全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(7):242-249
收稿日期 ：2015-10-13
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31460311），内蒙古自然科学基金课题项目（2012ZD04）
作者简介 ：奥旭东，男，博士，研究方向 ：哺乳动物生殖生物学 ；E-mail ：aoxudong_123@126.com
通讯作者 ：于海泉，男，博士，研究员，研究方向 ：哺乳动物生殖生物学 ；E-mail ：haiquan_yu@yahoo.com
牛早期胚胎发育中 AID 基因的表达及其调节区 DNA 甲
基化的动态变化
奥旭东  萨如拉  王杰  王会敏  于海泉
（内蒙古大学实验动物研究中心，呼和浩特 010021）
摘 要 ： 以具有 DNA主动去甲基化作用的活化诱导胞苷脱氨酶（Activation-induced cytidine deaminase，AID，亦称为
AICDA）基因为研究对象，检测其在牛卵母细胞及体外受精胚胎发育不同阶段的表达变化及其调节方式，揭示细胞重编程分子机
制。应用 Real-time PCR、BSP（Bisulfite Sequencing PCR）和免疫荧光化学等方法分析 DNA甲基化对牛早期胚胎发育中 AID基因表
达的影响。结果显示，AID基因在牛早期胚胎发育中受 DNA甲基化的调控，AID基因的 T-DMR（tissue-dependent and differentially
methylated region）位于其转录起始位点 -88 bp － -431 bp。在牛卵母细胞成熟过程中，T-DMR第 2和第 3号 CpG位点的 DNA甲基
化明显去除，而其他位点都未发生变化。卵母细胞在成熟过程中 AID基因的积累与 DNA甲基化状态变化相关。在牛体外受精胚发
育早期的各阶段，尽管 AID基因的表达不同，但 AID基因 T-DMR除第 2和第 3号 CpG位点一直都维持去甲基化状态外，其他位
点始终维持甲基化状态。推测其表达的变化可能是胚胎基因组激活有关。以上研究表明，AID基因 T-DMR的低甲基化与其表达存
在一定的相关性。通过免疫荧光检测发现，从卵母细胞成熟期到桑椹胚期，AID蛋白都是均匀分布于细胞核和细胞质中。而囊胚
时期大量 AID蛋白集中于内细胞团，这可能对于内细胞团多能性的维持起重要作用。综上所述，牛卵母细胞成熟中积累的 AID作
用于受精过程，其启动子区的 DNA去甲基化与 AID基因的表达有关，胚胎基因组激活后 AID基因的表达可能与胚胎发育有关。
关键词 ： AID基因；牛体外受精胚胎；DNA甲基化
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.034
Expression of AID and Dynamic Changes of Its DNA Methylation in
Regulation Region During Bovine Early Embryonic Development
AO Xu-dong SA Ru-la WANG Jie WANG Hui-min YU Hai-quan
（Research Center for Laboratory Animal Science，Inner Mongolia University，Hohhot 010021）
Abstract: DNA methylation plays an important role in mammalian fertilization. The chromosome has undergone complex reconstruction
and ultimately obtained totipotent during fertilization. Using activation-induced cytidine deaminase protein（AID，also known as AICDA with
DNA active demethylation function，as research target，the expression changes of AID and its regulation mechanisms at different development
stages of oocyte and in-vitro fertilization（IVF）embryo were detected for exploring the cell reprogramming mechanism. Real-time PCR，BSP
（Bisulfite Sequencing PCR），and immunofluorescence chemistry were used to analyze the effects of DNA methylation on the AID expression
during bovine early embryonic development. The results showed that AID gene was regulated by DNA methylation in the bovine early embryonic
development. Combining the expression of AID gene in the different tissues and DNA methylation status of its promoter region，the tissue-
dependent and differentially methylated region（T-DMR）of AID gene was located at the transcriptional start site -88 bp--431 bp. During the
maturing process of bovine oocyte，No. 2 and 3 CpG sites in the T-DMR region were obviously demethylated，whereas the other sites were
