
类型 bHLH结构域 (Myc-type, ‘helix-loop-helix’ di-
merization domain signature)。由上可知，PsICE1可
能属于MYC类型 bHLH转录因子家族，这点与拟
南芥和芥菜的 ICE1相似。另外，PsICE1蛋白激酶
磷酸化位点最多，总共有 15个，蛋白激酶磷酸化
位点的存在，表明 PsICE1行使生理生化功能前可
图3 甜杨与拟南芥、芥菜及毛果杨预测的ICE1蛋白的同源性分析
注: ICE1的bHLH结构域用框表示
Figure 3 Comparison of the deduced ICE1 sequence from Populus suaveolens with Arabidopsis thaliana, Capsella bursapastoris and
Populus trichocarpa (candidate)
Note: The bHLH domains of ICE1 are indicated with box
429
能需要磷酸化的活化。
2.3 新基因的电子表达谱
利用 UniGene数据库进行电子表达谱分析。选
择 NCBI的 blastn程序，用 PsICE1检索 UniGene，
通过 UniGene进行 ICE1的表达分析，结果显示，
ICE1检索到拟南芥 (A. thaliana)的一个 UniGene
At.25302，cDNA表达谱显示：拟南芥 ICE1在花
和果实混合体、不同发育阶段 (从萌发到成熟种
子)、未成熟果实、种子及整株植物中均表达。另
外，检索到其他植物的同源性 UniGene，玉米 (Zea
mays, UniGene Zm.7143)、水稻 (Oryza sativa, UniGene
Os.13595) 和 马 铃 薯 (Solunam tuberosum, UniGene
Stu.2036)，几乎都是整株表达，在根，叶，茎，花，
种子 (萌发，休眠)以及愈伤组织等多种组织和细胞中
表达。上述结果充分说明了 ICE1是组成型表达，以
及 ICE1可能在植物的生长发育中也起着重要作用。
3 讨论
分离和克隆基因是研究基因结构、功能以及表
达调控的基础，随着分子生物学技术的迅速发展，
寻找新基因、克隆新基因的方法也不断得到发展和
完善。在众多方法中，分离和克隆基因的经典方是
采用差减杂交、原位杂交筛选 cDNA文库、mRNA
差异显示 (DDRT)或 cDNA末端快速扩增 (RACE)，
这些方法的特点是费时费力、花费高、成功率低，
所以未得到广泛运用。电子克隆 (in silico cloning)是
近年来伴随着基因组计划和 EST计划发展起来的基
因克隆新方法，其主要原理是利用生物信息学技术，
借助电子计算机的巨大运算能力，通过 EST或基因
组的序列组装和拼接，再利用 RT-PCR快速获得功
能基因，该方法具有成本低、速度快、技术要求低
和针对性强等优点。随着人类、拟南芥、水稻等基
因组计划的实施，已有研究人员利用电子克隆的方
法从人类、水稻等中克隆了一些功能基因。目前杨
树 EST数据非常丰富，而且 EST数目每天还在高速
增加。2003年底毛果杨基因组序列测序完成及其资
料免费公开发布，以及日益丰富的杨树 EST数据，
使电子克隆分离杨树基因成为可能，并将极大加速
杨树新基因的发现和功能鉴定研究 (林元震, 2006)。
本试验采用电子克隆法成功分离出杨树转录因
子 PsICE1基因，并进行了全长 cDNA序列测定及
分析。同源分析结果表明，该基因与拟南芥和芥菜
的 ICE1蛋白以及毛果杨推测的 ICE1蛋白基因具
有高度同源性，而且，PsICE1含有 bHLH转录因
子基因家族的特异基序 (motif)，这表明所克隆的基
因的准确性。PsICE1蛋白中 NLS区和转膜区的存
在，也为其是转录因子提供佐证。同时，bHLH结
构域和序列的高度保守性和相似性，为推测 PsICE1
在功能上的相似性提供了依据，也为进一步采用
RNAi干扰技术验证功能提供了靶序列。PsICE1含
有蛋白激酶 C磷酸化位点等 15个，蛋白激酶磷酸
化位点的存在，表明 PsICE1行使生理生化功能前
可能需要磷酸化的活化，这与拟南芥 ICE1的研究
结果一致 (Chinnusamy et al., 2003)。对新核酸序列
进行其所对应的基因的表达谱分析是了解该基因功
能的重要过程。电子表达谱分析结果进一步显示，
ICE1是组成型表达，以及 ICE1在植物的生长发育
中可能也起着重要作用。因此，PsICE1基因的克隆，
除了可研究其在甜杨各组织器官及其低温胁迫下的
表达状况，了解其在甜杨抗冻中的表达调控模式和
作用机理外，还可以通过操作 ICE1基因，研究其
在植物的生长发育中的作用，尤其是在耐低温能力
形成过程中的网络调控作用，并可为今后借助基因
工程技术提高植物抗寒冻性，培育农林作物抗寒新
品种的分子育种工作奠定基础。
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Masahiro Yano教授
Masahiro Yano教授，日本农业生物科学国家研究所，应用基因组实验室主任。1979年大学毕业于九
州大学农学院，获得学士学位。1981年、1985年分别于九州大学获得硕士和博士学位。1979年到 1985年间，
Yano主要参与关于调控淀粉含量的胚乳突变体的遗传分析。1986年至今，工作于北陆农业试验场和日本
农业生物科学国家研究所，参与农林渔业部水稻基因组计划的研究。在国际国内知名杂志上发表论文上
百篇。
2007年 3月 23-27日Masahiro Yano博士应邀出席了“第二届植物分子育种国际学术研讨会 (The 2nd
International Conference of Plant Molecular Breeding)”，并且做了题为“Genetic dissection, marker assisted
introgression, and pyramiding of agronomic traits in rice”的报告。其相应的报告摘要刊登在《分子植物
育种》2007年第 2期第 203-204页。