全 文 ：· 1178 · 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (7): 1178−1182



荜拔油非皂化物预防胆固醇结石的形成
徐 霜 2, 胡金凤 1, 楚世峰 1, 韩 宁 1, 李静炜 2, 李月廷 3*, 陈乃宏 1*
(1. 天然药物活性物质与功能国家重点实验室, 新药作用机制研究与药效评价北京市重点实验室, 中国医学科学院、北京
协和医学院药物研究所, 北京 100050; 2. 天津中医药大学, 天津 300193; 3. 北京市中西医结合医院, 北京 100039)
关键词: 荜拔油非皂化物; 胆固醇结石; 胆固醇饱和指数
中图分类号: R965 文献标识码: A 文章编号: 0513-4870 (2013) 07-1178-05
Oil of Piper longum unsaponifiable matter prevents
cholesterol gallstone formation
XU Shuang2, HU Jin-feng1, CHU Shi-feng1, HAN Ning1, LI Jing-wei2, LI Yue-ting3*, CHEN Nai-hong1*
(1. State Key Laboratory of Natural Pharmaceutically Active Substance and Function, Beijing Key Laboratory of New Drug
Mechanism and Efficacy Evaluation, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union
Medical College, Beijing 100050, China; 2. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China;
3. Beijing Hospital of Integrated Traditional and Western Medicine, Beijing 100039, China)

Abstract: To observe the effect of various doses of oil of Piper longum unsaponifiable matter (OPUM) to
cholesterol gallstones in experimental mice. C57BL/6 mice (n = 60) were randomly divided into 6 groups: control
group, model group, OPUM (15, 30 and 60 mg·kg−1) group and ursodeoxycholic acid (UDCA, 60 mg·kg−1) group,
administered for 10 weeks. The level of serum lipid and liver function enzymes were tested. The gallbladder was
removed and bile was obtained by centrifugation. Next, the levels of the bile total cholesterol (TC), phospholipid
(PL) and bile acid (TBA) were measured. The indicators of lipid peroxidation were determined and cholesterol
saturation index (CSI) was calculated. The liver histological changes were observed by HE staining. The results
showed that serum TC, TG (triglycerides) and AST (aspartate transaminase) contents, gallbladder cholesterol
crystallization and CSI increased significantly (P < 0.05). In addition, the activity of SOD decreased significantly
and MDA content increased significantly in liver (P < 0.05). HE staining results showed that the hepatic cord
disorder and intracellular lipid droplets increased significantly. All results indicate that lithogenic diet lead to
the formation of cholesterol gallstones. In OPUM (30 and 60 mg·kg−1) group, serum TC, TG and AST content,
gallbladder cholesterol crystallization and CSI decreased significantly, the activity of SOD increased significantly
and MDA content decreased significantly. HE staining results showed that OPUM can improve the morphology
of liver cell, reduce the degree of hepatic cord disorders and restore the cell morphology close to normal. The
cause of OPUM prevents cholesterol gallstone formation maybe due to protect the integrity of the liver cells,
lower CSI, and reduce cholesterol crystal formation and hence prevent cholesterol gallstone formation.

收稿日期: 2013-01-08; 修回日期: 2013-02-05.
基金项目: 国家高技术研究发展计划 (863 计划) 资助项目 (2012AA020303); 长江学者和创新团队发展计划资助项目 (PCSIRT NO.IRT1007);
国家自然科学基金资助项目 (81274122, 81173578); 国家国际科技合作项目 (2010DFB32900); 创新药物研究开发技术平台建设资助
项目 (2012ZX09301002-004, 2012ZX09103101-006); 教育部博士点基金重点项目 (20121106130001); 北京市自然科学基金重点项目
(7131013); 北京市重点实验室基金资助项目 (BZ0150).
*通讯作者 Tel / Fax: 86-10-88223667, E-mail: ly8191@sina.com
Tel / Fax: 86-10-63165177, E-mail: chennh@imm.ac.cn
·研究简报·
DOI:10.16438/j.0513-4870.2013.07.028
徐 霜等: 荜拔油非皂化物预防胆固醇结石的形成 · 1179 ·

