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狗肝菜中多糖提取工艺的比较研究



全 文 :狗肝菜中多糖提取工艺的比较研究
傅鹏1,2,朱华1*,张可锋2,廖儒佳2
(1.广西中医学院药学院,广西 南宁 530001;2.桂林医学院药学院,广西 桂林 541004)
摘要:目的 建立狗肝菜多糖的最佳提取方法和工艺。方法 分别选取微波法、超声波法和溶剂回流提取法制备狗肝菜
多糖。采用水提醇沉法得到粗多糖,再用Sevag法脱蛋白后,依次采用乙醚、无水乙醇、丙酮洗涤纯化,得精制多糖。比
较3种方法所得多糖产率和含量,从中筛选出最佳提取方法。采用最佳提取方法进行正交实验,以筛选出其最佳提取工
艺。结果 3种方法得到的多糖产率和含量存在较大差异,其中微波法多糖产率为7.10%,含量为70.10%,超声波法多
糖产率为4.66%,含量为61.42%,溶剂回流提取法多糖产率为9.15%,含量为87.90%。狗肝菜的最佳提取方法为溶
剂回流提取法,提取工艺最佳为料液比1∶20,提取时间2h,提取2次,温度85℃。结论 该提取方法和工艺适合于狗
肝菜中多糖的提取。
关键词:狗肝菜多糖;微波法;超声波法;溶剂回流提取法;工艺研究
中图号:R284.2 文献标志码:A 文章编号:1672-0482(2011)05-0445-04
Comparison Study on Extraction Procedures of Polysaccharide from Dicliptera chinensis(L.)Ness
FU Peng1,2,ZHU Hua1* ,ZHANG Ke-feng2,LIAO Ru-jia2
(1.School of Pharmacy,Guangxi University of Traditional Chinese Medical,Nanning,530001,China;2.Depart-
ment of Pharmacy,Guilin Medical University,Guilin,541004,China)
ABSTRACT:OBJECTIVE To establish the optimum extraction technology of polysaccharides from Dicliptera chinensis
(L.)Ness.METHODS The extraction effects of from Dicliptera chinensis (L.)Ness were compared by ultrasonic ex-
traction、microwave extraction and refluxing extraction.Polysaccharides of Dicliptera chinensis (L.)Ness were obtained
by hot water extraction and alcohol precipitation,using sevag method to remove protein,and in turn with ethyl ether,an-
hydrous ethanol,acetone washing crude polysaccharides;yield and content of polysaccharide were then compared by three
extraction methods,find the optimum extraction technology of polysaccharides fromDicliptera chinensis(L.)Ness.RE-
SULTS The yield and content of polysaccharides by three methods obtained varied greatly,yield 7.10%and content
70.10%of polysaccharides obtained by Microwave extraction,yield 4.66%and content 61.42%of polysaccharides ob-
tained by ultrasonic extraction,yield 9.15%and content 87.90%of polysaccharides obtained by refluxing extraction.The
optimum extraction technology of Dicliptera chinensis was refluxing extraction,and the optimum material ratio was 1∶
20,time being 2h,extraction for twice and temperature being 85℃.CONCLUSION From this,the optimum extraction
technology is refluxing extraction.
KEY WORDS:Dicliptera chinensis (L.)Ness polysaccharides;microwave;ultrasonic;refluxing extraction;extraction
technology
   狗肝菜为爵床科植物狗肝菜 Dicliptera
chinensis(L.)Nees的全草,其味苦、性寒,具有清
热、凉血、利尿、解毒等功效[1],临床常用于治疗热
病斑疹、便血、溺血、小便小利、肿毒疔疮等证,为
广西民间药食两用的中草药,也是壮族地区常用
壮药。目前对狗肝菜生药鉴别[2-3]、化学成分[4-5]、
含量测定[6-7]和药理作用[8]等方面的研究有一些
报道,但对狗肝菜多糖的工艺研究未见报道;本实
验应用微波法、超声波法、溶剂回流提取法3种不
同的方法提取狗肝菜多糖[9-13],并对3种方法进
—544—
南京中医药大学学报2011年9月第27卷第5期
JOURNAL OF NANJING TCM UNIVERSITY Vol.27 No.5 Sept.2011
收稿日期:2011-04-11;修稿日期:2011-08-05
基金项目:国家自然科学基金(30860393);广西自然科学基金青年基金(2011jB40086)
作者简介:傅鹏(1978-),男,广西桂林人,广西中医学院药学院讲师,药学博士。*通信作者:zhuhua@glmc.edu.cn
DOI:10.14148/j.issn.1672-0482.2011.05.021
行比较,以筛选出最佳提取方法,并进行正交实验
以筛选出其最佳提取工艺。
1 材料
1.1 药材
狗肝菜生药采于广西南宁北湖村,经朱华教
授鉴定为爵床科植物狗肝菜Dicliptera chinensis
(L.)Ness.。晒干,打成粗粉备用。
1.2 仪器与试剂
KQ5200DB型数控超声波清洗器;WP800格
兰仕微波炉;RE-52AA旋转蒸发仪;UV-2401PC
紫外可见分光光度计。所有试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 多糖测定方法
采用苯酚-浓硫酸显色-分光光度法。
2.2 狗肝菜多糖的提取和纯化
2.2.1 原材料预处理
将狗肝菜粉碎成粉末,置干燥箱于45℃烘
24h至恒质量,备用。
2.2.2 狗肝菜多糖的3种提取工艺
1)溶剂回流提取法:加20倍量水,水浴回流
提取2次,每次2h。水提液浓缩。
2)超声波法:加20倍量水,设定超声功率
200W,时间40min,温度66℃,共3次。水提液
浓缩。
3)微波法:加20倍量水,先中低火1min,再
低火6min,共5次。水提液浓缩。
2.2.3 狗肝菜多糖的纯化
各工艺水提液均合并浓缩至100mL,加入
95%乙醇至溶液含醇量达80%,振摇后于4℃冰
箱静置过夜沉淀;滤除上清液,沉淀用乙醚、无水
乙醇、丙酮依次洗涤至洗涤澄清,置60℃烘箱干
燥至恒质量,计算粗多糖产率:
多糖产率= M1
(多糖质量)
M2(称取药材质量)×100%

