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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(6):211-218
蛋白质翻译后修饰（post translation modification，
PTM）是目前蛋白研究中比较受欢迎的一个重要
研究方向，其中磷酸化修饰在生物体中是一种最
普遍最重要的调控方式，几乎调节着生命活动的
整个过程，包括细胞的增殖、凋亡和分化、信号
转导、基因表达、细胞周期以及其他生命活动过
程［1-3］。据统计，哺乳动物细胞内有 1/3 以上的蛋
白质被磷酸化修饰［4］。真核生物中磷酸化主要发生
在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸等残基，其比例大概为
1 800∶200∶1［5］。大多数磷酸化的蛋白质有一个以
上的磷酸化位点，并且生物体内磷酸化修饰是一个
动态过程，同一种蛋白在不同的时间和空间时刻发
生着磷酸化与去磷酸化的交替活动。因此，生物体
内磷酸化修饰的蛋白质的鉴定和定量分析对更好的
收稿日期： 2015-10-27
基金项目：国家自然科学基金资助项目（31471230），上海市浦江人才计划资助（14PJ1401300）
作者简介：程庆灵，女，硕士，研究方向：Msx1 翻译后修饰在发育中的分子作用；E-mail ：13210700132@fudan.edu.cn
通讯作者：王敬强，男，博士，研究方向：Msx1 在发育，出生缺陷，组织再生和癌症中的分子作用；E-mail ：Jingqiangwang@fudan.edu.cn
同源异型框蛋白 Msx1 的两个新的磷酸化位点的鉴定
程庆灵  王敬强 
（复旦大学  遗传工程国家重点实验室，上海  200438）
摘 要 ： 同源异型框蛋白 Msx1 的同系物 Msx2 中已鉴定出磷酸化修饰位点，并且发挥着重要的生物学功能。但是对 Msx1 的
磷酸化修饰情况还不清楚，为了对 Msx1 的磷酸化修饰情况进行研究。利用生物信息学的方法对 Msx1 的磷酸化修饰位点进行预测，
进一步利用免疫沉淀和质谱技术对其进行具体实验验证。C2C12 细胞中的 Msx1 蛋白复合物经胰蛋白酶消化后，通过高效液相色谱
和质谱技术进行分离和分析。结果发现两个新的磷酸化修饰位点，分别是 152 位的丝氨酸和 160 位的丝氨酸，而且两个磷酸化位
点在人和小鼠中是高度保守的。进一步，制备针对这两个磷酸化位点的特异性磷酸化抗体。磷酸化位点的鉴定以及特异性抗体的
获得为进一步研究 Msx1 的生物学功能提供了良好的条件。
关键词 ： 同源异型框蛋白 ；Msx1 ；磷酸化修饰 ；质谱鉴定
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.031
Identification of Two Novel Phosphorylated Sites of Homeoprotein
Msx1
CHENG Qing-ling  WANG Jing-qiang
（State Key Laboratory of Genetic Engineering，Fudan University，Shanghai 200438）
Abstract:  Some phosphorylated sites  in  the homolog Msx2 of  the homeoprotein Msx1 has been  identified，which plays a crucial 
biological role. However，the phosphorylated sites  in Msx1 are not known yet，thus  in order  to examine the Msx1 phosphorylated status，
we applied bioinformatics analysis  to predict phosphorylation sites  in Msx1，further used  immunoprecipitation and mass spectrometry 
to experimentally verify  the phosphorylation sites  in Msx1. Tryptic digests of Msx1 protein complexes purified  from C2C12 cells were 
separated and analyzed by nLC-MS-MS. Two novel phosphorylation sites（Ser152 and Ser160）were  identified，moreover，these  two 
sites were highly conserved in mouse and human. Furthermore，the specifically-phosphorylated antibody was prepared targeting  these  two 
phosphorylation sites. 