not changed，and AID gene was correlated with the DNA methylation. At the different stages of early IVF embryo，though the expression
of AID gene varied，only No. 2 and 3 CpG sites in the T-DMR region of AID were in the status of demethylation，while other sites were in
2016,32(7) 243奥旭东等：牛早期胚胎发育中 AID基因的表达及其调节区 DNA甲基化的动态变化
哺乳动物染色体构象在受精过程中发生剧烈变
化。高度凝缩的精子染色质在卵母细胞中解凝缩，
与卵母细胞染色质融合，形成合子基因组，并激活
其转录，最终获得发育的全能性［1，2］。在植入前胚
胎的发育过程中，基因组经整体范围内 DNA 去甲基
化，父本基因组迅速主动的去甲基化，母本基因组
则被动去甲基化，随后，在母型合子转变期重新被
甲基化［3］。父本基因组的迅速去甲基化过程涉及到
DNA 的主动去甲基化机制［4］。虽然已报道了很多哺
乳动物中的 DNA 主动去甲基化现象，但是还没有明
确是什么物质具有 DNA 去甲基化的作用［5-7］。并且
关于 DNA 主动去甲基化的机制也并不清楚［7-18］。
AID 是一种胞苷脱氨酶，它能介导 5mC 脱氨基
成为 T，从而发生碱基对的错配，这样产生的错配
可以被碱基切除修复（BER）机制所识别［19］。早期
的研究主要集中于其在 B 淋巴细胞中产生抗体多样
性的作用［19-22］。最近，在斑马鱼中发现同时过表
达 AID 和 MBD4 可以降低其基因组 DNA 甲基化程
度［23］。小鼠中的研究表明 AID 基因主要表达于多能
性的组织［24］，其蛋白与成纤维细胞中沉默的甲基化
的 OCT4 和 NANOG 启动子结合，而不与去甲基化的
启动子结合［25］。并且 AID 基因缺陷小鼠的原始生殖
细胞（PGC）的基因组整体范围内的 DNA 甲基化程
度比正常小鼠要高 2-3 倍［26］。这些研究都证明 AID
蛋白在高等哺乳动物中具有 DNA 去甲基化的作用，
并成为了新的研究热点。
牛 AID 基 因 位 于 5 号 染 色 体， 全 长 4 329 bp
（ENSBTAG00000018849）， 有 4 个 外 显 子，mRNA
全长 597 bp（ENSBTAT00000025096），编码 198 个
氨基酸的蛋白。目前关于 AID 基因的研究都局限于
斑马鱼［23］、小鼠［24-26］等模式动物中，而在牛上的
研究只是检测了其在 GV 期和 MII 期卵母细胞的表
达而没有对其功能作进一步的讨论［27］。并且在研究
的时间段上，目前研究都局限于原始生殖细胞发生
和受精后较短的时间，还未见哺乳动物早期胚胎发
育过程中 AID 蛋白作用的研究报道。本研究首先通
过分析 AID 基因在牛组织中的表达和其启动子区的
DNA 甲基化状态确定 AID 基因的 T-DMR，然后利用
体外受精技术分析在不同发育阶段（卵母细胞和胚
胎）AID 基因的表达变化及其调节方式，以期揭示
胚胎细胞重编程分子机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料 取成年牛的新鲜心脏、肾脏、肝脏、
睾丸组织，切成 1 cm3 的小块，在灭菌的生理盐水
中冲洗三遍，投入液氮中，长期保存在 -80℃冰箱中。
1.1.2 主要试剂 基因组 DNA 提取试剂盒、T 载
体购自 Promega ；RNAiso Reagent、AMV 反转录酶、
dNTP、RNase Inhibitor、Random Primer（9 mer）、无
酶水（DEPC H2O）和凝胶回收试剂盒购自大连宝生
物有限公司 ；除特别提到的化学试剂，其余均购自
Sigma 公司。
1.2 方法
1.2.1 成年牛组织中 AID 基因的表达分析 根据
Enseml 网站中公布的牛 AID mRNA 序列（ENSBTAT-
00000025096），设计 Real-time PCR 引物。正向引物：
5-CGGCTGGAGGAGCAAAAGACCGAAAG-3 ；反 向
引物 ：5-GAGCCACGTCCCTGTCGTCGTCTTC-3，产
物长度 192 bp。阳性对照 GAPDH 使用 Leutenegger
等［28］设计的引物。按照宝生物 RNAiso Reagent 试
剂的说明提取牛心脏、肾脏、肝脏和睾丸组织的总
methylation continuously，the changes of the expression probably was related to the embryonic genome activation. The above results revealed
that low methylation of T-DMR in AID gene was correlated with its expression. Immunofluorescence detection discovered that AID proteins
were uniformly distributed in the nucleus and cytoplasm from the oocyte maturation stage to morula stage. And a large number of AID protein
concentrated in the inner cell mass at the blastocyst stage，which played the important role in the maintenance of pluripotency of the inner cell
mass. In summary，accumulated AID during oocyte maturation presents an effect on fertilization，the DNA methylation in the promoter region
is closely related to its expression，and the expression of AID gene，after activation of the embryonic genome，may be associated with embryo
development.