3种提取工艺多糖产率见表1。
表1 3种提取工艺的多糖产率比较
提取工艺 药材/g 多糖/g 多糖产率/%
微波法 10.008 4  0.710 4  7.10
超声法 10.005 6  0.466 6  4.66
回流提取法 10.007 1  0.915 9  9.15
2.3 狗肝菜多糖样品含量测定
2.3.1 标准曲线的绘制
2.3.1.1 标准葡萄糖溶液的配制
精密称取105℃干燥至恒质量的250mg,蒸
馏水溶解后定容至100mL。精确吸取此溶液1
mL,置于25mL葡萄糖标准品容量瓶中,稀释至
刻度摇匀(含葡萄糖100μg/mL),备用。
2.3.1.2 5%苯酚试剂的配制
取苯酚150g,加铝片0.15g和碳酸氢钠
0.065g,蒸馏,收集182℃馏分。称取10g,加水
溶解并定容至200mL,置棕色瓶内放冰箱中备
用。
2.3.1.3 最大吸收波长的选定
精密吸取葡萄糖溶液0.5mL,置10mL具塞
试管中,用蒸馏补充至2mL,加入1mL 5%苯酚
试剂,混匀,迅速加入浓硫酸5mL,摇匀,置沸水
浴中加热10min,取出置冰水浴中冷却至室温。
另以蒸馏水2mL同法操作,为空白对照。用分
光光度计在450~520nm波长处测定吸光度,确
定最大吸收波长为488nm。
2.3.1.4 标准曲线绘制
精密称取105℃干燥至恒质量的250mg,蒸
馏水溶解后,定容至100mL。精确吸取此溶液1
mL,置于25mL葡萄糖标准品容量瓶中,稀释至
刻度,摇匀(含葡萄糖100μg/mL),作为标准溶
液。分别准确吸取标准溶液0.2、0.3、0.4、0.5、
0.6mL于具塞试管中,用蒸馏水补充至2mL,以
蒸馏水作空白,每管加入5%苯酚溶液1mL,再
垂直快速加入浓硫酸5mL,摇匀,沸水加热15
min,取出置冰水浴中冷却至室温,于488nm处
测定吸光度值(A),经计算得回归方程:A=
0.060 6C+0.003 4,r=1。线性范围为20~60
μg。
2.3.2 换算因子的测定
精密称取多糖10mg,溶于200mL容量瓶
中,稀释至刻度,摇匀。精密吸取此溶液2mL于
具塞试管中,按照2.3.1项下的方法分别测定吸
光度,根据回归方程计算多糖溶液中葡萄糖的浓
度 ,按下式计算出换算因子:
f= WC·D=3.162