Key words:  homeoprotein ；Msx1 ；phosphorylation ；mass spectrometric identification
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.6212
了解许多生命活动的发生发展有重要的意义［6］。
同源异型框基因广泛存在于真核生物中，其结
构中含有一个高度保守的同源异型盒，编码一段含
有 60 个氨基酸残基的蛋白结构域，称为同源异型结
构域。作为一类重要的转录调控因子，在胚胎发育
中对组织和器官的形成具有重要的调控作用。核磁
共振及晶体学的研究表明，同源异型结构域可形成
螺旋—转折—螺旋结构，它可与 DNA 特异性结合。
同源异型结构蛋白（homeodomain protein）作为转录
因子通过与靶基因调控序列相结合来调控靶基因的
转录。有些同源异型结构域蛋白之间具有协同作用，
其不同组合方式可影响其活性［7］。
Msx1 作为哺乳动物中典型的同源异型框基因在
胚胎发育过程的多种组织和器官中表达，包括四肢、
颅面的衍生物、神经管和乳腺等［8-11］，对早期胚胎
发育起到重要的调控作用。Msx1 基因敲除小鼠显示
颅面发育缺陷，包括腭裂、牙齿畸形、颅骨和鼻骨
发育缺陷［12］，以及间脑发育缺陷［13］。Msx1 基因的
过量表达同样会导致细胞分化的缺陷，Msx1 转基因
小鼠出现乳腺增生［14］。Msx1 基因突变则造成人类
牙齿和骨骼等发育异常以及人类遗传相关疾病（出
生缺陷）如唇／腭裂、Witkop 综合症以及缺牙症［15］。
发育过程中 Msx1 作为转录因子通过调控其靶标基因
来介导上皮细胞和间质细胞之间的信号传导，负向
调控细胞分化［16-19］。Msx1 只在未分化的前体细胞
中表达，抑制前体细胞的终端分化［19，20］。前期研
究表明，在肢体发育中 Msx1 的抑制性靶标基因主
要分布在细胞核核周，而活化性靶标基因则均匀分
布在细胞核内。在胚胎发育中 Msx1 和 PRC2 复合物 
（Ezh2 复合物）在肢体（limb bud）和神经管（neural 
tube）高表达，但是 Msx1 只富集在肢体细胞核核
周并招募 PRC2 复合物到细胞核核周［21］，重新分
布组蛋白标记物 H3K27me3 到细胞核核周，最终
发挥转录抑制作用［21］。同时还发现，Msx1 招募甲
基化转移酶 G9a 到其靶标基因并产生抑制性标记
H3K9me2，抑制肌肉细胞分化［22］。经研究发现，
Msx1 和一系列转录因子如 Ezh2、G9a、PIAS1 等形
成蛋白复合物，发挥生物学作用［19，21，22］。
Msx1 的翻译后修饰可能对 Msx1 在发育中的生
物功能起着重要的调控作用。本研究以同源异性框
蛋白 Msx1 的翻译后修饰为切入点，利用生物信息学
和生物质谱学对其进行分析，发现两个新的磷酸化
修饰位点，为进一步研究 Msx1 的生物学功能以及磷
酸化修饰的动态调控在细胞分化过程中的作用奠定
了良好的基础。
1 材料与方法
1.1  材料
1.1.1  试剂  高保真聚合酶，T4 连接酶，Xho I、
BamH I 限制性内切酶，dNTP 等（TaKaRa），甲醇、
无水乙醇、氯化钠等生化试剂（国药），10 cm 培养
皿、6孔细胞培养板购自上海WHB公司，DMEM培
养基，胎牛血清（FBS）、胰酶 /EDTA、Opti-MEM、
Lipofectamine2000 购自 Life 公司。序列级胰蛋白酶
（trypsin） 购 于 德 国 Boehringer Mannheim GmbH 公
司，乙腈为美国 Fisher Scientific 公司产品，三氟乙
酸（TAF）为Merk 公司产品。所用水为Mili-Q 水。
1.1.2  质粒和细胞系  pcDNA3-Flag-Msx1，pLERS-
IRES-GFP-Flag-Msx1［17，18］，pcDNA3 表达质粒用来做
瞬时转染，pLERS-IRES-GFP 用来生产逆转录病毒。
C2C12 细胞和 PhE 细胞来源于 ATCC。
1.1.3  引 物  Msx1（S152A）-F ：5-TGG ATG CAG 
AGT CCC CGC TTC GCC CCG CCC CCA GCC AGA 
CGG CTG-3 ；Msx1（S152A）-R ：5-CAG CCG TCT 