Key words: AID gene ；bovine in vitro fertilization ；DNA methylation
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.7244
RNA 并 反 转 录 为 cDNA， 使 用 ABI 7300 Real-time
PCR 仪进行 Real-time PCR，反应条件如下：95℃ 30 s，
98℃ 5 s，60℃ 31 s，共检测 40 个循环。Real-time
PCR 结果通过 2-ΔΔCT 方法分析得出。AID 基因的表
达量使用 GAPDH 的表达量进行归一化处理。
1.2.2 AID 基 因 的 DNA 序 列 甲 基 化 分 析 使 用
Promega DNA 提取试剂盒提取成年牛心脏、肾脏、
肝脏和睾丸组织的基因组 DNA。分别取 5 μg DNA，
经 Xba I 酶切 11 h 后提纯。加入 10 mol/L 的 NaOH
至终浓度为 0.3 mol/L，37℃变性 15 min。加入终浓
度为 10 mmol/L 氢醌和 2.5 mol/L 的 NaHSO3（pH5.0），
55℃避光 20 h。加入 10 mol/L NaOH 至终浓度为 0.3
mol/L，37℃脱硫 15 min。使用 3 mol/L 醋酸铵沉淀
DNA，20 μL TE（pH8.0）回溶。按以下反应条件进
行 3 次 PCR ：94℃ 4 min ；94℃ 1 min，58℃ 30 s，
72℃ 1 min ；72℃ 10 min，共 30 个循环。扩增产物
与 T 载体连接，转化挑选克隆。每组实验至少挑选
10 个克隆送大连宝生物公司测序。
表 1 牛 AID 基因甲基化 PCR 引物序列
引物名称 序列（5-3） PCR 产物
AID BSP 1 正向引物 ：TTTTGGTGGTTTAGTGGTGAAGAAT
465 bp
反向引物 ：CCTTCTTAACTTTCCATCAACTTTT
AID BSP 2 正向引物 ：TAGAGGATTTTTTTAATTTAGGGAT
208 bp反向引物 ： ATATAAAAAATATTTAACCATTCT-
CAACTT
1.2.3 卵母细胞、体外受精胚胎的获得 牛卵巢取
自于当地屠宰场，用 18 # 注射器抽取卵巢表面的 3-8
mm 的卵泡。挑选颗粒细胞包裹较完整的卵母细胞，
用 M199+10% FBS（HyClone）+0.02 IU/mL FSH+1
IU/mL LH+0.01 μg/mL E2 和 0.06 mg/mL penicillin &
0.05 mg/mL streptomycin 在 5% CO2，100% 湿 度，
38.5℃培养 18-24 h 后成熟。37℃水浴中解冻公牛冷
冻精液，受精 A 液（BO 液 +10 mmol/L Caffeine）离
心洗涤（3 000 r/min）两次。离心后，静置 2 min，
待精子上浮后小心吸取，加入等体积的受精 B 液
（BO 液 +3 mg/mL BSA+8 μL/mL 肝素）制成精子悬浮
液。将精子悬浮液做成 100 μL 受精小滴，每滴放入
30-40 枚成熟卵母细胞进行体外受精。7 h 后，将去
除卵丘的受精卵转入发育培养液（CRI）中。分别
收集 GV 期、MII 期卵母细胞、2-、4-、8-细胞胚胎、
桑椹胚和囊胚保存于液氮中。
1.2.4 免疫荧光染色和激光共聚焦检测 PBS（-）
＋ 2% BSA 清洗收集到的卵母细胞、受精卵和体外
受精胚胎。4% 多聚甲醛室温固定 30 min，1% Triton
X-100 通透 1 h。10% 山羊血清＋ 2% BSA 的 PBS（-）
室温封闭 1 h。然后用 PBS（-）＋ 2% BSA 按 1∶100
稀释 AID 蛋白一抗（Upstate）4℃孵育过夜。PBS（-）
＋ 2% BSA 清洗 3 遍后，用 1∶500 的 FITC 标记二
抗（Sigma）避光染色 2 h。10 μg/mL DAPI 染细胞核，
PBS（-）＋ 2% BSA 清洗 3 遍后，使用 Nikon 激光
共聚焦显微镜进行检测。所有试验，Nikon 激光共聚
焦显微镜都使用相同的设置。
1.2.5 统计方法 本研究所有数据重复 3 次以上。
所有试验数据都使用 SPSS 14.0 软件进行统计分析。