式中,W 为多糖质量(μg);C为多糖浓度
(μg/mL);D为稀释倍数。
2.3.3 样品溶液的制备
精密称取各样品多糖0.02g,加蒸馏水溶解
后定容至200mL。
2.3.4 样品含量测定
—644— 南京中医药大学学报2011年9月第27卷第5期
准确吸取各样品多糖溶液2mL按标准曲线
制作方法进行测定,根据标准曲线求算出样品显
色液中多糖浓度(C)。根据公式计算:
多糖含量=C
·D·f
W ×100%

计算各提取工艺狗肝菜多糖的含量。其中,
C为样品液中葡萄糖的浓度;D为稀释倍数;f为
换算因子;W 为样品质量(μg)。3种提取工艺多
糖含量见表2。
表2 不同提取工艺多糖含量比较
提取方法 A
多糖浓度/
(μg·mL
-1)
样品质量/g 多糖含量/% 平均值/%
溶剂法 0.437 3  7.160 1  0.020 18  89.752 7  87.898 0
0.418 9  6.856 4  85.946 7
0.428 8  7.019 8  87.994 5
超声法 0.302 1  4.929 0  0.020 65  60.380 2  61.424 6
0.297 3  4.849 8  59.409 9
0.322 4  5.264 0  64.483 7
微波法 0.367 2  6.003 3  0.020 16  75.327 1  70.095 5
0.398 1  6.513 2  81.725 2
0.260 5  4.242 6  53.234 2
  从表1和表2可见,溶剂回流提取法的多糖
产率和含量均高于微波法和超声法,因此,狗肝菜
多糖提取应以溶剂回流提取法为佳。故选用溶剂
提取法进行进一步正交实验,以筛选出其最佳提
取工艺。
2.4 溶剂提取法正交实验
2.4.1 单因素分析实验
2.4.1.1 提取时间对多糖得率的影响
以料液比1∶15,温度为90℃,提取2次,用
85%的乙醇沉淀,不同的提取时间1、1.5、2.0、
2.5h多糖得率分别为:2.30%、2.62%、2.86%、
2.87%,由结果所示,提取2.0h多糖得率相对较
高,随着时间延长,多糖得率不再增加,考虑其狗
肝菜中多糖的含量是一定的,在其它条件不变下
延长时间狗肝菜药材中一些其它成分会被提取出
来,干扰多糖的检测结果。
2.4.1.2 提取次数对多糖得率的影响
选择不同提取次数1、2、3,以1∶15的料液
比,在90℃下提取2.0h,用85%的乙醇沉淀,得
率分别为:2.70%、2.98%、3.01%,由结果所示,
提取3次多糖的得率相对较高,但提取2次和3
次得率相差不多,从工艺及操作上考虑选择提取
2次。
2.4.1.3 提取温度对多糖得率影响  
以料液比1∶15,提取2次,每次2.0h,用
85%的乙醇沉淀,不同的提取温度80、85、90、95
℃多糖得率分别为:2.80%、2.83%、2.85%、
2.86%,由结果所示,80℃以上提取温度对多糖
得率影响不是很显著,提取90℃多糖得率相对较
高,随着温度升高,多糖得率增加值不明显,故选
取90℃即可。
2.4.1.4 料液比对多糖得率的影响
选择不同的料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶
25,在温度为90℃,提取2次,每次2.0h,用85%
的乙醇沉淀,结果多糖得率分别为:2.72%、
2.81%、2.84%、2.86%,由结果所示,随着料液比
增大,多糖得率不断增加,在料液比1∶20以上
时,多糖得率增加缓慢,故选取料液比1∶20。
2.4.1.5 醇沉浓度对多糖得率的影响
以1∶20的料液比,在90℃下提取2次,每
次2h,选择不同醇沉浓度80%、85%、90%,结果
多糖得率分别为:3.09%、3.10%、3.10%,由结果
所示,80%以上醇对狗肝菜多糖沉淀度影响不大。
考虑能源,在工艺中选择80%的乙醇沉淀即可。
2.4.2 实验条件的选择
通过对提取时间、温度、次数、料液比和醇沉
浓度这5个因素进行分析,从中选取提取时间温
度,提取、料液比和次数4个因素,采用L9(34)表
做正交实验(表3),以狗肝菜多糖提取率作为衡
量提取效率的客观指标,以确定最佳提取工艺。
2.4.3 实验条件的确定
正交实验的结果表明(见表4,表5):影响因
素的主次顺序:A(提取时间)>D(料液比)>B
(次数)>C(温度),T1A<T2A<T3A,T1B<
—744—傅鹏,等:狗肝菜中多糖提取工艺的比较研究 第5期
T3B<T2B,T3C<T1C<T2C,T2D<T1D<
T3D,其中A、B、D3因素的P值均<0.05,故为
主要因素,C因素的P 值均>0.05,为非主要因
素,考虑能源,选择提取温度为85℃,故狗肝菜多
糖最佳工艺为A3B2C1D3,即提取时间2h,提取2
次,温度85℃,料液比1∶20。
表3 因素水平表
水平