GGC TGG GGG CGG GGC GAA GCG GGG ACT CTG 
CAT CCA-3 ；Msx1（S160A）-F ：5-CCG CCC CCA 
GCC AGA CGG CTG GCT CCC CCA GCA TGC ACC 
CTA CGC-3 ；Msx1（S160A）-R ：5-GCG TAG GGT 
GCA TGC TGG GGG AGC CAG CCG TCT GGC TGG 
GGG CGG-3。
1.2  方法
1.2.1  突变体质粒的构建  以 pcDNA3-Flag-Msx1
质粒为模板，用 Primer Premier 5 软件进行引物设
计，PCR 扩增 F-Flag-Msx1（S152A）和 R-Flag-Msx1
（S152A） 片 段；F-Flag-Msx1（S160A） 和 R-Flag-
Msx1（S152A）片段。引物由苏州金唯智公司合成，
序列如上。PCR 的参数设置为：98℃，预变性 30 
s ；98℃变性 10 s，58℃退火 15 s，72℃延伸 1 min，
35 个循环；72℃延伸 5 min。胶回收 F 端 PCR 产
物；同样程序进行 PCR，胶回收 R端 PCR 产物；以
2016,32(6) 213程庆灵等：同源异型框蛋白Msx1 的两个新的磷酸化位点的鉴定
F 端和 R 端 PCR 产物为模板，SP6 和 T7 为引物进
行 PCR，最后胶回收 PCR 产物，用 BamH I 和 Xho
I 分别酶切 PCR 扩增产物和 pcDNA3 载体。回收
DNA 片段，并用 T4 连接酶 16℃连接过夜。连接产
物转化大肠杆菌 DH5α，在氨苄青霉素（终浓度 50 
μg/mL）的 LB 平板中培养过夜后，挑选菌落抽提质
粒进行酶切和测序鉴定。
1.2.2  细胞培养  C2C12 细胞在 DMEM 培养基（含
10% FBS）中，37℃、5% CO2 细胞培养箱中培养，
细胞生长接近 75% 时，0.05% 胰酶消化，吹散并加
新鲜培养基传代。
1.2.3  构建 Msx1 过表达的 C2C12 细胞  （1）按照
15%-25%密度接种PhE 细胞于10 cm细胞培养板中，
培养过夜。（2）将 12 μg 质粒 DNA 稀释于 0.8 mL 
Opti-MEM 中，混匀，室温放置 5 min ；另将 30 μL 
Lipofectamine2000 稀释于 0.8 mL Opti-MEM中，混匀，
室温放置 5 min。（3）将 Lipofectamine2000 稀释液滴
入 DNA 稀释液中，混匀，室温放置 20-30 min。（4）
吸去 PhE 细胞的培养液，补入 6.4 mL Opti-MEM。（5）
将 Lipofectamine2000 与 DNA 混合液轻柔混匀，缓慢
逐滴加入 PhE 细胞上，轻柔晃匀。（6）37℃，5％ 
CO2 细胞培养箱培养 4-6 h，将转染后细胞上清吸弃，
1×PBS 洗一遍，补入 10 mL 新鲜 DMEM（含 10％
胎牛血清）。（7）37℃，5％ CO2 培养 24 h，检测转
染效率。换成含有puromycin的 DMEM进行筛选2 d。
（8）第 3天，吸去 PhE 细胞的培养液，并用 1×PBS
洗一遍，补入 10 mL 新鲜 DMEM（含 10％胎牛血清）。
同时按照 5%-10% 细胞密度接种 C2C12 细胞于 10 
cm 细胞培养板中，培养过夜。（9）第 4天，用荧光
显微镜观察细胞，荧光效率几乎达到 100%，将 PhE
中的病毒用 0.45 μm的滤头过滤到 50 mL 离心管中，
加入 2 mL 新鲜 DMEM，并加入 12 μL Polybrane（8 
mg/mL），终浓度为 8 μg/mL，混合均匀。吸掉 C2C12
细胞的培养基，将上述混合好的病毒液缓缓加入
C2C12 细胞中。（10）37℃，5％ CO2 培养 24 h，观
察感染效率，并重复前一天操作过程。（11）37℃，5％ 
CO2 培养，等细胞长到 90% 左右收集细胞用于后期
实验。
1.2.4  免疫沉淀  用预冷的 PBS 洗涤细胞两次，最
后一次吸干 PBS，加入适量含蛋白酶抑制剂的细
胞裂解缓冲液（1×RIPA buffer，Protease inhibitor 