Key words: oil of Piper longum unsaponifiable matter; cholesterol gallstone; cholesterol saturation index

胆结石是指胆道系统 (包括胆囊与胆道) 的任
何部位发生结石的疾病。据报道西方国家成年人胆石
病的发病率达 15%～20%, 我国的发病率为 7%～
10%, 而 70%～80% 的胆结石为胆固醇结石。近年来,
随着饮食结构的改变, 胆固醇结石已成为一种常见
疾病, 其发病率随年龄的增长呈上升趋势[1]。目前胆
固醇结石治疗仍以手术为主, 一些非手术疗法如体
外震波碎石、溶石等虽有一定的疗效, 但疗程长、副
作用较多, 效果不确切。而目前的治疗药物仅在一定
程度上减少结石形成, 而且副作用比较明显。因此开
发抗胆固醇结石药物仍然十分必要。
荜拔 (Piper longum Linn) 是胡椒科 (Piperaceae)
胡椒属 (Piper) 多年生草质藤本植物。其未成熟果穗
用作香料或药用。中医认为荜拔具有“调元、温中、
滋补、强壮、散寒、下气、止痛”等多种作用。随现
代植物化学研究技术不断提高, 荜拔所含成分逐渐
被阐明, 研究发现荜拔油非皂化物 (OPUM) 为含有
12 种从荜拔中提取化合物的混合物[2], 其中包括胡椒
碱、N-异丁基癸二烯酰胺、哌啶和几内亚胡椒酰胺、
棕榈酸、四氢胡椒碱、十一碳-1-烯-3, 4-甲撑二氧苯、
挥发油等, 并且荜拔油非皂化物具有降血脂作用。前
期研究证实, 荜拔油非皂化物可显著降低血清中胆
固醇、升高高密度脂蛋白胆固醇[3], 提示可能具有抗
胆固醇结石的作用。由于前期对荜拔油非皂化物剂量
关系还不是很明确, 不能确定其成药可能性。因此,
本实验拟进一步观察荜拔油非皂化物随剂量变化对
C57BL/6 小鼠胆固醇结石形成的影响, 以期探索其成
药的可能性。

材料与方法
动物及模型制备 雄性 C57BL/6 小鼠 60 只, 体
重 (20 ± 2) g, 斯贝福 (北京) 实验动物科技有限公司
提供 (合格证号: SCXK (京) 2011-0004)。分笼饲养,
控制光照 12 h (6∶00～18∶00), 普通饲料适应性饲
养 1 周后, 随机分为 6 组 (n = 10): 空白对照组、结石
模型组、荜拔油非皂化物组 (15、30 及 60 mg·kg−1) 及
阳性对照组 (熊去氧胆酸, 60 mg·kg−1)。荜拔油非皂
化物由中国医学科学院药物研究所提供; 熊去氧胆
酸购于常州制药厂有限公司。空白对照组 (control):
每天喂普通饲料, 同时给予等量溶剂 (橄榄油) 灌胃;
结石模型组 (model): 每天喂高脂饲料 (配方: 15%
脂肪、1.25% 胆固醇、0.5% 胆酸盐饲料), 同时给予等
量溶剂 (橄榄油) 灌胃; 荜拔油非皂化物 (15、30 及
60 mg·kg−1) 组 (OPUM): 每天喂高脂饲料, 同时分
别给予溶于橄榄油的不同剂量荜拔油非皂化物灌胃。
阳性对照组 (UDCA): 每天喂高脂饲料, 同时给予溶
于橄榄油的熊去氧胆酸 (60 mg·kg−1) 灌胃。饲养 10
周后取材。实验前动物禁食 12 h, 动物眼球取血制备
血清。动物处死取胆囊并经 4 ℃、10 000 r·min−1 离
心 30 min 获得胆汁。取一片动物肝脏, 于 4% 多聚甲
醛中固定, 其余肝脏存于 −70 ℃冰箱备用。
血清中脂质及标志性酶的测定 测定血清中总
胆固醇 (TC)、甘油三酯 (TG) 及谷草转氨酶 (AST)
的含量, 试剂盒购于中生北控生物科技股份有限公
司, 应用东芝 40 全自动生化分析仪测定。
胆汁中胆固醇结晶及脂质的观察测定 采用偏
光显微镜观察结晶, 并应用东芝 40 全自动生化分析
仪测定胆汁中 TC、胆汁酸 (TBA)、磷脂 (PL) 的含
量并计算胆固醇饱和指数 (CSI)[4], 试剂盒购于中生
北控生物科技股份有限公司。
肝脏丙二醛及超氧化物歧化酶的测定 采用相
应试剂盒 (购于碧云天生物技术研究所) 测定肝脏
丙二醛 (MDA) 及超氧化物歧化酶 (SOD) 的含量。
组织学检测 将小鼠肝脏置于 4% 多聚甲醛中,
石蜡包埋、切片, HE 染色并于显微镜下观察组织形态
变化[5]。
统计学分析 实验结果以 mean ± SEM 表示, 采
用 SPSS13.0 软件的成组设计的两样本均数 t 检验进
行组间比较。

