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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(6):89-95
液泡 H+-ATPase（V-ATPase）分布于液泡膜、
高尔基体、内涵体、质膜等真核细胞分泌系统膜上，
是一种转运质子的酶［1，2］。它们在植物细胞的生长、
离子平衡及逆境胁迫（如干旱、盐和重金属等）应
答方面起重要作用［3］。V-ATPase 是一种寡聚酶，由
13 个亚基组成，有 V1 和 V0 两个结构域。V1 域位于
胞质中，由 8个亚基（A、B、C、D、E、F、G和 H）
构成，为催化区域，参与 ATP 的水解；V0 域与膜结合，
收稿日期：2015-09-14
基金项目：国家自然科学基金项目（30460018），内蒙古自治区科技创新团队（201503004）
作者简介：苏杰，女，硕士，讲师，研究方向：植物生物化学与分子生物学；E-mail ：sujie_1546@163.com
通讯作者：王瑞刚，男，博士，教授，研究方向：植物生物化学与分子生物学；E-mail ：ruigangwang@126.com
过表达 VHA-c3 基因拟南芥对黑暗、ABA 与糖的响应
苏杰1，2  郭荣起2，3  李国婧2  王瑞刚2
（1. 内蒙古农业大学职业技术学院，土右旗  014109 ；2. 内蒙古农业大学生命科学学院，呼和浩特  010018 ； 
3. 内蒙古呼伦贝尔市农业科学研究所，牙克石  162650）
摘 要 ： 为研究液泡 H+-ATPase c 亚基基因（VHA-c3）在植物生长发育及非生物胁迫应答过程中的作用，构建了 VHA-c3 过
表达载体转化拟南芥，获得过表达 VHA-c3 的转基因纯合体植株，采用半定量 RT-PCR 技术分析了转基因拟南芥中 VHA-c3 的表达量，
然后对转基因拟南芥进行暗培养、ABA 和糖处理。结果获得 6 个 T2 代株系转基因纯合体株系，其 mRNA 表达量均高于对照 ；黑
暗条件下，5 个 VHA-c3 转基因株系的根长变短 ；在正常光照下，3 个转基因株系主根伸长和子叶的展开以及 5 个转基因株系的种
子萌发对 ABA 的抑制不敏感 ；分别有 5 个和 6 个转基因株系的种子萌发对葡萄糖和蔗糖的抑制不敏感。推测 VHA-c3 可能影响根
细胞的扩展，并可能参与 ABA 和糖介导的信号转导途径。
关键词 ： 拟南芥 ；VHA-c3 ；黑暗 ；ABA；糖
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.013
Responses of Overexpressed Arabidopsis VHA-c3 to Dark，ABA and
Sugar
SU Jie1，2  GUO Rong-qi2，3  LI Guo-jing2  WANG Rui-gang2
（1. School of Vocational and Technical，Inner Mongolia Agricultural University，Tuyouqi 014109 ；2. School of Life Sciences，Inner Mongolia
Agricultural University，Hohhot 010018 ；3. Agricultural Sciences of Hulunbeier in Inner Mongolia，Yakeshi 162650）
Abstract:  For studying  the role of vacuole H+-ATPase subunit c gene（VHA-c3）in plant growth and abiotic stress  response，an 
over-expression vector of VHA-c3 was constructed and introduced into wild-type Arabidopsis thaliana. The expression levels of VHA-c3 in the 
transgenic homozygote’s plants were detected by semi-quantitative RT-PCR，then the transgenic homozygote were  treated by dark，ABA 
and sugar. The results indicated that 6 lines of homozygous T2 transgenic plants were obtained，and their corresponding transcript levels were 
increased. The root lengths of 5 lines were reduced among the dark-grown seedlings. Among the ABA-treated seedlings，3 lines were insensitive 
in primary root growth and the extent of cotyledon unfolding，and 5 lines were insensitive in seed germination. When treated by glucose and 
sucrose，5 lines and 6 lines reduced the sensitivity in seed germination，respectively. These results indicate that VHA-c3 may affect the cell 
expansion of root，and be involved in the signal transduction pathways mediated by ABA and sugar.
