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河北杨胚囊发育的细胞学观察



全 文 :中国农学通报 2012,28(16):36-41
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
杨树(Populus)是世界中纬度平原地区栽培面积最
大、木材产量最高的速生用材树种之一。杨树不仅可
以提供生物资源,还可以改良环境,因此发展杨树人工
林以满足社会经济发展和环境保护的需求是目前世界
杨树研究的发展趋势[1]。虽然生物技术如基因工程、
细胞工程和分子遗传标记技术在林木遗传育种中有了
长足发展,但是常规育种和多倍体育种仍是提供优良
林木繁殖材料的重要来源,在林木遗传改良中发挥着
重要作用。杨树多倍体,尤其是三倍体育种综合倍性
优势与杂种优势,在生长和材性遗传改良方面具有重
要的研究、开发和利用价值[2]。
基金项目:中央高校基本科研业务费专项资金(HJ2010-15);国家自然科学基金(31000306);林业公益性行业科研专项(20100400900-3)。
第一作者简介:索玉静,女,1988年出生,在读硕士,主要从事林木遗传育种研究。通信地址:100083北京市清华东路35号北京林业大学361号信
箱,E-mail:suoyujing1988@126.com。
通讯作者:康向阳,男,1963年出生,内蒙古赤峰人,教授,博士生导师,博士,研究方向:林木倍性育种与细胞遗传学。通信地址:100083北京市清华
东路35号北京林业大学118信箱,E-mail:kangxy@bjfu.edu.cn。
收稿日期:2012-02-13,修回日期:2012-04-19。
河北杨胚囊发育的细胞学观察
索玉静,王 君,康向阳
(北京林业大学林木育种国家工程实验室/林木花卉遗传育种教育部重点实验室,北京 100083)
摘 要:诱导胚囊染色体加倍是一种高效的杨树多倍体诱导途径,为确定河北杨胚囊染色体加倍的最佳
处理时机,采用石蜡切片方法对河北杨(Populus hopeiensis)胚囊与合子发育进程进行观察。结果表明:
河北杨胚囊发育属于典型的蓼型发育模式;其发育进程既表现出一定的时序相关性,又具有极强的不同
步性;在河北杨胚囊发育后期及合子发育过程中出现大量异常现象,大部分成熟胚囊和未成熟胚囊退
化,形成空胚囊或具有异常结构的胚囊,只有极少数成熟胚囊能完成双受精作用并形成合子,考虑到新
疆杨花粉可在河北杨柱头上正常萌发,推测胚囊退化可能是引起河北杨胚胎败育的主要原因。
关键词:河北杨;胚囊;合子;发育;胚胎败育
中图分类号:S722.3 文献标志码:A 论文编号:2012-0357
Cytological Observations on the Development of Populus hopeiensis Embryo Sac
Suo Yujing, Wang Jun, Kang Xiangyang
(National Engineering Laboratory for Tree Breeding/Key Laboratory for Genetics and Breeding in Forest Trees and
Ornamental Plants of Ministry of Education, Beijing Forestry University, Beijing 100083)
Abstract: It’s an efficient way to get polyploidy by inducing the embryo sac chromosome doubling in Populus.
In order to confirm the handling time of inducing the P. hopeiensis embryo sac chromosome doubling,
development of embryo sac and zygote of P. hopeiensis were studied. The results showed that developmental
process of embryo sac of P. hopeiensis was typical Polygonum type; the process not only was correlated with the
development period, but also had a strong asynchronism. At the later period of embryo sac development and the
process of zygote development, a large number of abnormalities were observed. Most mature and immature
embryo sacs became vestigial, and developed into empty embryo sac or embryo sac with exceptional structure.
Double fertilization and zygotic formation were infrequent. Taking into account the pollen of P. bolleana normal
germination on stigma of P. hopeiensis, it suggested that embryo sac degradation might be the main reason for
embryo abortion of P. hopeiensis.
Key words: Populus hopeiensis; embryo sac; zygote; development; embryonic abortion
索玉静等:河北杨胚囊发育的细胞学观察
通过胚囊染色体加倍选育杨树三倍体是一条很重
要的杨树多倍体诱导途径。康向阳等[3]以银腺杨为母
