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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(3):105-108
miRNA 表达分析和功能探索在转基因生物领域
中已成为热点问题。microRNA（miRNA）是一类内
源性的 21-25 nt 大小的单链非编码小分子 RNA，在
生物体内广泛存在，能够在转录后水平调控基因的
表达，与机体的生长、发育、繁殖、疾病等活动相
关［1］。miRNA 在不改变基因结构的基础上影响基因
的表达，成为表观遗传学的重要组成部分。目前对
于 miRNA 在生殖发育中的研究已逐步展开，包括
对 miRNA 高通量分析，特异性的组织或细胞中特
定 miRNA 的表达、调控靶基因和功能研究［2］。fat-1
基 因 来 源 于 秀 丽 线 虫（Caenorhabditis elegans，C.
elegans），又名 ω-3 多聚不饱和脂肪酸脱氢酶基因。
其产物 ω-3 多聚不饱和脂肪酸脱氢酶以 ω-6 多聚
不饱和脂肪酸（Omega-6 polyunsaturated fatty acids，
收稿日期 ：2015-06-12
基金项目 ：国家基础研究计划（2012CB722306）；国家级大学生创新训练计划项目（201410126034）
作者简介 ：吕洋，男，博士研究生，研究方向 ：哺乳动物生殖生物学 ；E-mail ：lvyang678762006@163.com
通讯作者 ：李光鹏，男，教授，研究方向 ：哺乳动物生殖生物学、胚胎生物技术 ；E-mail ：gpengli@imu.edu.cn
microRNA-483 和 microRNA-486 在克隆和转 fat-1
基因牛组织中的表达
吕洋1  王煜1，2  孙佳佳1  弓春玲1  李光鹏1
（1. 内蒙古大学实验动物研究中心，呼和浩特 010070 ；2. 内蒙古医科大学附属医院，呼和浩特 010050）
摘 要 ： 利用荧光定量 PCR 比较正常受精牛、克隆牛和转基因牛的心、肝、脾、肺、肾、胎盘、子叶、子宫内膜中 miR-
483 和 miR-486 的表达水平。结果显示，miR-483 和 miR-486 在正常受精牛、克隆牛和转 fat-1 基因牛的组织中均有表达，其中在心
脏中表达量显著高于其他组织。而转 fat-1 基因牛心脏中 miR-483 和 miR-486 表达量均低于正常牛。miR-483 和 miR-486 在不同组
织中表达量存在一定差异，在心脏中呈现高表达，提示 miR-483 和 miR-486 表达降低可能与心肌肥大、心肌梗死等病理生理过程有关。
关键词 ： miR-483 ；miR-486 ；转基因牛 ；心脏
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.017
Expression of microRNA-483 and microRNA-486 in the Cloned and
fat-1-transgenic Bovine
LÜ Yang1 WANG Yu1，2 SUN Jia-jia1 GONG Chun-ling1 LI Guang-peng1
（1. Research Center for Laboratory Animal Science，Inner Mongolia University，Hohhot 010070 ；2. The Affiliated Hospital，
Inner Mongolia University，Hohhot 010050）
Abstract: The expression levels of microRNA-483 and microRNA-486 in heart，liver，spleen，lung，kidney，placenta，
cotyledons，endometrium from normal，cloned，and transgenic bovine were measured by real time quantitative PCR. The results showed that
microRNA-483 and microRNA-486 were expressed in all tissues of normal，cloned and fat-1-transgenic bovine ；significantly higher in the
heart than other tissues. However，the expression levels of microRNA-483 and microRNA-486 in transgenic bovine were lower than normal one.
Further，the expressions of microRNA-483 and microRNA-486 varied in different tissues and high in the heart，indicating that the expressions
of microRNA-483 and microRNA-486 may be correlated with pathophysiological process of myocardial hypertrophy and myocardial infarction.