Key words:  Arabidopsis thaliana ；VHA-c3 ；dark ；ABA ；sugar
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.690
由亚基 a、c、c、c、d和 e 组成，为质子传导区域［4］。
其中，V-ATPase c（VHA-c）亚基以六聚体形式形成
环形结构，是膜 V0 域的主要组件，且对 V1 域与膜
的组装起重要作用，是质子转运的通道［5］。研究表 
明，c亚基与植物生长［6］和抗非生物胁迫［7-9］有关。
模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）VHA-c
亚基由 5个同源基因，即 VHA-c1、VHA-c2、VHA-c3、
VHA-c4 和 VHA-c5 编码［10］。有关拟南芥 VHA-c 基因
的研究已有很多报道。其中对于 VHA-c3 基因的研究
显示，VHA-c3 的表达具有组织特异性且与植物响应
非生物胁迫有关。Padmanaban 等［11］研究发现拟南
芥 VHA-c3 基因在根尖中呈优势表达。徐萍等［12］揭
示 VHA-c3 基因在拟南芥的果荚、花、叶、茎和根
中都有表达，但在叶中的表达量远远高于其它的组
织，同时发现在 VHA-c3 基因起始密码子上游 2 812-
2 234 bp 之间的区域内存在着控制该基因高表达的
转录调控元件。郭荣启等［13］同样利用 GUS 报告基 
因，研究了 VHA-c3 基因的植物组织及器官定位发
现 3 个不同长度 VHA-c3 基因上游存在着控制基因
在气孔表达的转录调控元件。在逆境及非生物胁
迫响应方面，Padmanaban 等［11］利用 dsRNAi 发现
VHA-c3 对盐胁迫敏感。徐萍等［14］的研究揭示拟南
芥 VHA-c3 参与了抗盐和 ABA 胁迫反应。邸娜等［15］
发现拟南芥 VHA-c3 基因对外源激素（如 IAA、ABA
和ACC）以及盐胁迫和渗透胁迫有响应。于秀敏等［16］
揭示 4℃低温和光照促进 VHA-c3 表达。另外，在矿
质营养调节方面，Ca2+ 和 MS 营养成分促进拟南芥
VHA-c3 的表达［17］。
基于以上对 VHA-c3 基因的研究，本实验构建该
基因的过表达载体，转化野生型拟南芥，采用半定
量 RT-PCR 技术分析转基因拟南芥中 VHA-c3 的表达
量；同时，对转基因纯合体进行暗培养、ABA 处理
和糖处理并观察其表型，旨为研究 VHA-c 基因在植
物生长发育及非生物胁迫应答的功能提供新的理论
依据。
1 材料与方法
1.1  材料
1.1.1  植物材料  野生型 Columbia 生态型拟南芥，
由内蒙古农业大学植物分子生物学实验室提供。
1.1.2  菌株和质粒  根癌农杆菌 GV3101、大肠杆菌
DH5α 和 pCHF3 载体由内蒙古农业大学植物分子生
物学实验室保藏。
1.1.3  主要试剂  Taq 酶、DNA marker 和反转录试
剂盒等购自大连宝生物公司，各种限制性内切酶、
T4 DNA 连接酶购自 NEB 公司，抗生素购自 BBI 公 
司，RNaseA、pGM-T、DNA 回收试剂盒和质粒小提
试剂盒购自北京天根公司，引物合成和测序工作由
上海生工公司完成。
1.2  方法
1.2.1  基因克隆及过表达载体构建  拟南芥基因组
DNA 提取采用 CTAB 法［18］。VHA-c3 基因克隆采用
PCR 法，PCR 引 物 P1 为：5-GGTACCAGAATCGC-
CTGAGAGATG-3（Kpn I）和 P2 为：5-GGATCCTG-
ACAAACAATATAAGAAGATC-3（BamH I）。PCR 扩
增条件为：95℃预变性 1 min ；95℃变性 10 s，58℃
退火 30 s，72℃延伸 2 min，共 30 个循环；72℃延
伸 6 min。
农杆菌转化采用电击法［19］，过表达质粒载体
pCHF3-c3 转化到的农杆菌 GV3101 细胞中，取 50 
μL 转化产物涂于 LB 固体培养基（含 25 μg/mL Gent
和 100 μg/mL Spect）上，28℃培养 36 h，筛选阳性
转化子并进行菌落 PCR 和双酶切鉴定，验证正确后