本、毛白杨为父本,秋水仙碱处理授粉后的雌花序,最
高处理组合的三倍体得率高达 57.1%;王君等[4-5]分别
以秋水仙碱处理和高温处理诱导青杨胚囊染色体加
倍,最高三倍体得率分别为 66.7%、40%。显然,诱导
杨树胚囊染色体加倍是一种高效的多倍体诱导途径,
因此应该重视开发这一诱导途径,使其应用于其他杨
树的遗传改良中。相关研究认为,决定胚囊染色体加
倍成功与否的关键是对处理时机的掌握,因此对胚囊
发育进程的判断尤为重要,这就需要对其进行细胞学
观察。
河北杨(Populus hopeiensis)是中国特有的白杨派
乡土树种,主要分布在华北北部、西北黄土高原。其树
形高大优美、端直,生长较为迅速,材质优良;具有较强
的耐寒、抗旱和抵御风沙能力,在黄土高原粱峁亦能生
长;侧根发达,萌蘗性强,对光肩星天牛(Anoplophora
glabripennis)等有一定抗性;是中国西北地区的重要造
林树种之一[6-7]。自然界中河北杨仅以雌株形式存在,
遗传改良程度较低[8],目前尚无有关河北杨胚胎学及
多倍体育种的研究。因此,笔者对河北杨胚囊与合子
发育进程进行观察,以期为多倍体育种提供细胞学基
础和参考。
1 材料与方法
1.1 试验时间、地点
研究田间试验于 2010年 1—2月在北京林业大学
温室进行,室内试验于2010年3—5月在北京林业大学
林业楼212进行。
1.2 试验材料
河北杨(P. hopeiensis)雌花枝和新疆杨(P. bolleana)
雄花枝,分别采集于内蒙古自治区包头市和巴彦淖尔
市磴口县。2010年1月上旬,采集花芽饱满、无病虫害
的健壮花枝,用塑料薄膜包裹严密,运至北京林业大
学,避风低温贮藏。
1.3 试验方法
1.3.1 试验设计 分别将新疆杨雄花枝、河北杨雌花枝
水培于温室(10~20℃),收集新疆杨花粉,当河北杨雌
花序处于最佳授粉时期对其授粉。授粉后每隔6 h用
FAA固定液[V(70%乙醇):V(乙酸):V(38%甲醛)=
90:5:5]固定河北杨雌花序 2~3个,授粉 3天后每 12 h
固定1次,直至授粉后第10天。固定后的雌花序4℃低
温贮存。未固定花序待种子成熟收集种子。统计每个
成熟花序的子房数和最后获得的种子数。
1.3.2 细胞学观察 随机摘取授粉后 0 h、6 h、12 h、
18 h、24 h、36 h、48 h固定的雌花序上的 5~10个小花,
蒸馏水浸泡洗净后,用 10 mol/L NaOH软化处理 1 h,
蒸馏水洗净后,苯胺蓝染色,压片,OlympusBX51荧光
显微镜观察新疆杨花粉在河北杨柱头上的萌发情况,
并照相。
从固定的雌花序上随机摘取20个小花,逐级酒精
脱水,二甲苯透明,采用石蜡包埋、切片,切片厚度为
8 μm,铁矾苏木精染色,进行显微观察,并对发育过程
各时期进行统计,分析不同阶段各发育时期所占比
例。所有制片均在Olympus BX51显微镜下观察,并
照相。
2 结果与分析
2.1 河北杨胚囊和合子发育进程及其不同步性
将新疆杨新鲜花粉授粉至河北杨柱头后,授粉后
6 h即可观察到花粉的大量萌发,且花粉管伸入花柱道
内部(见图 1),表明新疆杨花粉可在河北杨柱头上正
常萌发,两者具有较强的亲和性。
通过常规石蜡切片观察,发现河北杨胚囊发育进
程表现出一定的时序相关性(见表1)。随着授粉后时
间的推移,功能大孢子经过3次有丝分裂,经历单核期
(图 2A)、二核期(图 2B、C)、四核期(图 2D、E)以及八
核期,逐渐形成具有 7细胞结构的成熟胚囊(图
2F~H),成熟胚囊由 2个助细胞、1个卵细胞、1个中央
细胞、3个反足细胞组成,属于典型的蓼型发育模式。
成熟胚囊经双受精(见图 2I),中央细胞与 1个精核融
合形成初生胚乳核,卵细胞与另 1个精核融合形成合
子,合子经多次有丝分裂后形成多细胞原胚(见图
2J)。
此外,通过对1767个胚珠的观察统计发现,河北杨
胚囊及合子发育过程存在较强的不同步性(见表 1)。
当河北杨雌花序达到可授期时,可观察到从功能大孢
图1 授粉后6 h新疆杨花粉在河北杨柱头上大量萌发
200 μm
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子到四核胚囊的各个时期,其中 50%的胚囊已经发育
到二核胚囊,四核胚囊的比例也达 31.58%;至授粉后
6 h,二核胚囊所占比例仍最大,达到47.50%,20%的胚
囊发育至八核或成熟胚囊;授粉后12 h,单核和二核胚
囊的比例迅速减少,75%的胚囊发育至八核和成熟胚
囊,表明授粉后6~12 h是河北杨胚囊由二核胚囊向八
核胚囊发育的主要阶段,且二核向四核、四核向八核的
发育过程非常迅速;授粉后 12~24 h,八核及成熟胚囊
仍占大多数,二核和四核胚囊所占比例相当,15%左
右;授粉后 30~48 h,部分成熟胚囊开始进行双受精现
象,但比例很低,八核及成熟胚囊的比例达到 60%左
右;授粉后 54 h,八核及成熟胚囊的比例迅速减少,此
时胚囊发育出现大量异常现象;授粉后84 h出现个别
四核胚囊、成熟胚囊和休眠合子,其余均发育异常;至
授粉后96 h,所有胚囊均完成了发育过程,但绝大多数
表现出胚胎发育异常现象;授粉后 144 h,多细胞原胚
开始形成,但所占比例非常低,异常现象仍占绝大
多数。
2.2 河北杨胚囊及合子发育过程的异常现象
河北杨胚囊及合子过程呈现出大量异常现象,特
别在胚囊发育后期异常现象尤为明显(见表 1),主要
表现为3种形式:(1)空胚囊(图3A),主要表现为无胚
形成,胚囊呈现为一个空腔;(2)胚囊中结构异常,如成
熟的胚乳核退化,经苏木精染色呈黑团状结构(图
3B),胚囊仅有1个或2个特大的细胞核(图3C、D),以
及无法辨认的结构(图3E);(3)胚珠退化(图3F),主要
表1 河北杨胚囊及合子发育进程及胚胎发育异常情况
距离授粉后
时间/h
0
6
12
18
24
30
36
42
48
54
60
66
72
84
96
108
120
132
144
156
168
192
216
胚囊及合子发育进程/%
功能
大孢子
6.58a (5b)






















