全 文 ：第 15 卷第 3 期
2008年 6月 水土保持研究Resear ch of So il and Water Conser vation Vo l.15 , No.3Jun., 2008
　
河北杨不同再生途径组培苗遗传稳定性的 RAPD检测＊
张　琼 ,李周岐 ,侯万伟 ,周飞梅
(西北农林科技大学 林学院 , 陕西 杨陵　712100)
摘　要:运用 RAPD标记对河北杨不同培养途径获得的再生植株遗传稳定性进行检测 ,结果表明 , 以试管苗幼嫩叶
片为外植体 ,通过直接不定芽发生途径获得的再生植株(20 株)与对照株间表现出相同的条带数 , 说明此途径具有
较高的遗传稳定性;以试管苗幼嫩叶片为外植体诱导愈伤组织 , 通过器官发生途径获得的再生植株(20 株)中有 2
株分别在引物 S268和引物 S104 中各出现一条多态性带 , 位点变异率为 2/ 288 , 植株变异率为 2/ 20 , 说明此培养途
径过程中发生体细胞无性系变异 ,遗传稳定性较前者低 ,因此河北杨不同培养途径再生植株间存在遗传稳定性差异。
关键词:河北杨;再生途径;体细胞无性系变异;RAPD
中图分类号:S792.11.05　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1005-3409(2008)03-0260-03
RAPD Analysis of Genetic Stability of Populus hopeiensis Tissue Culture
Seeding from Different Regeneration Methods
ZHANG Qiong , LI Zhou-qi ,HOU Wan-wei ,ZHOU Fei-mei
(College of Forestry Sciences , Northwest A &F University , Yangling , S haan xi　712100 , China)
Abstract:In this study , RAPD marke rs we re used to analyze gene tic stability of reg ener ated plant from differ ent w ays of Popu-
lus hopeiensis.The re sults indicated tha t , using the young leaves of vitro plantlets as explants , the RAPD bands were same be-
tw een the control and regenerated plant w hich w as fr om the direct regenera ting adventitious buds.The young leaves of vitro pla-
ntle ts w ere as explants to induce the callus , and ther e w as a po lymorphic band respectively in the prime r S268 and S104 on 2 re-
gene rated plant w hich we re from the way of o rganogene sis.The mutational ra te o f RAPD sites and plants we re 2/288 and 2/ 20
respectively.I t indicated that there wa s somaclonal v aria tion during t raining by this way , and the gene tic stability wa s lower than
by the fo rmer way.
Key words:Populus hopeiensis;regenera tion method;somaclonal va riation;RAPD
　　植物离体培养物和再生植株会发生各种各样的变
异[ 1-2] , Larkin 和 Scow crof t[ 3] 首次对有关再生植株变异的资
料进行了评述 ,并把这种现象称为体细胞无性系变异(soma-
clonal v aria tion)。大量研究表明 , 影响植物体细胞无性系变
异频率的因素很多 ,包括源植株的基因型 、外植体来源 、生长
调节物质及附加物 、离体培养时间及再生方式等[ 4-5] 。
由于杨树具有生长周期短 、离体操作容易 、基因组相对
较小等特点 ,被喻为木本植物生理学 、分子生物学和基因工