结果
1 荜拔油非皂化物能够抑制胆固醇结石模型小鼠胆
固醇结晶的形成
小鼠给予高脂饲料 10 周后, 胆囊胆汁在偏光显
微镜下可观察到胆固醇结晶的形成 (图 1A)。空白对
照组中, 胆固醇结晶较少; 而结石模型组与空白对照
组相比, 胆固醇结晶明显增多 (P < 0.001); 荜拔油非
皂化物 (30 及 60 mg·kg−1) 和熊去氧胆酸能够显著降
低结晶面积 (P < 0.001)。
检测胆囊胆汁酸中 TBA 及脂质含量结果 (图 1C)
表明 , 结石模型组的胆汁中胆固醇含量显著升高
(P < 0.001), 荜拔油非皂化物 (30 及 60 mg·kg−1) 和熊
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去氧胆酸能够显著降低胆固醇含量 (P < 0.001)。
计算胆汁中胆固醇饱和指数 (CSI) 结果 (图 1C)
表明, 结石模型组显著升高 CSI (P < 0.01), 荜拔油非
皂化物 (30 及 60 mg·kg−1) 和熊去氧胆酸能够显著降
低 CSI (P < 0.05)。
2 荜拔油非皂化物能够降低胆固醇结石模型小鼠血
清中脂质及肝功能相关酶的含量
结石模型组的血清中 TC 含量显著性升高 (P <
0.001), 而荜拔油非皂化物 (15、30 及 60 mg·kg−1) 和
熊去氧胆酸均能显著降低 TC 含量 (P < 0.001, P <
0.05)。见图 2A。
结石模型组的血清中 TG 含量亦显著升高 (P <
0.05), 荜拔油非皂化物 (60 mg·kg−1) 和熊去氧胆酸
能够显著降低 TG 含量 (P < 0.05)。见图 2B。
结石模型组的血清中 AST 含量显著升高 (P <
0.05), 而荜拔油非皂化物 (60 mg·kg−1) 和熊去氧胆
酸能够显著降低 AST 含量 (P < 0.05)。见图 2C。
3 荜拔油非皂化物显著降低胆固醇结石模型小鼠脂
质过氧化反应
结果 (图 3) 表明, 结石模型组的 MDA 含量显
著升高, 而 SOD 含量显著降低 (P < 0.05); 而荜拔油
非皂化物能够显著降低 MDA 含量 (P < 0.01), 升高
SOD 活性 (P < 0.05)。
4 荜拔油非皂化物抑制胆固醇结石模型小鼠肝脏损伤
HE 染色观察结果如图 4 所示, 空白对照组的肝
脏细胞正常, 肝索明显, 无脂滴空泡。结石模型组的
肝索紊乱, 细胞间轮廓不清, 脂滴空泡明显; 荜拔油
非皂化物组和熊去氧胆酸组的肝脏形态趋于正常 ,
脂滴空泡减少, 细胞轮廓清晰, 肝索排列整齐, 尤其
以 30 及 60 mg·kg−1剂量组更为明显。