Real-time PCR 试验结果使用单因素分析，DNA 甲基
化状态使用卡方检验。P<0.05 确定为差异的显著性。
2 结果
2.1 AID基因在成年牛组织中的表达变化
如图 1 所示，AID 基因在心脏、肾脏、肝脏和
睾丸 4 种组织中均有表达，表达量都较低。其表达
水平在不同组织之间呈现不同的状态，其中心脏和
肝脏较低，肾脏水平稍高，睾丸组织表达量最高，
并明显高于其他 3 种组织（P<0.05）。
80
60
40
20
0
A
ID
สഐ⴨ሩ㺘䗮䟿/10-5
H T L K
aaa
b
H ：心脏 ；T ：睾丸 ；L ：肝脏 ；K ：肾脏。不同字母代表显著性差异（P< 0.05）
图 1 AID 基因在牛不同组织的表达变化
2.2 AID基因启动子区甲基化在成年牛组织的变化
AID 基因的转录起始位点以上 3 600 bp 的区域
内共有 24 个 CpG 位点，没有 CpG 岛。根据其序列
2016,32(7) 245奥旭东等：牛早期胚胎发育中 AID基因的表达及其调节区 DNA甲基化的动态变化
设计两段 BSP 引物，分别位于 AID 基因的 -88 bp--
431 bp 和 -1416 bp--1548 bp， 共 包 含 11 个 CpG 位
点，其中 -1416 bp--1548 bp 包含有 4 个 CpG 位点，-
88 bp--431 bp 包含有 7 个 CpG 位点。分别提取心脏、
肝脏、肾脏和睾丸组织的基因组 DNA，并经亚硫酸
氢盐处理后，使用引物 AID BSP 1 和 AID BSP 2 分别
进行 PCR 反应，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后照相
观察。结果显示，引物 AID BSP 1 的 PCR 产物大小
与预期片段大小一致（图 2）；AID BSP 2 的 PCR 产
物大小也与预期片段大小一致（图 3）。
4-C）。在 -1416 bp--1548 bp 这一区段心脏为 65.0%，
睾丸为 80.0%，肝脏为 57.5%，肾脏为 65.0%，各组
织之间也无明显差异（图 4-B）。综合分析 AID 基因
在不同组织中的表达量和其在各个区段上的 DNA 甲
基化程度发现，-88 bp--431 bp 这一区段的 DNA 甲
基化与牛 AID 基因的组织特异性表达呈明显的负相
关。基于其在 AID 基因的表达的重要调节作用，可
以确定这一区段就是 AID 基因的 T-DMR。
为了更好地分析 AID 基因 T-DMR 对 AID 基因
表达的影响，本研究单独分析了 AID 基因 T-DMR 的
每一个 CpG 位点的 DNA 甲基化状态。结果（图 5）
显示，睾丸组织 AID 基因 T-DMR 中 7 个 CpG 位点
都发生了一定的 DNA 去甲基化，而其他 3 种组织却
只是在一些个别位点发生了 DNA 去甲基化。
2.3 牛早期胚胎发育过程中AID基因的甲基化状态
的动态变化
本研究通过 Real-time PCR 的方法分别检测了
GV 期 卵 母 细 胞、MII 期 卵 母 细 胞、2-cell、4-cell、
8-cell、桑椹胚和囊胚中 AID 基因的表达。结果（图 6）
显示，卵母细胞成熟过程中 AID 基因在逐渐的积累，
到 MII 期卵母细胞达到顶峰。随着精子入卵，受精
卵开始细胞分裂，AID 基因的表达量急剧下降，直
到 8-cell 时期也即母型合子转变时期 AID 基因的表
达量开始逐渐升高，直到囊胚期。
为了确定 AID 在牛早期胚胎发育过程中的作用，
本研究使用 AID 蛋白的特异性抗体，利用免疫荧光
细胞化学的方法，检测了牛卵母细胞体外成熟和早
期胚胎发育过程中 AID 蛋白的动态变化。结果（图
7）显示，从卵母细胞成熟到早期胚胎发育过程中的
2-cell 和 4-cell 阶段，AID 蛋白的含量是逐渐降低的。
从 8-cell 开始即母型合子转变时期，AID 蛋白的表
达量开始逐步上升。从卵母细胞成熟期到桑椹胚期，
AID 蛋白都是均匀分布于细胞核和细胞质中 ；而到
了囊胚期大量的 AID 蛋白集中于内细胞团。
随后本研究检测了 AID 基因 T-DMR 在卵母细胞
成熟和早期胚胎发育过程中 DNA 甲基化状态。结果
（图 8）表明，GV 期卵母细胞中 AID 基因 T-DMR 甲
基化比率为 82.86%，而在 MII 期及随后的早期胚胎