得到重组菌 GV3101/pCHF3-c3。
1.2.2  拟南芥转化及转基因纯合体的获得  将经验
证正确后得到的重组菌GV3101/pCHF3-c3于LB固体
培养基（同上）平板上划线，28℃培养 48 h。挑取 5-6
个单克隆于 5 mL 的 LB 液体培养基（含 25 μg/mL 
Gent 和 100 μg/mL Spect）中培养，28℃震荡培养过 
夜。次日，取 1 mL 过夜培养的菌液重新接种于
100 mL LB 液体培养基（同上）中，28℃震荡培养
至 OD600 为 1.2-1.6。将菌液于 4 000 r/min，离心
15 min，收集菌体，将菌体用 LB液体培养基重悬浮，
所得悬浮液 OD600 为 0.8，用于拟南芥的转化。
采用浸花法［20］转化野生型拟南芥，利用 30 
μg/mL 的 Kan 对转基因植株 T2 代进行筛选，鉴定出
纯系用于本研究的各项分析。
1.2.3  半定量 RT-PCR 检测基因表达量  提取野生
型和 VHA-c3 过表达转基因纯系拟南芥的总 RNA，
2016,32(6) 91苏杰等：过表达 VHA-c3基因拟南芥对黑暗、ABA与糖的响应
反转录得到 cDNA。再分别以野生型和过表达转基
因纯合体的 cDNA 为模板，对 actin（At3g12110）
和 VHA-c3 基因进行 PCR 扩增。actin 引物为 P3 ：
5-ATGGCAGATGGTGAAGACATTCAG-3 和 P4 ：
5-GAAGCACTTCCTGTGGACTATTGA-3，VHA-c3 引
物为 P5 ：5-CATATTTTAAGATCCAGAATCGCCTGA-
GAG-3  和 P6 ：5-TTCGGCTCTGGACTGACCAGCTC-
GGGAGGA-3。PCR反应条件为：94℃预变性 5 min；
94℃变性 30 s，50℃退火 30 s，72℃延伸 90 s，25
个循环；72℃延伸 5 min［11］。将 PCR 产物于 1.5%
琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析（Syngene 公司凝胶
成像仪）。
1.2.4  转基因植株暗培养  VHA-c3 转基因纯合体和
野生型拟南芥种子同时种在 1/2MS 培养基上，暗培
养 5 d 后统计根长。
1.2.5  转基因植株 ABA处理  （1）VHA-c3 转基因纯
合体和野生型拟南芥种子同时种在 1/2MS 培养基中，
4℃春化 3 d，再于 22℃、16 h 光照 /8 h 黑暗条件下
培养，48 h 后转移至含不同浓度 ABA（0、4、8 和
12 μmol/L）的 1/8MS 培养基上，16 h 光照 /8 h 黑暗
培养 4 d，统计主根长度。（2）VHA-c3 转基因纯合
体和野生型拟南芥种子同时种在含有不同浓度 ABA
（0、0.5、1 和 2 μmol/L）的 1/2MS 培养基中，4℃春
化 3 d 后于 22℃、16 h 光照 /8 h 黑暗条件下培养 2 d，
统计萌发率。
1.2.6  转基因植株糖处理  VHA-c3 转基因纯合体和
野生型种子同时分别种在含葡萄糖或蔗糖（浓度均
为 0%、4%、5%和 6%）的 1/2MS 培养基中，4℃春
化 3 d 后于 22℃、16 h 光照 /8 h 黑暗条件下培养 3 d，
统计其萌发率。
2 结果
2.1 VHA-c3基因的克隆及过表达载体pCHF3-c3的
构建 
以拟南芥基因组 DNA 为模板，以 P1、P2 为模
板进行 PCR 扩增，获得大小为 1 636 bp 基因片段
VHA-c3，PCR 产物与 pGM-T 载体连接后测序。验证
目的片段正确后，将阳性质粒 pGM-T-c3 和表达载体
pCHF3 用 Kpn Ⅰ和 BamHⅠ双酶切，胶回收 VHA-c3
基因和 pCHF3 载体，连接后转化 E.coli DH5α，提取
阳性转化子的质粒，进行 Kpn Ⅰ和 BamH Ⅰ的双酶
切验证，证明重组表达载体 pCHF3-c3 构建成功。用
电击法将重组质粒 pCHF3-c3 转化农杆菌 GV3101，
挑选培养在含 Spect 和 Gent 的 LB 固体培养基上的
单克隆，进行菌落 PCR 检测呈阳性，证明重组质粒