cocktail），冰上裂解 30 min，细胞裂解液于 4℃，最
大转速离心 10 min 后取上清；取少量裂解液以备
Western blot 分析。分别取 2 mL protein A 琼脂糖珠
和 2 mL Flag Bead（Sigma A-2220），用适量裂解缓
冲液洗 3 次，每次 800×g 离心 3 min ；将预处理过
的 40 μL protein A 琼脂糖珠（Sigma）加入到剩余裂
解液中，4℃缓慢摇晃 1 h，在 4℃ 以 800×g 速度离
心 3 min，将上清转移到新的 EP 管中，加入 60 μL
预处理过的 Flag Bead（Sigma A-2220），4℃缓慢摇
晃孵育 4 h。免疫沉淀反应后，在 4℃ 以 800×g 速
度离心 3 min，将琼脂糖珠离心至管底，将上清小心
吸去，琼脂糖珠用 1 mL 裂解缓冲液洗 3-4 次；最后
根据蛋白浓度加入相应体积的 2×SDS 上样缓冲液，
沸水煮 5 min ；SDS-PAGE，Western blotting。
1.2.5  质谱  将位于 33 kD 处的蛋白染色条带切下，
在脱色缓冲液（25 mmol/L NH4HCO3，50%（V/V）
乙腈）中脱色直至蓝色消失将脱色后的凝胶条带在
2%（W/V）二硫苏糖醇溶液中还原 30 min，再加
到 2.5%（W/V）碘乙酰胺溶液中反应 60 min，使游
离的巯基全部烷基化将胶条用乙腈脱水后，加入新
配制的测序级的胰蛋白酶的 50 mmol/L NH4HCO3 溶
液，在 37℃反应过夜次日加入适量 10%甲酸终止反
应，离心取上清液再用含有 10% 乙腈的 25 mmol/L 
NH4HCO3 溶液从胶条中反复抽提 3 次合并 3 次抽提
液，并与初始的上清液混合，即得到蛋白的酶解多
肽混合物，冻干后 20℃保存。所有干燥的多肽样
品均溶解在缓冲液 A（0.1% 甲酸 99% 水 +1% 乙腈
+0.1% 甲酸）中，再经 C18 反相毛细管色谱柱（100 
mm×0．17 mm）分离以 0.1% 甲酸和乙腈为流动相
进行梯度洗脱，洗脱梯度为 5%-40% 缓冲液 B（B：
99% 乙腈 +1% 水 +0.1% 甲酸），洗脱时间为 180 
min，流速为 0.25 μL/min，经毛细管反相色谱洗脱出
的多肽应用 LTQ Orbitrap 质谱分析，质核比检测范
围为 400-2 000 amu 应用数据依赖方式进行二级质
谱扫描，每个全扫描后进行 5 个二级扫描，碰撞能
量为 35%，动态排除时间为 2 min。
1.2.6  磷酸化抗体的制备  将合成的单磷酸化
多 肽 1（C-QSPRFpSPPPAR-NH2）、 非 磷 酸 化
多 肽 1（C-QSPRFSPPPAR-NH2）、 单 磷 酸 化 多
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.6214
肽 2（C-PARRLpSPPAC-NH2）、 非 磷 酸 化 多 肽 2
（C-PARRLSPPAC-NH2）分别注射兔子，并且分别使
用单磷酸化多肽及非磷酸化多肽制备亲和纯化柱，
对磷酸化特异性抗体进行纯化，制备针对两个位点
的特异性抗体。
2 结果
2.1  Msx1磷酸化位点的生物信息学预测
鉴于同源异型框蛋白 Msx1 在生物体发生和发
展中起着至关重要的作用，因此Msx1 的翻译后修饰
尤其是磷酸化修饰必然能够影响其功能的发挥。首
先利用磷酸化位点预测软件对Msx1 的蛋白序列（图
1-A）进行预测分析，发现其有 21 个潜在的磷酸化
位点，其中有 15 个丝氨酸，5 个苏氨酸和 1 个酪氨
酸分别被磷酸化，如图 1-C 所示。图 1-B 中显示的
两个磷酸化位点处于 Msx1 的同源结构域中。对上
述潜在的磷酸化位点进行序列分析，发现丝氨酸和
苏氨酸磷酸化位点前后 6个氨基酸残基是有区别的，
但是都具有一定的保守性，该结果说明这两种磷酸
化位点的激酶识别位点是不同的。蛋白质翻译后修
饰大多数都是由酶介导催化，预测结果表明是由不
同的激酶对这两个位点磷酸化的发生进行了催化，
分别是 cdc2 和 ATM、PKA和 IKK。
100
80
60
40
20
0
Pe
rc
en
ta
ge
o
f s
ite
s/
%
S T Y
1
5
15
A
B
C