发育过程中 DNA 甲基化都未发生变化。
M M
bp
600
500
400
1 2 3 4 5
M bp
300
200
100
400
1 2 3 4
M ：100 bp DNA Marker ；1 ：0.2 μmol/L Mg2+ 条件下 PCR 结果 ；2 ：0.4 μmol/L
Mg2+ 条件下 PCR 结果 ；3 ：0.6 μmol/L Mg2+ 条件下 PCR 结果 ；4 ：0.8 μmol/L
Mg2+ 条件下 PCR 结果 ；5 ：1 μmol/L Mg2+ 条件下 PCR 结果
图 2 牛 AID BSP 1 甲基化 PCR 结果
1 ：0.4 μmol/L Mg2+ 条件下 PCR 结果 ；2 ：0.8 μmol/L Mg2+ 条件下 PCR 结果 ；3 ：
1.2 μmol/L Mg2+ 条件下 PCR 结果 ；4 ：1.6 μmol/L Mg2+ 条件下 PCR 结果 ；M ：
100 bp DNA Marker
图 3 牛 AID BSP 2 甲基化 PCR 电泳结果
比较测序结果与原始序列后，发现 AID 基因 5
调控区的 11 个 CpG 位点在 4 种组织中都具有较高
的甲基化程度。心脏、睾丸、肝脏、肾脏的 DNA
甲 基 化 比 率 分 别 为 81.82%、78.18%、79.09% 和
78.18%（图 4-A），且各组织之间没有明显的差异
（P>0.05）。单独分析 -88 bp--431 bp 这一区段发现其
甲基化比率分别为心脏 90.0%，睾丸 77.1%，肝脏
91.4% 和肾脏 87.1%，各组织之间没有明显的差异（图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.7246
3 讨论
DNA 甲基化是主要的调节基因表达的表观遗
传修饰方式之一［2］。基因启动子区的 DNA 被甲基
化后可以抑制基因的转录。例如，多能性转录因子
c-Myc 的识别靶序列 CACGTG 被甲基化后，FoxA1
蛋白就不与其启动子结合转而结合于基因远端调控
序列［29］，最终导致 c-Myc 基因转录的失活。哺乳动
物基因组存在大量的 T-DMR，T-DMR 包含有单个细
胞或特定组织类型的 DNA 甲基化信息，决定基因的
组织特异性和阶段特异性表达［30，31］。
在成年牛的不同组织中，T-DMR 区的 DNA 都
存在相当高的甲基化水平。但是每一种组织中都有
其自己的甲基化模式从而调节其基因的表达，总体
上遵循一般的规律，即 DNA 甲基化程度高的基因表
A
-1548 -1416 -431 -88
ATG
B
C
H
T
L
K
78.18%
79.09%
78.18%
H T L K
81.82% ⭢สॆCpGս⛩∄⦷ 1.21.00.80.60.4
0.2
0
H T L K
⭢สॆCpGս⛩∄⦷ 1.21.00.80.60.4
0.2
0
H ：心脏 ；T ：睾丸 ；L ：肝脏 ；K ：肾脏 ；（A）牛心脏、睾丸、肝脏、肾脏中 AID 基因启动子区亚硫酸氢盐 PCR 测序结果。●代表
甲基化 CpG ；○代表未甲基化 CpG。（B）AID 基因启动子区 -1416 bp--1548 bp 区段的 DNA 甲基化水平。（C）AID 基因启动子区 -88
bp--431 bp 区段的 DNA 甲基化水平
图 4 牛心脏、睾丸、肝脏、肾脏中 AID 基因 DNA 甲基化水平的变化
2016,32(7) 247奥旭东等：牛早期胚胎发育中 AID基因的表达及其调节区 DNA甲基化的动态变化
达量就低，相反甲基化程度低的基因表达量高［32］。
研究结果表明 AID 基因在心脏、肾脏、肝脏、睾丸
4 种组织中均有表达但是其转录水平不同。睾丸组
织明显高于其他 3 种组织。分析 4 种组织 DNA 甲
基 化 水 平， 在 -88 bp--431 bp 睾 丸 的 DNA 甲 基 化
程度较其他 3 种组织低。因此推断其为 AID 基因的
T-DMR，而 T-DMR 的 DNA 甲基化水平与其表达有
密切的联系。同时本研究发现 AID 基因在心脏、肝
脏和肾脏中虽然都有少数的个别 CpG 位点发生了
DNA 去甲基化，但其组织中 AID 基因的表达没有
明显升高，可以推断 AID 基因的表达的调控是由于
AID 基因 T-DMR 区的所有 CpG 位点的 DNA 甲基化
状态共同作用的结果，而并非由于某个单独的 CpG