pCHF3-c3 已经转入农杆菌 GV3101 中。
2.2  VHA-c3转基因植株的筛选
重组质粒 pCHF3-c3 经农杆菌介导转入野生型
拟南芥。筛选后获得 30 个 T1 代转基因株系，进一
步筛选获得 6个 T2 代转基因纯合体株系，分别是：
c3-8-3、c3-11-1、c3-12-5、c3-16-8、c3-21-1 和 c3-
22-6。
2.3 VHA-c3转基因纯合体半定量RT-PCR鉴定
以野生型为对照，采用半定量 RT-PCR 对 VHA- 
c3 转基因纯合体进行检测（图 1）。将WT的 VHA-c3
的转录水平定为 100%，c3-16-8 的 mRNA 表达水
平较强（表达量为 181%）；c3-8-3、c3-11-1 和 c3-
12-5 的 mRNA 表达水平居中（表达量分别为 159%、
141% 和 163%）；c3-21-1 和 c3-22-6 的 mRNA 
表达水平较弱（表达量分别为 103%和 106%）。
1 2 3 4 5 6WT
actin
VHA-c3
WT：野生型；1-6 ：分别代表转基因纯合体株系 c3-8-3、c3-11-1、c3-12-5、
c3-16-8、c3-21-1 及 c3-22-6 
图 1 过表达转基因纯合体 VHA-c3 基因的 mRNA 表达水平
2.4  VHA-c3转基因纯合体暗培养后根的变化
在正常光照培养下，VHA-c3 过表达纯合体与野
生型拟南芥差异不明显。将转基因纯合体暗培养 5 d
后测量根长，结果（图 2，图 3）显示，有 5个株系
的平均根长比对照分别短 11%、31%、9%、21% 和
15%。表明在黑暗条件下，VHA-c3 基因过量表达抑
制了根的生长。
2.5  ABA处理下VHA-c3转基因纯合体的变化 
2.5.1  VHA-c3 转基因纯合体主根伸长和子叶的变
化  经 ABA 处理后，有 3 个 VHA-c3 转基因纯合体
株系的主根相对伸长量比对照增加。ABA浓度越高，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.692
转基因纯合体和野生型主根生长被抑制的程度及子
叶的黄化程度越大，且 VHA-c3 转基因株系子叶的展
开程度要高于对照（图 4，以 c3-12-5 为例）。在 4 
μmol/L ABA 浓度下，3 个株系主根的相对伸长量平 
均比对照分别增加 3%、1%和 16%；在 8 μmol/L ABA
浓度下，分别增加 1%、6% 和 16%；在 12 μmol/L 
ABA 浓度下，分别增加 6%、1%和 10%（图 5）。
2.5.2  VHA-c3 转基因纯合体种子萌发率的变化  当
用浓度大于 2 μmol/L 的 ABA 处理 VHA-c3 转基因纯
合体时，几乎所有种子的萌发全部被抑制；当 ABA
浓度介于 0-2 μmol/L 时，有 5 个过表达纯系和野生
型种子的萌发受到抑制，且当 ABA浓度增大时，种
子萌发率均下降。在不同浓度 ABA 抑制下，这 5
个转基因纯系的萌发率均大于对照：在 0.5 μmol/L 
ABA 下，5 个株系的萌发率比对照增加 32%、15%、
WT c3-11-1
WT c3-16-8
图 2 VHA-c3 转基因纯合体在暗培养下根长变短
14
12
10
8
6
4
2
0
c3-8-3 c3-11-1
** **WT c3
c3-12-5 c3-16-8 c3-22-6
ṩ䮯/mm
** 表示转基因株系与野生型在 0.01 水平存在显著差异；下同
图 3 暗培养条件下 VHA-c3 转基因纯合体根伸长变短
WTA
ABA/0 μmol/L
c3-12-5
WTB
ABA/4 μmol/L
c3-12-5
WTC
ABA/8 μmol/L
c3-12-5
WTD
ABA/12 μmol/L
c3-12-5
图 4 不同浓度 ABA 处理下的转基因系 c3-12-5
120
100
80
60
40
20
0
0 4 8 12
**
*
**
**
WT
c3-8-3
c3-11-1
c3-12-5
ABA⎃ᓖμmol·L-1ѫṩ⴨ሩը
䮯䟿%
* 表示转基因株系与野生型在 0.05 水平存在显著差异，下同