单核
胚囊
11.84 (9)
11.25 (9)
2.27 (1)




















二核
胚囊
50.00 (38)
47.50 (38)
9.09 (4)
8.33 (5)
16.00 (8)
4.88 (2)
14.55 (8)
6.76 (5)
9.23 (6)
3.95 (3)

1.57 (2)











四核
胚囊
31.58 (24)
21.25 (17)
13.64 (6)
13.33 (8)
16.00 (8)
12.20 (5)
12.73 (7)
8.11 (6)
7.69 (5)
2.63 (2)
1.26 (1)
1.57 (2)
1.02 (1)
1.09 (1)









八核及
成熟胚囊

20.00 (16)
75.00 (33)
65.00 (39)
60.00 (30)
78.05 (32)
65.45 (36)
60.81 (45)
60.00 (39)
18.42 (14)
11.39 (9)
12.60 (16)
18.37 (18)
8.70 (8)
3.80 (3)

6.25 (4)

1.15 (1)




双受精





2.44 (1)

5.40 (4)
1.54 (1)

5.06 (4)
3.94 (5)
1.02 (1)










休眠
合子













3.26 (3)


3.13 (2)

1.15 (1)

0.83(1)


原胚


















2.30 (2)

1.67(2)
0.95(1)

异常发育情况/%
异常1



13.33 (8)
8.00 (4)
2.44 (1)
7.27 (4)
18.92 (14)
21.54 (14)
52.63 (40)
39.24 (31)
62.99 (80)
51.02 (50)
58.70 (54)
62.02 (49)
70.10 (68)
71.88 (46)
93.48 (43)
68.97 (60)
96.15 (75)
79.17 (95)
55.24 (58)

异常2









22.37 (17)
43.04 (34)
17.32 (22)
28.57 (28)
28.26 (26)
34.18 (27)
29.90 (29)
18.75 (12)
6.52 (3)
26.44 (23)
3.85 (3)
18.34 (22)
7.62 (8)
2.70 (2)
异常3





