位点的甲基化所决定。DNA 甲基化可能是通过改变
了染色质的构象［33，34］，进而影响转录因子与基因启
动子区的结合［35］。AID 基因这 4 种组织中的甲基化
模式不具有显著性差异，但是其表达水平却存在差
异，这就说明在体内还有其它机制共同作用于 AID
的表达。其相关机制和相互关系有待于进一步研究。
哺乳动物受精后首先发生整体的去甲基化过
程，发育相关基因的表达也在特定时间被开关，这
种整体的去甲基化状态与母型合子转变中胚胎基因
组的激活有关，整体的去甲基化状态发生和持续的
时间因动物种类不同而异。体细胞核移植胚也出现
同样过程［36］。本研究确定了 AID 基因的 T-DMR（-88
bp--431 bp），这一段 DNA 的甲基化和其表达水平
成紧密相关。在卵母细胞成熟过程中，T-DMR 区的
第 2 和第 3 号 CpG 位点的 DNA 甲基化发生了一个
明显的去除过程，而其他位点都未发生变化。卵母
细胞在成熟过程中 AID 基因的积累就与这样的 DNA
甲基化状态的变化相关。而在早期胚胎发育过程中，
AID 基因的 T-DMR 区除了第 2 和第 3 号 CpG 位点
的 DNA 甲基化一直都维持去甲基化状态其他位点都
是甲基化的状态。相关研究证实，受精后几小时内，
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
⭢สॆCpGս⛩∄⦷
H T L K
1ਧս⛩
2ਧս⛩
3ਧս⛩
4ਧս⛩
5ਧս⛩
6ਧս⛩
7ਧս⛩
H ：心脏 ；T ：睾丸 ；L ：肝脏 ；K ：肾脏
图 5 AID 基因 T-DMR 单个 CpG 位点甲基化情况分析
80
60
40
20
0
AI
D
สഐ⴨ሩ㺘䗮䟿
GV
a
c
b
a
d
c
d
MII 2-cell 4-cell 8-cell morula blastula
GV ：GV 期卵母细胞 ；MII ：MII 期卵母细胞 ；2 cell ：2-细胞 ；4-cell ：4-细胞 ；
8 cell ：8-细胞 ；morula ：桑椹胚 ；blastula ：囊胚。不同字母代表显著性差异
（P<0.05）
图 6 AID 基因在牛卵母细胞和不同发育阶段胚胎中的表达
DNA
A A’ E E’
B B’ F F’
C C’ G G’
D D’
AID DNA AID
A，A ：GV 期卵母细胞 ；B，B ：MII 期卵母细胞 ；C，C ：2-细胞 ；D，D ：
4-细胞 ；E，E ：8-细胞 ；F，F ：桑椹胚 ；G，G ：囊胚。DAPI 复染 DNA，
标尺所示 50 μm
图 7 AID 在不同发育阶段牛卵母细胞和胚胎中的动态变化
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.7248
鱼精蛋白被组蛋白替换，父源染色质去凝缩，DNA
发生去甲基化［37，38］。在短时间内，父源染色质利
用卵母细胞在成熟过程积累的物质发生 DNA 去甲基
化［27］。AID 基因表达也具有类似的变化规律，提示
AID 对于父源染色质 DNA 的主动去甲基化具有一定
的作用。在受精后，AID 基因的表达持续下降直到
8-cell 时期表达量才开始上升，这可能是与母型合子
转变中胚胎基因组的激活有关，也说明了 AID 对于
胚胎发育及其干细胞多能性的维持具有重要的作用。
在牛早期胚胎发育过程中，虽然 AID 基因 DNA 甲基
化都未发生变化，但是其基因表达却有明显的改变，
这就提示 AID 基因在这一过程中的阶段特异性表达
可能是受到其他表观遗传方面或是转录后的调控。
通过免疫荧光检测发现，从卵母细胞成熟期到桑椹
胚期，AID 蛋白都是均匀分布于细胞核和细胞质中。
而囊胚时期大量的 AID 蛋白集中于内细胞团，这可
能对于内细胞团多能性的维持起重要作用。
4 结论
卵母细胞成熟中积累的 AID 作用于受精过程，
其启动子区的 DNA 去甲基化与 AID 基因的表达有关。
胚胎基因组激活后 AID 基因的表达可能与胚胎发育
有关。
参 考 文 献
［1］Tamada H, Thuan NV, Reed P, et al. Chromatin decondensation and
nuclear reprogramming by nucleoplasmin［J］. Mol Cell Biol, 2006,
26 ：1259-1271.