程研究的模式植物。目前 ,杨树已成为林木组织培养及生物
技术育种中研究最多的树种之一。自从 Leste r[6]于 1977 年
首次报道杨树杂种无性系组培苗在苗高 、分枝数及叶片性状
上存在无性系变异以来 ,有关杨树体细胞无性系变异的研究
报道已有许多。GeJiao 等[ 7] 研究发现转基因杨树(P.nigra
L.)在叶形等性状上存在无性系变异 , 并利用分子标记技术
(RFLP , RAPD , SSR)进行了分析 ,认为变异是由于组织培养
过程引起的 ,而与外源基因的插入无关。 Son 等[8]研究发现
杂种杨树(Populus alba L.×P.grandi dentata Michx.)愈
伤组织再生植株在生长速度 、染色体倍性及蛋白质水平上存
在广泛变异。可见 , 体细胞无性系变异在杨树中相当普遍 ,
但从现有资料看 , 杨树体细胞无性系变异研究还不够深入 ,
多数研究只是发现了体细胞无性系变异现象 , 有关体细胞无
性系变异的影响因素虽有一些报道 , 但对变异原因的分析尚
存在不足。
河北杨(P.hopeiensis Hu et Chow)又名串根杨 ,属杨柳
科杨属重要造林树种 , 广泛分布于我国华北及西北地区 , 其
根系发达 , 萌芽性强 , 耐寒 、耐旱 、耐风沙 、耐瘠薄 ,适于高寒
多风沙地区栽种 , 为华北 、西北黄土丘陵峁梁 、沟坡及沙滩地
的重要水土保持和造林优良树种[ 9] 。
本研究取河北杨幼嫩叶片为外植体 , 运用组织培养的方
法 ,通过直接不定芽发生途径获得再生植株和经诱导愈伤组
织通过器官发生途径获得再生植株。 并对这些再生植株进
行 RAPD分子标记检测 , 比较不同培养方式获得再生植株
＊ 收稿日期:2007-12-13
　基金项目:西北农林科技大学校专项“杨树体细胞无性系变异影响因素与调控技术的研究”
　作者简介:张琼(1982-),女 ,陕西宝鸡人 ,硕士研究生 ,主要从事林木遗传育种研究。 E-mail:ext reme0082000@yahoo.com.cn
　通信作者:李周岐(1962-),男 ,陕西凤翔人 ,教授,博士生导师 ,主要从事林木生物技术育种研究。 E-m ail:l zhouqi@yahoo.com.cn
与对照株间遗传稳定性的差异并分析其原因。该研究为河
北杨的良种选育与良种栽培将奠定一定的基础。
1　材料与方法
1.1　材　料
　　以西北农林科技大学林木遗传育种试验室所保存的河
北杨试管苗为起始材料。
1.2　方　法
1.2.1　组织培养
　　(1)取 1 株试管苗接进茎段培养基 1/ 2 MS+0.05 mg/ L
6-BA+0.05 mg/ L NAA 扩繁得到 6 株苗子 , 将其中 1 株经
练苗后盆栽作为对照系记为 CK;
(2)取剩余 5 株的叶片为外植体 , 通过直接不定芽发生
途径获得再生植株;培养基为 1/2 MS+0.25 mg/ L 6-BA+
0.01 mg/ L TDZ+0.25 mg/ L IAA;通过诱导愈伤组织培养
途径获得再生植株。诱导愈伤组织培养基为 MS+0.3 mg/
L 6-BA+0.07 mg/ L NAA+0.2 mg/ L 2 , 4-D ,愈伤再生培
养基为 1/ 2 MS+2 TDZ 1 mg/ L+2%糖。最后将不同方式
获得的再生苗接进生根培养基 , 培养基为 1/ 2 MS +0.01
mg/ L NAA+0.05 mg/ L IBA 。
1.2.2　变异分析
(1)DNA提取。利用改良的 CTAB 法[ 10] , 分别对 1 株
对照系 CK ,通过直接不定芽发生途径获得 20 个再生植株 ,
通过器官发生途径获得 20 个再生植株进行 DNA 提取。
(2)检测方法。参考 William s 等方法[ 11] , 以对照系 CK
的 DNA 为模板 , 对 500 条(S1-S500)引物进行扩增 , 筛选
出条带清晰且明亮的引物作为检测用引物 , 用于对通过直接
不定芽发生途径获得的 20 个再生植株和通过器官发生途径
获得的 20 个再生植株做进一步检测。
2　结果与分析
2.1　引物筛选
　　以对照系 DNA 为模板 , 对 500(S1 ～ S500)个引物进行
扩增反应。从扩增结果看 , 不同引物扩增出条带数及强度不
同(图 1 为部分扩增结果), 根据 RAPD 扩增结果选出 72 条
条带多而亮的引物 , 共扩增出 288 条谱带。
引物从左到右依次为 S85 , S96 , S103 , S158 ,S185 , S191 , S199 , S216 , S230 , S267 , S289 , S282 , S259 , S276 , S174 ,S146
图 1　以对照 DNA 为模板部分引物的扩增结果
2.2　直接不定芽发生途径获得再生植株的体细胞无性系变异