36.19 (38)
97.30 (72)
注:a各发育时期所占百分率(%);b各发育时期统计数量;异常1表现为胚囊中空,无胚形成;异常2表现胚囊中结构异常;异常3表现为胚珠退化
为黄褐色、无细胞结构的物质。
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索玉静等:河北杨胚囊发育的细胞学观察
A:单核胚囊;B:早期的二核胚囊;C:二核胚囊;D:二核胚囊分裂后期;E:四核胚囊;
F:八核胚囊;G~H:成熟胚囊;I:双受精;J:多细胞原胚
图2 河北杨胚囊及合子发育过程
A:空胚囊;B:胚囊中黑团状结构;C:胚囊中仅有1个特大的细胞核;D:胚囊中仅有2个特大的细胞核;
E:胚囊中无法辨认的结构;F:退化的胚珠;G、H:分裂的子房
图3 河北杨胚囊及合子发育过程异常现象
10 μm 10 μm 10 μm 10 μm 10 μm
10 μm 10 μm 10 μm 10 μm 10 μm
20 μm 20 μm 20 μm 20 μm
20 μm 20 μm 200 μm 200 μm
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中国农学通报 http://www.casb.org.cn
表现为无细胞状态的模糊结构。在这些异常现象的出
现的同时,也观察到珠被细胞解体退化的现象,部分细
胞的核膜核仁消失,细胞丢失原来的性状,结构变的松
散。此外,在河北杨的胚囊及合子发育过程中,还发现
少数子房发生分裂的现象(图 3G、H),即从柱头至子
房底部,子房一分为二,形成 2个子房腔,各子房腔中
胚珠清晰可见。
授粉后 18 h,即可观察到胚囊发育过程的异常现
象出现。在此时所观察的细胞中,约有 13%呈现出空
胚囊状态,且随着授粉时间的推移,该异常情况总体上
呈先上升后下降的趋势,在授粉后156 h时达到最高比
例 96.15%。在授粉后 54 h,除空胚囊现象外,还观察
到胚囊中结构异常现象,其比例占 22.37%,随后均出
现该现象,但其所占比例始终未超过空胚囊所占比例;
授粉后192 h,36.19%的胚珠退化为无细胞形态的模糊
状结构,该异常现象迅速增加,在授粉后216 h,97.30%
胚珠均呈现出这种状态。
2.3 河北杨种子结实能力评价
在试验过程中,部分授粉后的花序出现萎蔫现象,
最终只有少部分发育成成熟果序。统计每个成熟果序
的子房数,每个果序平均含有 79个蒴果;结合石蜡切
片观察,每个子房平均含有3个胚珠,则每个果序平均
含有 237个胚珠。统计最终获得的种子数,每个成熟
果序平均得到 16粒种子,明显低于其他白杨派树种,
如银腺杨×毛白杨平均 116粒/序的结实水平[3]。根据
每个成熟果序的总胚珠数和收集种子数,可知河北杨
胚胎败育率约为 93.25%,显然,河北杨存在严重的胚
胎败育现象。
3 结论与讨论
河北杨胚囊发育属于典型的蓼型发育模式;其发
育进程具有一定的时序相关性,先后经历单核、双核、
四核以及八核,最终发育为 7细胞成熟胚囊;同时,河
北杨胚囊发育进程又表现出极强的不同步性,在同一
时期可观察到 2核至 8核几种不同的胚囊发育状态。
在杨属的其他种中,也存在发育进程的不同步性,李艳
华[9]和王君等[10]均观察到毛新杨、银腺杨、小青杨的胚
囊发育进程存在较强的不同步性,推测其可能是同种
杨树雌、雄配子发育间的一种适应,对于种群的保存具
有积极意义。河北杨在自然界中仅以雌株形式存在,
一般进行的是种间杂交,其胚囊发育的不同步性,可能
是为了增加种间杂交的有效作用时间,也是对自然界
的一种适应。
引起胚胎败育的原因可能有雄性不育、雌性不育、
受精障碍、合子发育不良以及胚乳败育等[11]。其中雌
性败育比较复杂,从孢原细胞到胚发育成熟前的各个
阶段都有可能发生败育。Rim等[12]发现胚囊发育过程
中大孢子母细胞减数分裂中期Ⅰ时染色体集成一团,
纺锤体消失,细胞质收缩成深染状态,少数胚珠即使发
育到5或6核阶段,核也全部集中在胚囊中部,核也变
畸形,这些最终导致胚囊解体。董军等 [13]发现芒果
(Mangifera indica)幼胚败育是由于胚囊在七细胞八核
时期助细胞和反足细胞等营养细胞退化,导致胚囊退
化。张艳丽等[14]在对小麦(Triticum aestivum)与珍珠粟
(Pennisetum americanum)远缘杂交的受精作用和胚胎
发育进行研究时,发现较多双受精不完全现象的存在,
这种不完全双受精的结果导致胚胎发育只形成胚而无
胚乳,或者只有胚乳而无胚的形成。杜国华等[15]观察
了空苞板栗(Castanea mollissima)的胚胎发育过程,发
现在双受精作用完成、初生胚乳细胞分裂一团游离核
后,不再继续分裂,合子(受精卵)发育停滞,不能分化
成幼胚,从而形成空苞。在本研究中,新疆杨花粉在河
北杨柱头能够正常萌发,且花粉管延伸正常,故可排除
雄性不育的影响;由表1可知,河北杨胚囊前期发育正
常,功能大孢子经过有丝分裂,依次形成单核期、二核
期、四核期胚囊,而此后则出现了大量异常现象,主要
表现为空胚囊现象和胚囊中结构异常现象,仅少数发
育成熟的胚囊能完成双受精,形成合子。推测胚囊退
化可能是引起河北杨胚胎败育的主要原因。
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