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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(4):210-216
收稿日期 ： 2016-02-25
基金项目 ：江苏省六大人才高峰资助项目（swyy-030）
作者简介 ：夏岚，女，硕士研究生，研究方向 ：抗瘤大分子的活性研究 ；E-mail ：XLxialan@163.com
通讯作者 ：张旭，男，副教授，研究方向 ：抗瘤大分子的活性研究 ；E-mail ：zhangxthunder@sina.com
稳态和时间分辨荧光光谱法检测 pBR322 质粒中
十字形结构
夏岚1，2  张旭2，3
（1. 南京工业大学生物与制药工程学院，南京 211816 ；2. 盐城师范学院药学院，盐城 224051 ；3. 南京大学医学院，南京 210093）
摘 要 ： 在目的 DNA 不被酶切成不同片段的情况下，应用光谱方法探测 pBR322 质粒中十字形结构 DNA 的形成。吡咯脱氧
胞苷（Pyrrolo deoxycytidine，PdC）取代 dC 掺入到 pBR322 质粒的特定位点（3 195，3 222 或 3 281 位点）。应用稳态和时间分辨荧
光法研究十字形结构 DNA 的形成。结果显示 ：（1）稳态荧光特性表明，当 PdC 掺入到 pBR322 质粒的 3 222 位点，PdC-pBR322 超
螺旋荧光强度大约是松弛型 PdC-pBR322 的 4 倍 ；与此同时，其时间分辨荧光寿命大约比松弛型 PdC-pBR322 长约 0.3 ns。当 PdC
掺入到 3195 或 3281 位点时，稳态荧光光谱和荧光寿命（两位点处约 1.42 ns）并没有显著变化。（2）随着盐浓度的增大，荧光寿
命略微有变化，但不是很明显。通过检测和分析 pBR322 质粒的荧光光谱和荧光寿命，表明能够形成在非配对环状部分 3222 位点
含有 dC 的十字形结构。在一定的盐浓度（0-100 mmol/L）条件下，十字形结构能够保持其稳定性。
关键词 ： 十字形结构 ；pBR322 质粒 ；PdC ；稳态和时间分辨荧光光谱法
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.028
Steady-state and Time-resolved Fluorescence Spectroscopy to Detect
the Cruciform Structure in pBR322
XIA Lan1，2 ZHANG Xu2，3
（1. College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 211816 ；2. School of Pharmacy，
Yancheng Teachers University，Yancheng 224051 ；3. Medical School of Nanjing University，Nanjing 210093）
Abstract: The specific aim of this work is to probe the formation process of DNA with cruciform extrusion in a pBR322 plasmid using
spectroscopic methods while without digesting DNA into pieces. Pyrrolo deoxycitidine（PdC）was incorporated into pBR322 to substitute for
dC at specific sites of 3 195，3 222 or 3 281. Steady-state and time-resolved fluorescence were employed to examine the specific properties
of PdC in the cruciform region. Results were as followings ：1）Steady-state fluorescent properties indicated that the fluorescence intensity of
supercoiled PdC-pBR322 was about 4-fold stronger than that of relaxed PdC-pBR322，when PdC was incorporated into pBR322 at position
3 222 ；meanwhile，its time-resolved lifetime was about 0.3 ns longer than that of relaxed PdC-pBR3322. When PdC was incorporated at
position 3 195 or 3 281，there was no significant change in either steady-state fluorescence spectra or time-resolved lifetime（about 1.42 ns
at both positions）. 2）Lifetimes changed a little with the increasing of salt concentration，but not significantly. In conclusion，by analyzing
fluorescence spectra and lifetimes（both in relaxed state and supercoiled plasmid），a cruciform structure with dC at site 3 222 of impaired loop
is formed，and the cruciform is stable within this investigated salt concentration range（0-100 mmol/L）.