图 5 ABA 处理下 VHA-c3 转基因纯合体主根相对伸长量
2016,32(6) 93苏杰等：过表达 VHA-c3基因拟南芥对黑暗、ABA与糖的响应
25%、2%  和 9%；在 1 μmol/L ABA 下，萌发率增
加 量 分 别 为 98%、80%、60%、30% 和 68%；在
2 μmol/L ABA 浓度下，增加量分别为 106%、79%、
73%、30%和 58%（图 6）。
以上结果表明，VHA-c3 基因的过表达使根、子
叶和种子对 ABA变得不敏感。
发现，A 亚基和 E 亚基的转录水平分别在棉花纤维
细胞［21］的伸长过程或在扩展的大麦叶子［22］中增
加；C 亚基表达量的减少导致拟南芥突变株 det3 发
育不良，可能机制是 V-ATPase 活性受不同植物激
素的调控，原因在于 C 亚基对油菜素内酯诱导的细
胞扩展是必不可少的［23］；对转基因胡萝卜的分析表
明，通过抑制 A 亚基的表达，其叶子细胞变小［24］。
Padmanaban 等［11］研究发现 VHA-c1 对细胞扩展起重
要作用，原因在于 VHA-c1 启动子在根的伸长区及其
它不断增大的组织中的活性很高，同时通过 dsRNA
干扰介导的突变株 VHA-c1 在暗培养下根和下胚轴长
度变短。Zhou 等［6］研究过表达星星草 VHA-c 转基
因拟南芥时发现在正常条件和盐胁迫下转基因植株
的根长、鲜重、高度和荚子数量均大于野生型，经
检测 V-ATPase 的活性增大，解释 VHA-c 在植物生长
方面发挥重要作用的机制是 c 亚基影响了 V-ATPase
依赖的内涵体的运输。
本研究中多数 VHA-c3 过表达纯合体在暗培养
下根变短，且在 ABA处理下根的相对伸长增加，这
些结果也揭示 VHA-c3 对根细胞扩展的可能作用。推
测可能是因为 VHA-c3 基因的上游调控区存在光敏感 
ABA⎃ᓖμmol·L-1
WT
c3-8-3
c3-11-1
c3-12-5
c3-16-8
c3-21-1
100
80
60
40
20
㨼ਁ⦷%
0 0.5
**
**
**
**
**
** **
**
**
**
*
1.51.0
图 6 ABA 处理下 VHA-c3 过表达纯合体种子的萌发率
2.6  不同浓度糖处理下VHA-c3转基因纯合体种子
萌发率的变化 
浓度小于 4% 的 Glc 或 Suc 对 VHA-c3 过表达转
基因纯合体和野生型种子的萌发影响较小；当浓度
大于 6% 时，种子几乎不萌发。在浓度介于 4%-6% 
Glc 和 Suc 处理下，分别有 5个和 6个株系的种子萌
发率高于WT（图 7-A，7-B），具体表现为：
在 Glc 处理下，浓度为 4% 时，这 5 个株系的
种子萌发率平均分别比 WT 增加 6%、10%、6%、
11% 和 13%；浓度为 5% 时，平均增加 15%、27%、
22%、25% 和 29%；浓度为 6% 时，平均增加 2%、 
6%、37%、45%和 55%。
在 Suc 处理下，浓度为 4%时，6个株系的种子
萌发率平均分别比WT增加 10%、15%、2%、9%、7%
和 10%；浓度为 5%时，平均增加 12%、19%、11%、 
5%、9%和 13%；浓度为 6%时，平均增加 13%、3%、
11%、17%、14%和 14%。
这说明 VHA-c3 基因的过表达使种子对糖的敏感
度降低。
3 讨论
3.1 VHA-c3可能对根细胞扩展起作用
人们对 V-ATPase 亚基在细胞扩展方面的研究
WT
c3-8-3
c3-11-1
c3-12-5
c3-16-8
c3-21-1
c3-22-6
100
90
80
70
60
50
**
**
**
0 4 5 6
**
****
**
****
**
** ** ****
**
*
㭇㌆⎃ᓖ/%㨼ਁ⦷
%
100
90
80
70
60
50
0 4 5 6㪑㨴㌆⎃ᓖ/%㨼ਁ⦷
% * *** **** ******
**
**
**
WT
c3-8-3
c3-11-1
c3-12-5
c3-16-8
c3-22-6
B
A
图 7 不同浓度葡萄糖（A）和蔗糖（B）处理下 VHA-c3
转基因纯合体株系种子萌发率
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.694