［2］Li E. Chromatin modification and epigenetic reprogramming in
mammalian development［J］. Nature Reviews Genetics, 2002, 3 ：
662-673.
［3］Kass SU, Pruss D, Wolffe AP. How does DNA methylation repress
transcription?［J］. Trends in Genetics, 1997, 13 ：444-449.
［4］Reik W, Dean W, Walter Jr. Epigenetic reprogramming in
mammalian development［J］. Science, 2001, 293 ：1089-1093.
［5］Jones PA, Liang G. Rethinking how DNA methylation patterns are
maintained［J］. Nature Reviews Genetics, 2009, 10 ：805-811.
［6］ Zhu JK. Active DNA demethylation mediated by DNA glycosylases
［J］. Annu Rev Genet, 2009, 43 ：143-166.
［7］Cortellino S, Xu J, Sannai M, et al. Thymine DNA glycosylase is
essential for active DNA demethylation by linked deamination-base
excision repair［J］. Cell, 2011, 146 ：67-79.
［8］Ito S, D’Alessio AC, Taranova OV, et al. Role of Tet proteins in
5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass
specification［J］. Nature, 2010, 466 ：1129-1133.
［9］Wossidlo M, Arand J, Sebastiano V, et al. Dynamic link of
DNA demethylation, DNA strand breaks and repair in mouse
zygotes［J］. The EMBO Journal, 2010, 29 ：1877-1888.
［10］Okada Y, Yamagata K, Hong K, et al. A role for the elongator
complex in zygotic paternal genome demethylation［J］. Nature,
2010, 463 ：554-558.
［11］Chen T, Li E. Structure and function of eukaryotic DNA
methyltransferases［J］. Current Topics in Developmental Biology,
2004, 60 ：55-89.
［12］Schmitz KM, Schmitt N, Hoffmann-Rohrer U, et al. TAF12 recruits
Gadd45a and the nucleotide excision repair complex to the promoter
of rRNA genes leading to active DNA demethylation［J］.
Molecular Cell, 2009, 33 ：344-353.
［13］Wu SC, Zhang Y. Active DNA demethylation ：many roads lead to
Rome［J］. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2010, 11 ：
607-620.
GV MII 2-cell 4-cell 8-cell morula blastula
82.86% 71.43% 71.43% 71.43% 71.43% 71.43% 71.43%
GV ：GV 期卵母细胞 ；MII ：MII 期卵母细胞 ；2 cell ：2-细胞 ；4 cell ：4-细胞 ；8 cell ：8-细胞 ；morula ：桑椹胚 ；blastula ：囊胚。
●代表甲基化 CpG ；○代表未甲基化 CpG
图 8 牛卵母细胞成熟和早期胚胎发育过程中 AID 基因 DNA 甲基化水平的变化
2016,32(7) 249奥旭东等：牛早期胚胎发育中 AID基因的表达及其调节区 DNA甲基化的动态变化
［14］Cannon SV, Cummings A, Teebor GW. 5-Hydroxymethylcytosine
DNA glycosylase activity in mammalian tissue［J］. Biochem
Biophys Res Commun, 1988, 151 ：1173-1179.
［15］Kantarjian H, Oki Y, Garcia-Manero G, et al. Results of a
randomized study of 3 schedules of low-dose decitabine in higher-
risk myelodysplastic syndrome and chronic myelomonocytic
leukemia［J］. Blood, 2007, 109 ：52-57.
［16］Yang AS, Doshi KD, Choi SW, et al. DNA methylation changes after
5-aza-2’-deoxycytidine therapy in patients with leukemia［J］.
Cancer Res, 2006, 66 ：5495-5503.
［17］Mund C, Hackanson B, Stresemann C, et al. Characterization of
DNA demethylation effects induced by 5-Aza-2’-deoxycytidine in
patients with myelodysplastic syndrome［J］. Cancer Res, 2005,
65 ：7086-7090.