A ：Msx1 的蛋白序列；B：152 位和 160 位丝氨酸的预测结果；C：Msx1 中丝氨酸、苏氨酸和酪氨
酸磷酸化位点的比例和保守氨基酸残基
图 1 Msx1 中磷酸化位点的预测
Input IP
Vector Flag-Msx1 Vector Flag-Msx1
Flag-Msx1
β-Actin
图 2 免疫共沉淀 Msx1 蛋白的 SDS-PAGE 检测结果
2.2  磷酸化位点的质谱鉴定
为了证实 Msx1 蛋白在小鼠 C2C12 细胞中的磷
酸化状态和预测结果是吻合的，首先在 C2C12 细胞
中过表达含有 Flag 标签的 Msx1 质粒，裂解 C2C12
细胞，用 SDS-PAGE 进行检测，取其中一块凝胶 33 
kD 处 IP 胶块用来做质谱鉴定，另一块利用Western 
blot 的方法和 Flag 抗体进行检测，如图 2所示。
2016,32(6) 215程庆灵等：同源异型框蛋白Msx1 的两个新的磷酸化位点的鉴定
富集，从而可以得到相对纯化的Msx1，这有利于对
Msx1 的质谱鉴定。通过质谱对Msx1 进行分析鉴定，
发现蛋白中有潜在的磷酸化修饰肽段，蛋白质谱学
的快速发展，能够在短时间内对潜在肽段进行二级
质谱分析，结果和软件预测是吻合的。
生物体内蛋白磷酸化修饰是一个动态调控过程，
不同生存环境都可能会影响蛋白的修饰状态。磷酸
化肽段非常不稳定，容易发生脱磷酸化，因此在实
验处理过程中除了加入磷酸酶抑制剂外还要注意操
作环境的温度。从免疫共沉淀技术到质谱鉴定，从
专一的生物化学反应再到特异性验证等一系列实验，
证实了Msx1 的磷酸化修饰状态，发现了丝氨酸 152
位和丝氨酸 160 位两个新的磷酸化位点。文中的特
异性抗体，利用 152 位和 160 位单磷酸化和非磷酸
化的肽段注射兔子，并且分别使用单磷酸化多肽及
非磷酸化多肽制备亲和纯化柱，对磷酸化特异性抗
体进行纯化，最后得到了特异性更高的抗体。特异
性抗体的制备和验证更是为后期实验的研究提供重
要依据，可以直接利用特异性抗体检测蛋白中磷酸
化位点，进一步研究生物体内磷酸化修饰的动态调
控模式。Msx1 磷酸化位点的实验验证，提供了现代
生物学研究中又一个富有启示性的案例。
本研究以同源异型框蛋白Msx1为代表研究蛋白
磷酸化修饰，优势在于Msx1 基因片段较小，操作方
便。运用生物信息学与质谱技术联合的方法对蛋白
翻译后修饰进行预测和鉴定分析，方便快捷，可以
通过预测软件对其他同源异型框蛋白进行预测，进
一步利用特异性抗体加以验证，为下一步研究Msx1
磷酸化修饰对其生物学功能的影响以及其他同源框
蛋白的生物功能奠定了扎实的生物基础。
本研究对人和小鼠的 Msx1 蛋白进行比对，二
者的蛋白序列具有高度保守性，特异性抗体所用的
肽段在人和小鼠中是相同的，因此可以直接用来检
测人的MSX1 磷酸化状态。但是不同物种中Msx1 的
磷酸化修饰是否完全相同，需要进一步验证。蛋白
的翻译后修饰大部分是由激酶介导，不同的酶可催
化同一个底物，同一个酶也可催化不同的底物。预
测结果同时提供了不同的潜在磷酸激酶，后期实验
可以通过体外磷酸激酶分析验证，通过对细胞内的
激酶敲除，利用特异性的磷酸化抗体进行检测。酶
质谱鉴定结果如图 3 所示，图 3-A 中红色肽段
为质谱鉴定出来的Msx1 肽段，蓝色圈里的是含有丝
氨酸 152 位和丝氨酸 160 位的磷酸化肽段位置。质
谱数据中有两处荷质比变化明显的峰，分别包含在
肽段 FpSPPPARR 和 RLpSPPACTLR 中，如图 3-B 和
3-C 的二级波谱图所示，这两处变化正是由于丝氨
酸 152 和丝氨酸 160 位的磷酸基团引起的。
2.3  磷酸抗体的制备及其验证
为了进一步证实这两个磷酸化位点的存在，合
成单磷酸化多肽 1（C-QSPRFpSPPPAR-NH2）、非
磷酸化多肽 1（C-QSPRFSPPPAR-NH2）、单磷酸化
多肽 2（C-PARRLpSPPAC-NH2）、非磷酸化多肽 2
（C-PARRLSPPAC-NH2）分别注射兔子，制备针对两
个位点的特异性抗体，采用Western blot 方法，利用
特异性抗体检测了第 152 位和第 160 位丝氨酸的磷
酸化状态，结果（图 4）同样证实Msx1 在这两个位
点是磷酸化的，并且这两个位点突变成丙氨酸后则
不能被磷酸化。
2.4  Msx1磷酸化位点的高度保守性