元件（如 ACE、AE-box、GAG、GATA、TCCC-motif、 
TCT-motif 等）和激素响应元件（如 ABRE、AuxRR-
core、TGA-box、TCA-element、TGACG-motif、TATC-
box、P-box、GA-motif 等），黑暗信号和外源 ABA的
刺激可能直接或间接调控了转基因植株 VHA-c3 的表
达，从而影响 c亚基的表达量，使根细胞的 V-ATPase
活性改变，影响了 V-ATPase 依赖的内涵体的运输，
最终影响根细胞的扩展。当然这一机制还需要进一
步的细胞学实验验证。
3.2  VHA-c3可能参与ABA和糖介导的信号转导途径
ABA 是一种参与种子休眠、芽休眠、叶及根的
伸展及叶片脱落等生理活动的植物激素。研究表明，
许多植物在响应 ABA 过程中 V-ATPase 活性及 H+
转运活性增加［25］，而且已有报道称 ABA 可以诱导
V-ATPase c 亚基［7，12］。本研究 50%的转基因纯系主
根伸长和子叶的展开以及 80%的转基因纯系的种子
萌发对 ABA 的抑制不敏感，推测 VHA-c3 的过表达
影响了 V-ATPase 活性和 H+ 转运活性，进而影响了
拟南芥的种子萌发及子叶和根的生长。
另外，很多植物响应 ABA的生理过程与糖有关。
有人研究了拟南芥的 RGS（The regulator of G-protein 
signaling）蛋白，对 AtRGS1 过表达纯合体种子在萌
发阶段分别进行 ABA和葡萄糖处理，发现过表达纯
合体种子的萌发率都较野生型高，说明它对二者均
不敏感［26］。类似地，Chen 等［27］发现在种子萌发和
幼苗生长方面，对 ABA不敏感的突变体 hy5 对糖的
抑制同样是不敏感的。原因是外源 ABA对种子萌发
的抑制致使种子营养缺乏，而糖通过提供能量和营
养克服了 ABA对种子萌发的抑制，从而缓解代谢的
抑制作用［26，27］。本研究发现 VHA-c3 过表达纯系对
ABA不敏感后，对其种子进行了葡萄糖和蔗糖处理，
得到了类似的结果，即 80%以上的过表达纯系的种
子萌发对糖不敏感。综合本实验 ABA、葡萄糖和蔗
糖处理的结果，VHA-c3 转基因植株对以上 3 种处理
均不敏感，这说明 VHA-c3 可能参与了 ABA 和糖介
导的信号转导途径，至于其具体机制还有待于进一
步的实验验证。
综上所述，本研究利用过表达对拟南芥 VHA-c3
基因进行了研究，对过表达纯合体进行了黑暗、
ABA、葡萄糖和蔗糖处理，它们的表型与野生型存
在差异。这将为探讨 VHA-c3 基因乃至 V-ATPase 在
植物发育、细胞信号转导及抗非生物胁迫的功能方
面提供线索。
4 结论
通过构建 VHA-c3 过表达载体并转化野生型拟南
芥，获得了过表达 VHA-c3 的转基因纯合体。采用半
定量 RT-PCR 技术分析了转基因拟南芥中 VHA-c3 的
表达量，验证了其 mRNA 的高表达水平。对转基因
拟南芥进行暗培养、ABA 和糖处理，结果显示，黑
暗条件下，83%的 VHA-c3 转基因株系的根长变短；
在正常光照下，半数以上的转基因株系在主根伸长、
子叶的展开以及种子萌发方面对 ABA 的抑制不敏
感；83%以上的转基因株系在种子萌发方面对糖（葡
萄糖和蔗糖）的抑制不敏感。推测 VHA-c3 可能影响
根细胞的扩展，并可能参与 ABA和糖介导的信号转
导途径。
参 考 文 献
［1］Sze H, Li X, Palmgren M. Energization of the plant cell membranes 
by H+-pumping ATPases ：biosynthesis and regulation［J］. The 
Plant Cell, 1999, 11 ：677-689. 
［2］Dietz KJ, Tavakoli N, Kluge C, et al. Significance of  the V-type 
ATPase  for  the adaptation  to  stressful growth conditions and  its 
regulation on the molecular and biochemical level［J］. Journal of 