［18］Issa JPJ, Kantarjian HM, Kirkpatrick P. Azacitidine［J］. Nature
Reviews Drug Discovery, 2005, 4 ：275-276.
［19］Conticello SG, Langlois MA, Yang Z, et al. DNA deamination in
immunity ：AID in the context of its APOBEC relatives［J］.
Advances in Immunology, 2007, 94 ：37-73.
［20］Maul RW, et al. Chapter six-AID and somatic hypermutation［J］.
Advances in Immunology, 2010, 105 ：159-191.
［21］Muramatsu M, Kinoshita K, Fagarasan S, et al. Class switch
recombination and hypermutation require activation-induced
cyt id ine deaminase（AID）, a potent ia l RNA edi t ing
enzyme［J］. Cell, 2000, 102 ：553-563.
［22］Liu M, Schatz DG. Balancing AID and DNA repair during somatic
hypermutation［J］. Trends in Immunology, 2009, 30 ：173-181.
［23］Rai K, Huggins IJ, James SR, et al. DNA demethylation in
zebrafish involves the coupling of a deaminase, a glycosylase, and
Gadd45［J］. Cell, 2008, 135 ：1201-1212.
［24］Morgan H, Dean W, Coker H, et al. Activation-induced cytidine
deaminase deaminates 5-methylcytosine in DNA and is expressed
in pluripotent tissues［J］. Biological Chemistry, 2004, 279 ：
52353-5260.
［25］Bhutani N, Brady JJ, Damian M, et al. Reprogramming towards
pluripotency requires AID-dependent DNA demethylation［J］.
Nature, 2010, 463 ：1042-1047.
［26］Popp C, Dean W, Feng S, et al. Genome-wide erasure of DNA
methylation in mouse primordial germ cells is affected by AID
deficiency［J］. Nature, 2010, 463 ：1101-1105.
［27］Pagé-Larivière F, Sirard MA. Spatiotemporal expression of DNA
demethylation enzymes and histone demethylases in bovine
embryos［J］. Cellular Reprogramming, 2014, 16 ：40-53.
［28］Leutenegger CM, Alluwaimi AM, Smith WL, et al. Quantitation
of bovine cytokine mRNA in milk cells of healthy cattle by real-
time TaqMan polymerase chain reaction［J］. Vet Immunol
Immunopathol, 2000, 77 ：275-287.
［29］Lupien M, Eeckhoute J, Meyer CA, et al. FoxA1 translates
epigenetic signatures into enhancer-driven lineage-specific
transcription［J］. Cell, 2008, 132 ：958-970.
［30］Shiota K, Kogo Y, Ohgane J, et al. Epigenetic marks by DNA
methylation specific to stem, germ and somatic cells in mice［J］.
Genes to Cells, 2002, 7 ：961-969.
［31］Wan J, Oliver VF, Zhu H, et al. Integrative analysis of tissue-
specific methylation and alternative splicing identifies conserved
transcription factor binding motifs［J］. Nucleic Acids Res, 2013,
41 ：8503-8514.
［32］Siegfried Z, Cedar H. DNA methylation ：A molecular lock［J］.
Current Biology, 1997, 7 ：305-307.
［33］Weinberg MS, Villeneuve LM, Ehsani A, et al. The antisense
strand of small interfering RNAs directs histone methylation and
transcriptional gene silencing in human cells［J］. RNA, 2006,
12 ：256-262.
［34］Santoro R, Grummt I. Epigenetic mechanism of rRNA gene
silencing ：temporal order of NoRC-mediated histone modification,
chromatin remodeling, and DNA methylation［J］. Mol Cell Biol,
2005, 25 ：2539-2546.
［35］Lehnertz B, Ueda Y, Alwin AHA. Derijck, et al. Suv39h-mediated
histone H3 lysine 9 methylation directs DNA methylation to major
satellite repeats at pericentric heterochromatin［J］. Curr Biol,
2003, 13 ：1192-1200.
［36］Papp B, Plath K. Epigenetics of reprogramming to induced
pluripotency［J］. Cell, 2013, 152 ：1324-1343.
［37］McLay DW, et al. Remodelling the paternal chromatin at fertilizati-
on in mammals［J］. Reproduction, 2003, 125 ：625-633.
［38］Rivera RM, Ross JW. Epigenetics in fer t i l izat ion and
preimplantation embryo development［J］. Prog Biophys Mol Biol,
2013, 113 ：423-432.
（责任编辑 马鑫）