讨论
目前用于胆固醇结石模型的动物主要有 C57BL/6
小鼠、豚鼠、兔等。由于 C57BL/6 小鼠对形成胆固醇


Figure 1 Effect of oil of Piper longum unsaponifiable matter (OPUM) on diet-induced cholesterol crystal formation and gallbladder
bile composition in mice fed with lithogenic diet. (A) Images of bile sludge visualized with polarizing light microscopy to detect the
presence of monohydrate cholesterol crystals. a: Control group; b: Model group; c: OPUM 15 mg·kg−1 group; d: OPUM 30 mg·kg−1
group; e: OPUM 60 mg·kg−1 group; f: UDCA (60 mg·kg−1) group. (B) The quantization result of cholesterol crystal. (C) Gallbladder
bile was harvested and biliary lipid concentrations were measured by 40FR automatic biochemical analyzer. CSI was to express
cholesterol saturation index. n = 10, mean ± SEM. ##P < 0.01, ###P < 0.001 vs control group; *P < 0.05, ***P < 0.01 vs model group;
☆☆P < 0.01, ☆☆☆P < 0.001 vs UDCA group
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Figure 2 Effect of OPUM on serum lipid levels (A: TC; B: TG, C: AST) in mice. n = 10, mean ± SEM. #P < 0.05, ###P < 0.001 vs
control group; *P < 0.05, ***P < 0.001 vs model group


Figure 3 Effect of OPUM on lipid peroxide reaction (A: MDA; B: SOD) in mice liver. n = 10, mean ± SEM. #P < 0.05 vs control
group; *P < 0.05, **P < 0.01 vs model group

结石易感, 并且价廉易得, 本文选择 C57BL/6 小鼠进
行模型制备。文献报道胆固醇结石小鼠模型制备时间
不一, 有的为 4 周[3], 有的为 10 周[6, 7]。而在预实验
中模型制备 4 周后并未发现明显结晶形成。延长时间
至 10 周, 发现胆汁中有结石结晶形成, 因此本实验选
择高胆固醇饮食喂养 C57BL/6 小鼠 10 周建立模型。
胆固醇结石的形成是一个涉及多种因素的复杂病
理过程, 通过临床发现脂肪与胆固醇结石形成密切相
关[8]。血清中胆固醇等指标的增加可能与胆固醇结石
相关[9, 10]。本实验中也发现模型组的血清中脂质 (TC、
TG) 及肝功能相关酶 (AST) 含量增加, 荜拔油非皂
化物能够降低 TC 等脂质含量有利于降低结石发生。
研究发现[11−13], 胆汁过饱和胆固醇是胆固醇结
晶形成的首要条件。在本实验中, 应用偏光显微镜观
察到模型组胆囊中出现胆固醇结晶, 而且结晶较多、
较大, 而荜拔油非皂化物 (30 及 60 mg·kg−1) 及熊去
氧胆酸能够显著减少结晶的生成。另外, 进一步实验
发现结石模型组的胆囊胆汁成分中胆固醇含量、胆固
醇饱和指数均显著增高, 而荜拔油非皂化物显著降
低胆固醇含量及胆固醇饱和指数。因此, 荜拔油非皂
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Figure 4 The quantization result of HE staining. a: Control
group; b: Model group; c: OPUM 15 mg·kg−1 group; d: OPUM
30 mg·kg−1 group; e: OPUM 60 mg·kg−1 group; f: UDCA
(60 mg·kg−1) group