Experimental Botany, 2001, 52 ：1969-1980. 
［3］Schumacher K, Krebs M. The V-ATPase ：small  cargo,  large 
effects［J］. Current Opinion  in Plant Biology, 2010, 13（6）：
724-730. 
［4］Arata Y, Baleja JD, Forgac M. Cysteine-directed cross-linking  to 
subunit B suggests that subunit E forms part of the peripheral stalk of 
the vacuolar H+-ATPase［J］. The Journal of Biological Chemistry, 
2002, 77 ：3357-3363. 
［5］Hirata T, Iwamoto-kihara A, Sun-wada GH, et al. Subunit rotation of 
vacuolar-type proton pumping ATPase ：relative rotation of the G as 
to c subunit［J］. The Journal of Biological Chemistry, 2003, 278 ：
23714-23719. 
［6］Zhou A, Bu Y, Takano T, et al. Conserved V-ATPase c  subunit 
plays a  role  in plant growth by  influencing V-ATPase-dependent 
2016,32(6) 95苏杰等：过表达 VHA-c3基因拟南芥对黑暗、ABA与糖的响应
endosomal trafficking［J］. Plant Biotechnology Journal, 2016, 14
（1）：271-283. 
［7］  Tsiantis MS, Bartholomew DM,  Smith  JAC.  Salt  regulation  of 
transcript levels for the c subunit of a leaf vacuolar H+-ATPase in the 
halophyte Mesembryanthemum crystallinum［J］. The Plant Journal 
for Cell and Molecular Biology, 1996, 9 ：729-736. 
［8］Baisakh N, Ramanarao MV, Rajasekaran K, et al. Enhanced salt 
stress  tolerance of  rice plants expressing a vacuolar H+-ATPase 
subunit c1（SaVHAc1）gene  from  the halophyte grass Spartina
alterniflora Löisel［J］. Plant Biotechnology Journal, 2012, 10（4）：
453-464. 
［9］Feng L, Ding H, Wang J, et al. Molecular cloning and expression 
analysis of RrNHX1 and RrVHA-c genes related to salt  tolerance in 
wild Rosa rugosa［J］. Saudi Journal of Biological Sciences, 2015, 
22（4）：417-423. 
［10］Sze H, Schumacher K, Muller ML, et al. A simple nomenclature 
for a complex proton pump ：VHA genes encode the vacuolar H+-
ATPase［J］. Trends in Plant Science, 2002, 7 ：157-161. 