Key words: microRNA-483 ；microRNA-486 ；transgenic bovine ；heart
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.3106
ω-6 PUFAs）为底物，将其脱氢转化为 ω-3 多聚不饱
和 脂 肪 酸（Omega-3 polyunsaturated fatty acids，ω-3
PUFAs）［3］，ω-3 PUFAs 作为重要生物活性物质，对
人体健康尤其在预防和治疗心脑血管、癌症等多种
疾病方面有着重要作用。增加膳食中 ω-3 PUFAs 的
含量，能够显著减少冠心病发病率与死亡率，并且
能延缓动脉粥样硬化进展［4］。本研究利用荧光定量
PCR 分析转 fat-1 鲁西黄牛、克隆牛和正常受精牛主
要器官组织中 miR-483 和 miR-486 的表达情况，旨
在探讨 miR-483 和 miR-486 可能的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
转 fat-1 基因鲁西黄牛的制备 ：构建 fat-1 基因
pST200 表达载体，转染牛胎儿成纤维细胞，G418
筛选后挑选转基因单克隆，核移植获得供体细胞，
得到转基因克隆胚胎，通过胚胎移植到代孕鲁西黄
牛体内，出生后经鉴定为转 fat-1 基因牛。采集 3 例
正常受精、2 例克隆、2 例转基因鲁西黄牛心脏、肝
脏、脾脏、肺脏、肾脏、胎盘、子叶、子宫内膜组织，
迅速放入液氮保存。动物实验经内蒙古大学动物实
验伦理委员会批准。
1.2 方法
1.2.1 各 组 织 总 RNA 的 提 取 将 组 织 从 -80℃ 取
出 后， 用 RNAiso for small RNA kit（TaKaRa） 提 取
组织 RNA，取 2 μL 在 1% 琼脂糖凝胶电泳上检测
总 RNA 的质量并利用 Nanodrop 测量浓度并测定总
RNA 的 A260/A280 的值在 1.8-2.1 之间。
1.2.2 合成 cDNA 利用 Primer 5.0 引物设计软件分
别根据 miRBase 提供的 miR-483 和 miR-486，以及
内参 U6 的序列设计 microRNA 定量引物（表 1），根
据 One Step PrimeScript® miRNA cDNA Synthesis Kit
（TaKaRa）反转录试剂盒说明书合成 cDNA。反应结
束后产物保存于 -20℃条件下备用。
表 1 microRNA 引物序列
引物名称 引物序列（5-3）
Bta-miR-483 CGTCACTCCTCTCCTCCCGTCTTAA
Bta-miR-486 TCCTGTACTGAGCTGCCCCGAG
U6 TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC
1.2.3 microRNA 实 时 荧 光 定 量 PCR 使 用 SYBR®
premix Ex TaqTM Ⅱ（TaKaRa）检测 miR-483 和 miR-
486 在牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胎盘、
子 叶 和 子 宫 内 膜 组 织 的 表 达 水 平， 美 国 Bio-Rad
7300 公司进行定量 PCR 反应参数为 ：95℃预变性
30 s；95℃ 5 s，60℃ 31 s 荧光检测 1 次，共 40 循环。
记录每个反应管中的荧光信号到达所设定的阈值时
所经历的循环数 Ct 值，反应结束后根据熔解曲线分
析产物特异度，每组均设 3 个复孔，分析 miR-483
和 miR-486 的相对表达量。
1.2.4 统计学分析 以 U6 作为内参，miRNA 的相
对表达水平的数值通过 2-ΔΔCt 法进行计算。运用统
计学软件 SPSS16.0 进行单因素方差分析。
2 结果
2.1 miR-483在正常受精、克隆、转基因鲁西黄牛
不同组织中的表达
miR-483 在心脏中表达量最高，约为在肺脏中
表达量的 10 倍，其次在肾脏中的表达量是肺脏中的
6 倍左右，在肺脏中的表达量最低（图 1）。
㛍㜿bta-miR-483⴨ሩ㺘䗮
䟿
㝮㜿 ᗳ㜿 㛮㜿㛪 㛾ⴈ ᆀਦ ᆀᇛ޵㟌
10
8
6
4
2
0
图 1 miR-483 在牛不同组织中的表达
2.2 miR-486在正常受精、克隆、转基因鲁西黄牛
不同组织中的表达
miR-486 在心脏中表达量最高，约为在肝脏中
表达量的 13 倍（P=0.021，具有显著差异）；其次在
肺脏中表达量是肝脏中表达量的 2 倍左右 ；在肝脏
和子叶中表达量最低（图 2）。
2.3 miR-483和miR-486在正常受精、克隆、转基
因鲁西黄牛心脏表达的比较
miR-483 和 miR-486 在克隆牛、转基因牛心脏
2016,32(3) 107吕洋等：microRNA-483 和 microRNA-486 在克隆和转 fat-1 基因牛组织中的表达
中的表达要低于正常受精牛的心脏（图 3）。 方法。miRNA 的表达具有时序性和空间特异性，王
家骥等［8］通过对靶基因进行调节从而实现对动物发
育的调控。随着研究的不断深入，人们逐渐认识到
miRNA 在进化过程中的保守性以及在生物进化和疾
病发展过程中起着重要的调控作用，通过抑制靶基