　　用 72 条所选引物对通过直接不定芽发生途径获得的
20 个再生植株及对照株进行 RAPD扩增反应。通过比较再
生植株和对照株间 RAPD 标记带 ,没有发现 DNA 多态性差
异 ,表明该再生途径具有较高的遗传性稳性。
泳道 1:诱导愈伤组织发生途径获得再生植株的扩增结果;
泳道 2:直接不定芽发生途径获得再生植株的扩增结果;
泳道 3:对照株的扩增结果
图 2　出现变异位点的引物的扩增结果
2.3　器官发生途径获得再生植株的体细胞无性系变异
对以试管苗幼嫩叶片为外植体诱导愈伤组织 ,通过器官
发生途径获得再生植株进行变异分析时 , 分别用所选择的
72 个 RAPD 引物对 20 株以试管苗幼嫩叶片为外植体诱导
愈伤组织 , 通过器官发生途径获得的再生植株和直接不定芽
发生途径获得再生植株以及对照株进行 RAPD 扩增反应。
结果通过器官发生途径获得再生植株与引物 S268 多出 1 条
多态性条带和与引物 S104 中少了 1 条多态性带 ,重复 3 次
多态稳定(图 2 为部分结果)说明通过器官发生途径获得再
生植株遗传稳定性较低 ,发生了分子水平上的遗传差异 , 植
株变异率为 2/20 , 位点变异率为 2/ 288。
3　结论与讨论
在本实验研究中 , 用 RAPD 明显地能检测出河北杨不
同再生方式获得再生植株间存在稳定性差异。通过直接不
定芽发生途径获得再生植株和对照植株间没有发现 DNA
多态性差异 , 说明此途径具有较高的遗传性稳定。而以试管
苗幼嫩叶片为外植体诱导愈伤组织 , 通过器官发生途径获得
再生植株与对照株相比存在分子上的遗传差异 , 遗传稳定性
较前者低 , 其中植株变异率为 2/ 20 , 位点变异率为 2/ 288。
初步推断新生器官由愈伤组织诱导产生间接器官再生(即由
植物组织-愈伤组织-拟分生组织-器官原基),增加了细
胞内染色体变异的机率 ,从而导致无性系变异产生 , 具有遗
传不稳定性。而由植物组织-拟分生组织-器官原基的直
·261·第 3 期 　　　　　张琼等:河北杨不同再生途径组培苗遗传稳定性的 RAPD检测
接器官再生过程 , 未经愈伤组织而直接由体细胞分化成器
官 ,则可降低无性系变异机率。由于植物愈伤组织细胞处于
多变 、未定型的阶段 , 可分化形成不同的器官原基 ,因此分化
形成的后代变异率不稳定 ,极易出现无性系变异。产生这种
变异的原因很多 ,组织培养中的任何培养条件的改变以及激
素水平的提高都可能诱导变异 , 如离体条件本身 、植物生长
调节剂 、渗透压 、培养温度及培养时间等。
在组织培养中由于器官发生方式在经过愈伤组织分化
阶段时 ,其体细胞突变的可能性较大 , 从而为育种工作者提
供了新的变异来源 ,但因其变异性大 , 在快速繁殖中一般不
采用这种方式。通过直接不定芽发生途径获得再生植株过
程中 ,不经过发生愈伤组织而再生 , 可以直接从芽到芽 , 这是
最能使无性系后代保持原品种遗传特性的一种繁殖方式。
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(上接第 259 页)
染还将在较高速度上持续一定时间。因此 ,今后在继续加大
对废水的处理和利用的同时 ,应着重加强对废气和固体废弃
物的排放控制和污染治理 , 努力降低工业“三废” EKC 的峰
值和曲率。
总体看来 ,山东省的环境质量状况不容乐观 , 经济增长
与保护环境压力仍较大。到目前为止 ,山东省的经济增长并
未对环境产生显著的改善作用。这主要是由于山东省正经
历着工业化的增长阶段 , 工业尤其是重工业 , 如能源 、化工 、
机械 、电子等在经济中占的比重不断攀升 , 势必对环境质量
造成了一定的压力。随着人均 GDP的增长 , 山东省工业“三
废”所造成的环境污染将呈扩大趋势 , 在未来相当长的一段
时期内仍继续肩负发展经济和保护环境的双重重任。
环境质量的改善不会随着经济的增长而自动发生。缓
和工业经济发展与环境保护之间的矛盾 ,促进山东省环境质
量改善的根本途径是转变经济增长方式 ,提高能源和资源利
用率 ,走环境质量与经济增长持续协调发展的新型工业化之
路。以循环经济的生态理念为指导思想 ,推动工业产业结构
优化调整 ,淘汰落后的技术工艺 ,实现经济增长方式由高能
耗 、高污染向环保型经济转变 。同时 , 认真贯彻国家各项环
境政策 ,加大环境污染治理资金的投入 ,加强实施环境综合
整治 ,努力减少工业“三废”污染物的排放。 此外 , 环境保护
的基本推动力量是公众 , 因此 ,加强环境教育和宣传的力度 ,
提高公众环境意识 , 鼓励公众参与 ,倡导绿色消费势在必行。
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