提取时间/h

提取次数

提取温度/℃

固液比
1  1  1  85  10
2  1.5  2  90  15
3  2  3  95  20
表4 正交试验结果
试验

时间/h

次数

温度/℃

固液比
多糖得率/%
1  1  1  1  1  2.22
2  1  2  2  2  2.30
3  1  3  3  3  2.43
4  2  1  2  3  2.67
5  2  2  3  1  2.71
6  2  3  1  2  2.64
7  3  1  3  2  2.96
8  3  2  1  3  3.26
9  3  3  2  1  3.18
T1  6.95  7.85  8.12  8.11
T2  8.02  8.27  8.15  7.90
T3  9.40  8.25  8.10  8.36
SS  0.81  0.14  0.02  0.16
表5 提取工艺方差分析结果
方差来源 离均差平方和 自由度 方差 F值 P值
A  1.005 7  2  0.502 9 1117 <0.05
B  0.037 4  2  0.018 7 42 <0.05
C  0.000 5  2  0.000 3 0.3 >0.05
D  0.035 4  2  0.017 7 20 <0.05
误差 0.000 9  2
2.4.4 验证实验
按正交实验的优化条件对3批狗肝菜药材测
定多糖含量和得率,其平均值分别为(5.12±
0.11)% 和(3.26±0.3)%。3次差异较小,工艺
稳定。
3 讨论
由微波法、超声法、回流提取法3种提取方法
的结果比较可知,回流提取法狗肝菜多糖所得纯
度最高,为最佳提取方法。由正交试验设计的结
果可知,回流提取法狗肝菜多糖的最佳提取工艺
为:提取时间2h,提取2次,温度85℃,料液比1
∶20。该提取方法和工艺适合于狗肝菜中多糖的
提取,为今后狗肝菜多糖的进一步研究提供了实
验依据和基础研究。
参考文献:
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(编辑:李伟东 董宇)
—844— 南京中医药大学学报2011年9月第27卷第5期