化物可能通过降低胆汁中胆固醇饱和指数而减少结
晶形成。
大部分胆汁中的胆固醇来源于肝细胞的生物合
成, 并且胆汁是从肝细胞向胆囊中转运的[14, 15], 完整
的肝细胞能够保证胆汁的正常运输。调查发现, 脂肪
与胆固醇结石形成密切相关[16]。因此, 肝脏功能正常
与否与胆结石形成也密切相关。本实验还考察了小鼠
肝脏功能。血清中 AST 活性检测结果表明, 荜拔油
非皂化物显著降低胆固醇所致 AST 活性增加。HE
染色结果表明, 高胆固醇导致肝脏组织损伤明显, 肝
细胞轮廓不清, 脂滴空泡明显, 肝索排列紊乱, 有较
多炎性侵润等。这与文献[6]报道一致。而荜拔油非皂
化物能够明显改善肝细胞损伤情况, 使肝细胞形态
趋于正常, 抑制肝脏脂质过氧化反应的增加并且升
高 SOD 活性。
因此, 本实验结果提示荜拔油非皂化物可能通
过减少脂质过氧化反应、减少肝脏细胞损伤、改善肝
细胞完整性, 从而降低胆固醇从肝脏细胞向胆汁的
转运、降低胆囊中胆固醇含量和胆固醇饱和指数, 预
防胆固醇结石形成。
References
[1] Chuang SC, Edward H, Lee KT. Mucin genes in gallstone
disease [J]. Clin Chim Acta, 2012, 413: 1466−1471.
[2] Tabuneng W, Bando H, Amiye T. Studies on the constituents
of the crude drug “Piperis Longi Fructus” [J]. Chem Pharm
Bull, 1983, 31: 3562−3565.
[3] An GS, Wang HM, Batu WL, et al. Inhibitory effect of oil of
Piper longum unsaponifiable matter on gallstone formation in
mice [J]. Chin J Surg Integr Tradit Western Med (中国中西
医结合外科杂志), 2008, 14: 235−238.
[4] Carey MC. Critical tables for calculating the cholesterol
saturation of native bile [J]. J Lipid Res, 1978, 19: 945−955.
[5] Feng ZQ, Chen JL, Wei HL, et al. The risk factor of gallbladder
cancer: hyperplasia of mucous epithetlium caused by gallstones
associates with P16/CyclinD1/CDK4 pathway [J]. Exp Mol
Pathol, 2011, 91: 569−577.
[6] Wang HH, Piero P, Nahum MS, et al. Effect of ezetimibe on
the prevention and dissolution of cholesterol gallstones [J].
Gastroenterology, 2008, 134: 2101−2110.
[7] Zhang XL, Liang XQ, Gu HG, et al. Effects of Shengqing
Capsule on biochemical parameters in mice with cholesterol
gallstone [J]. J Chin Integr Med (中西医结合学报), 2008, 6:
1045−1048.
[8] Banim PR, Luben R, Bulluck H, et al. Serum lipids and the
risk of developing symptomatic gallstones: a UK prospective
cohort study [J]. Gastroenterology, 2010, 138: S−211.
[9] Lu L, Zhao GZ. The relationship between sex hormone,
cholesterol and gallbladder cholesterol stone [J]. J Ningxia
Med Univ (宁夏医科大学学报), 2010, 32: 234−235.
[10] Wei YY, Yan D, Japar A, et al. Effects of pomegranate flowers
polyphenols on liver PON expression of diabetes combining
non-alcoholic fat liver diseases rats [J]. Acta Pharm Sin (药
学学报), 2013, 48: 71−76.
[11] de Bari O, Ba NT, Liu M, et al. Ezetimibe: its novel effects
on the prevention and the treatment of cholesterol gallstones
and nonalcoholic fatty liver disease [J]. J Lipids, 2012, 2012:
302847.
[12] Jiang ZY, Han TQ, Zhang SD. Possible ways to prevent
gallstone formation from lessons learnt on its pathogenesis [J].
Chin J Hepatobiliary Surg (中华肝胆外科杂志), 2011, 17: 697−700.
[13] Libor V, Martin CC. New pathophysiological concepts
underlying pathogenesis of pigment gallstones [J]. Clin Res
Hepatol Gas, 2012, 36: 122−129.
[14] Li J, Zhu PT. Study of relationship between ABCG5/ABCG8
and gallstone [J]. Acta Acad Med Xuzhou (徐州医学院学
报), 2012, 32: 208−210.
[15] Xu YN, Gao J, Xu Y, et al. Screening and identification of
the upregulators of ATP-binding cassette transporter A1 [J].
Acta Pharm Sin (药学学报), 2012, 47: 446−451.
[16] Wang HL. Etiology investigation of fatty liver to induce
gallstone disease [J]. World Health Digest (中外健康文摘),
2011, 8: 247−248.