因的表达产生基因沉默的效应。
近年来研究发现，miRNA 参与调控心脏病理生
理过程，推测 miRNA 在心肌肥大、心肌梗死中扮
演重要角色［9-11］。目前，在生物体内已鉴定出超过
6 000 个 miRNA 分子，而在人类基因组中约 30% 的
基因受 miRNA 调控［12］，其在心脏、肝脏及脑等不
同组织中都具有特异性表达，有研究通过分析 6 个
心衰胎儿和 4 个正常胎儿心脏 microRNA 芯片［13］，
获 得 110 个 显 著 差 异 microRNA， 其 中 miR-483 和
miR-486 表达量显著下调，推测与胎儿心衰有关。
Sucharov 等［14］ 通过对 6 个非心衰、5 个缺血性扩
张型心脏病和 5 个特发性扩张型心脏病的病人的
microRNA 芯 片 分 析， 也 得 出 miR-483 和 miR-486
在非心衰病人组中表达量显著下调的结论，证明
microRNA 可能调控心肌疾病中关键性重编程重塑基
因的表达，参与到心肌疾病中。郝艳坤等［15］筛查
肥胖大鼠心脏 microRNA 的表达变化，寻找与肥胖诱
发心肌损伤及心律失常相关的 miRNA，发现在肥胖
模型组的 miRNA 表达谱中明显差异表达的 miRNA
共有 7 个，其中 miR-483 表达下调，提示 miRNA 可
能参与肥胖诱发心肌损伤和心律失常的调节作用。
Zhang 等［16］研究发现 miR-483 在怀孕和哺乳期喂养
母体高脂肪（HF）饮食的子代中表达显著降低。
miRNA 的差异表达及对基因的调控机制已成
为当前科学研究的热点之一。miRNA 可能参与调控
多个靶基因，而一个基因也可能受多个 miRNA 调
控。从 miRBase 数据库中预测出人源的 miR-483 定
位于胰岛素样生长因子 2（insulin-like growth factor
2，IGF2）的第 2 内含子［17］。Zhang 等［16］的研究结
果提示 miR-483 在喂养高脂肪饮食的小鼠后代中表
达量显著降低，同时伴随着 IGF2 mRNA 表达水平显
著提高，预示着 IGF2 可能是 miR-483 的靶基因。小
鼠胎儿体重可能受 IGF2 基因上的多态性的影响［18］，
低浓度 IGF2 可能涉及增重和肥胖［19］。
miR-486 在哺乳动物中是保守的，富集于心肌、
a
㛍㜿bta-miR-486⴨ሩ㺘
䗮䟿
㝮㜿 ᗳ㜿 㛮㜿㛪 㛾ⴈ ᆀਦ ᆀᇛ޵㟌
50
40
30
25
35
45
20
15
10
5
0
图 2 miR-486 在牛不同组织中的表达（a 代表 P<0.05）
a a
a
a a
bt
a-
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-4
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0.6
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0
bt
a-
m
iR
-4
86
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1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
A
B
图 3 miR-483（A）和 miR-486（B）在正常受精、克隆和
转基因鲁西黄牛心脏表达（a 代表 P<0.05）
3 讨论
ω-3 PUFAS 能提高心肌细胞的电稳定性，而心
肌细胞的电稳定性的提高能防治心率不齐［5］，对体
内 ω-6/ω-3 PUFAS 比值的改变和对体内脂代谢的调
节，能有效的降低血压、血脂［6］。武珅等［7］发现增
加 fat-1 基因在体内的表达是预防心血管硬化的有效
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骨骼肌和平滑肌中，肌肉生长抑制素（Myostatin）
是骨骼肌生长的负调控因子，可降低肌肉中蛋白合
成，Hitachi 等［20］在敲除 myostatin 小鼠后发现 miR-
486 表达水平显著提高，证实 miR-486 可能是连接
肌肉生长抑制素信号和调控骨骼肌通路中的调控分
子。Small 等［21］证明同源性磷酸酶 - 张力蛋白（PTEN）
可能是 miR-486 靶位点，PTEN 是磷酸肌醇 3 激酶 /
Akt 信号通路的负调控基因，后者是胰岛素受体下
游的主要通路，推测 miR-486 能在骨骼肌中调节胰
岛素依赖的葡萄糖摄取。本研究结果表明，miR-483
和 miR-486 在正常受精和转 fat-1 基因牛心脏中差异
表达，提示其表达变化可能与 fat-1 表达有关。
4 结论
通过检测 miR-483 和 miR-486 在正常受精、克
隆、转 fat-1 基因鲁西黄牛不同组织中的相对表达
水平，发现 miR-483 和 miR-486 在正常受精牛、克
隆牛和转 fat-1 基因牛的组织中均有表达，其中在心
脏中表达量显著高于其他组织。而转基因牛心脏中
miR-483 和 miR-486 表达量均低于正常受精牛。
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（责任编辑 马鑫）