人和小鼠高覆盖率的基因组已被测序，而且同
源异型框基因还是一类高度保守的基因家族，为了
证实这两个磷酸化位点在二者之间是否有高度的保
守性，利用 NCBI 将蛋白序列进行比对，结果（图 5）
表明两个磷酸化位点具有高度保守性。此外，利用
生物信息学分析了人的蛋白序列，结果显示这两个
位点也是磷酸化的。
3 讨论
蛋白质磷酸化修饰是生物体内一类十分重要的
翻译后修饰，快速鉴定出蛋白磷酸化修饰位点成为
研究磷酸化修饰的关键之处，本研究首先利用预测
软件对Msx1 磷酸化位点进行预测，只需要直接输入
蛋白的氨基酸序列便可以进行磷酸化位点预测，方
便快捷，避免繁琐的实验操作，为磷酸化位点的确
定提供了一定的参考依据。但是预测软件只是根据
蛋白的一级结构进行预测，而生物体内蛋白质的结
构复杂多样，因此Msx1 磷酸化的确定，还必须通过
充分的实验来验证。本实验过程中，除了Msx1，细
胞裂解液中还含有其他蛋白成分，质谱分析对磷酸
化肽段纯度要求较高，然而免疫共沉淀能够使蛋白
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.6216
A
B
C
A ：红色代表Msx1 中磷酸化修饰肽段，蓝色圈代表 152 位和 160 位所在肽段；B和 C：152 位磷酸化位点的二级质谱图
图 3 Msx1 中磷酸化位点的质谱鉴定
2016,32(6) 217程庆灵等：同源异型框蛋白Msx1 的两个新的磷酸化位点的鉴定
对底物的催化反应可以是间接也可以是直接结合进
行催化，Msx1是否直接被酶催化，需要对Msx1的空间
结构做进一步分析。
4 结论
本研究首先运用生物信息学对同源异型框蛋白
Msx1 进行了预测，发现了 21 个潜在的磷酸化位点，
进而在 C2C12 细胞中过量表达 Msx1 蛋白，并利用
免疫共沉淀技术以及质谱分析技术对磷酸化位点进
行鉴定，发现了两个新的磷酸化位点，分别为丝氨
酸 152 位和丝氨酸 160 位，预测结果和实验结果具
有一致性。这两个位点的发现为研究Msx1 磷酸化修
饰以及其他翻译后修饰提供了重要的参考。同源异
型框基因又是一类高度保守的基因，实验结果同时
验证了这两个磷酸化位点在人和小鼠中都是高度保
守的，从而利用生物信息学软件对人的 MSX1 的磷
酸化修饰位点进行预测，可以为研究 MSX1 在调控
人类健康以及人类重大疾病相关的复杂生命过程中
精确的分子作用提供参考依据。
参 考 文 献
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［2］Duan JJ, Lozada AF, Gou CY, et al. Nicotine  recruits glutamate 
receptors to postsynaptic sites［J］. Mol Cell Neurosci, 2015, 68 ：
340-349. 
［3］Linke D, Koudelka T, Becker A, Tholey A.  Identification  and 
relative quantification of phosphopeptides by a combination of multi-
protease digestion and isobaric labeling［J］. Rapid Commun Mass 
图 4 利用 Western blot 验证特异性抗体的活性
homo 1
mus 1
homo 61
mus 61
homo 121
mus 121
homo 181
mus 181
homo 241
mus 241
homo 301
mus 301
60
60
120
120
180
180
240
240
300
300
303
303
红色代表人和小鼠 Msx1 蛋白中不一样的氨基酸；蓝色代表 Msx1 的转录抑制区域；绿色代表同源异型结构域；
浅紫色代表Msx1 的 C末端；黑色框代表 152 位和 160 位丝氨酸
图 5 人和小鼠的 Msx1 蛋白序列比对结果图
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.6218
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（责任编辑  李楠）