［11］Padmanaban S, Lin X, Perera  I,  et  al. Differential  expression 
of  vacuolar H+-ATPase  subunit  c  genes  in  tissues  active  in 
membrane trafficking and their roles in plant growth as revealed by 
RNAi［J］. Plant Physiology, 2004, 134（4）：1514-1526．
［12］徐萍 , 李小方 , 曾卫军 , 等 . 拟南芥 VHA-c3 基因的特异性表达
和调节［J］. 华东师范大学学报：自然科学版 , 2006, 2 ：98-
104. 
［13］郭荣起 , 苏杰 , 王福慧 , 等 . 拟南芥 VHA-c3 启动子的 GUS 基
因融合表达［J］. 中国生物工程杂志 , 2008, 28（7）：58-62．
［14］徐萍 , 刘瑞香 , 曾卫军 , 等 . 拟南 VHA-c 基因在非生物胁迫响
应中的作用［J］. 华北农学报 , 2006, 21（1）：19-22. 
［15］邸娜．拟南芥液泡 H+-ATPase c 亚基基因功能的研究［D］．
呼和浩特：内蒙古农业大学 , 2006．
［16］于秀敏 , 武燕 , 王瑞刚 . 温度和光照对拟南芥 VHA-c 基因启动
子活性的调节［J］. 河南师范大学学报：自然科学版 , 2013, 
41（4）：120-123. 
［17］张春霖 , 尚世辉 , 王瑞刚．拟南芥 VHA-c 基因的矿质营养调
节［J］. 河南科技大学学报：自然科学版 , 2014, 35（5）：79-
81. 
［18］Murray MG, Thompson WF. Rapid  isolation of high molecular 
weight plant DNA［J］. Nucleic Acids Research, 1980, 8（19）：
4321-4325．
［19］Mersereau M, Pazour GJ, Das A. Efficient  transformation  of 
Agrobacterium tumefaciens by electroporation［J］. Gene, 1990, 
90（1）：149-151．
［20］Clough  SJ,  Bent  AF.  Floral  dip ：a  simplified method  for 
Agrobacter ium-mediated  t ransformat ion  o f   Arabidopsis
thaliana［J］. The Plant Journal ：for Cell and Molecular Biology, 
1998, 16（6）：735-743. 
［21］Smart LB, Vojdani F, Maeshima M,  et  al. Genes  involved  in 
osmoregulation during turgor-driven cell expansion of developing 
cotton  fibers are differentially regulated［J］. Plant Physiology, 
1998, 116 ：1539-1549. 
［22］Dietz KJ, Rudloff S, Ageorges A, et al. Subunit E of  the vacuolar 
H+-ATPase of Hordeum vulgare L. ：cDNA cloning, expression 
and immunological analysis［J］. The Plant Journal ：for Cell and 
Molecular Biology, 1995, 8 ：521-529. 
［23］Schumacher K, Vafeados D, Mccarthy M, et al. The Arabidopsis 
det3 mutant reveals a central role  for  the vacuolar H+-ATPase in 
plant growth and development［J］. Genes & Development, 1999, 
13 ：3259-3270. 
［24］Gogarten JP, Fichmann J, Braun Y, et al. The use of antisense 
mRNA to  inhibit  the  tonoplast H+-ATPase  in carrot［J］. Plant 
Cell, 1992, 4 ：851-864. 
［25］Barkla BJ, Vera-estrella R, Maldonado-gama M, et al. Abscisic acid 
induction of vacuolar H+-ATPase activity  in Mesembryanthemum
crystallinum  is developmentally regulated［J］. Plant Physiology, 
1999, 120（3）：811-820. 
［26］Chen Y, Ji F, Xie H, et al. The regulator of G-protein signaling 
proteins involved in sugar and abscisic acid signaling in Arabidopsis 
seed germination［J］. Plant Physiology, 2006, 140（1）：302-
310．
［27］Chen H, Zhang  J, Neff MM.  Integration  of  light  and  abscisic 
acid  signaling  during  seed  germination  and  early  seedling 
development［J］. Proceedings  of  the National Academy  of 
Sciences of the United States of America, 2008, 105（11）：4495-
4500．
（责任编辑  狄艳红）