Key words: cruciform extrusion ；pBR322 plasmid ；PdC ；steady-state and time-resolved fluorescence spectroscopy
2016,32(4) 211夏岚等：稳态和时间分辨荧光光谱法检测 pBR322 质粒中十字形结构
在某些生理过程或生物技术如细菌的二分裂、
病毒的复制、目的基因与运载体的结合等过程中，
会发生 DNA 的复制、转录或翻译，或者 RNA 的复
制或逆转录过程，都遵循碱基的互补配对原则［1］。
然而，越来越多的证据表明 B 型 DNA 并不是 DNA
存在的唯一结构形式。基因调控区特殊形式的 DNA
（非双链结构 DNA）在转录调控中起着关键的作用。
例如，G-四链体是在转录调控区发现的一种特殊的
DNA 结构［2］。RNA 或者单链 DNA 片段通过自身回
折使互补的碱基配对能够形成发夹结构［3，4］。有研
究报道在超螺旋质粒 DNA 中能够形成另外一种特殊
的 DNA 结构形式，十字形结构，即具有反向重复序
列的 DNA 的单链碱基分别自我互补配对而形成的一
种二元对称结构［5，6］。生物体中很多遗传性疾病都
与机体内的 DNA 重复序列有关［7］。强直性肌营养
不良、脊髓小脑共济失调 3 型与发夹结构的形成密
切相关［8，9］。在基因调控区的某些结合位点，小分
子或蛋白质与单链 DNA 具有高亲和力，从而易于结
合到单链 DNA［10，11］。迄今为止，特殊结构的 DNA
已成为药物开发中潜在的重要靶点。
与 DNA 的发夹结构相似，DNA 十字形结构与
许多遗传过程密切相关。DNA 的十字形突出结构参
与了机体的某些转录调控、重组和复制。十字形结
构在真核和原核生物基因组中广泛存在［12-14］，通常
会在启动子、增强子或终止子等基因调控区内形成。
有研究报道十字形结构 DNA 通过与有关蛋白结合在
芽殖酵母复制起源中发挥重要作用［15，16］。十字形
结构的形成促进局部碱基对解除配对，有助于杆状
病毒的转录和复制过程［17］。在牛酪氨酸羟化酶基因
启动子的上游区域的十字形结构，可作为激活或阻
遏蛋白控制细胞特异性启动子活性的目标位点［18］。
在 pBR322 质粒的“-35”区域的十字形结构能够影
响启动子与聚合酶的相互作用［19］。在 Alu 元件（灵
长类动物特有的约 300 bp 长的重复序列）下游形成
的十字形结构可明显抑制 T 细胞特异性增强子的作
用［20］。因此，有必要深入了解十字形结构 DNA 的
形成过程以及进一步揭示它们的生物学作用。
研究 DNA 十字形结构最常用的方法是使用酶
裂解法把目标 DNA 酶解成碎片，然后通过分析不同
DNA 片段来判断十字形结构的位置［20-22］。然而，使
用这种方法存在两点不足之处 ：一是破坏目的基因
二级结构 ；二是十字形结构形成中的某些特异性信
息几乎很少能够被检测出来。荧光光谱法是研究核
酸结构信息的一种重要方法，同时也有利于研究在
体内或者体外溶液中不同浓度条件下它们之间的相
互作用。天然的 DNA 碱基能够吸收 200-300 nm 区
间的紫外辐射，但是激发态寿命很短，只有较弱的
内源荧光，荧光量子产量很低。很多种荧光核酸碱
基类似物被合成并掺入到 DNA 中［23，24］。PdC 是一
种能监测核酸二级结构的荧光碱基类似物，首先，
它类似于天然碱基脱氧胞苷而不破坏双链结构的形
成，此外，它有很大的斯托克斯位移并且荧光对环
境因素的改变很敏感［25］。
本实验在没有改变 pBR322 质粒原有结构的前
提下，用 PdC 分别代替 3 195、3 222 和 3 281 位置
上的 dC。根据配对的 PdC 的荧光寿命比非配对的短
的理论，用时间分辨荧光光谱方法分别研究 3195、
3222 和 3281 位置处的时间分辨荧光寿命。
1 材料与方法
1.1 材料
限制性内切酶 BbvC I、Nb. BbvC I、Dpn I，deep
vent DNA 聚合酶，T4 连接酶和 pBR322质粒购买于
New England Biolabs 公司 ；纯化的大肠杆菌（E.coli）
DNA 促旋酶和拓扑异构酶 I 购买于 TopoGEN 公司 ；
寡核苷酸（引物，PdC 寡核苷酸）购买于 Midland
Certified Reagent Company 公 司 ；XL10-gold 感 受 态
细胞购买于 Stratagene 公司。酶和转化细胞的使用
严格按照制造商的指示说明进行。2700 型 PCR 扩
增 仪（GeneAmp PCR System 2700） 购 买 于 Applied
Biosystems 公司。定点突变试剂盒（QuickChange XL
Site-Directed Mutagenesis Kit）购买于 Stratagene 公司。
凝胶回收试剂盒（QIAquick Gel Extraction Kit）、质
粒提取试剂盒（Plasmid mega kit）均购买于 QIAGEN
公司。稳态和时间分辨荧光光谱仪购买于美国 ISS
公司。实验中使用的其他材料见表 1。
1.2 方法
1.2.1 聚合酶链反应（PCR） PCR 反应体积为 50
μL，pBR322 质 粒 的 量 为 100 ng， 引 物 为 70 ng，
dNTP 的浓度为 250 μmol/L，DNA 聚合酶为 5 U 的
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.4212
deep vent。PCR 扩 增 条 件 为 ：95℃ 变 性 30 s， 在
50℃退火 50 s 和 72℃延伸 8 min，经 25 次循环后，
样品储藏于 4℃过夜。用 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测
扩增产物。
1.2.2 质粒转化、提取与纯化 用 Dpn I 内切酶处
理 PCR 扩增完成后的片段，然后将突变产物转入
XL10-gold 超级感受态细胞，转化操作步骤严格按
照定点突变试剂盒说明书进行。质粒提取和纯化严
格按照质粒提取和纯化手册操作。纯化后产品用
1% 琼脂糖凝胶电泳进行分析。突变的质粒 DNA 由
Seqwright 公司测序分析。
1.2.3 酶切与纯化 用限制性内切酶 Nb. BbvC I 酶
切双突变的 pBR322 质粒，处理方法严格按照内切
酶的说明书。应用凝胶回收试剂盒，获得纯化的长
的酶切 DNA 片段。
1.2.4 pBR322 载体与含 PdC 的片段连接 将酶切
后纯化的 DNA 片段（pBR322 载体）和含有 PdC 的
113 碱基序列的 DNA 片段进行连接。处理如下 ：将
含有 PdC 的 DNA 片段与 pBR322 载体混合（280∶
1），将混合溶液置于 75℃水浴中 20 min，然后自然
冷却至室温。随后加入 5 U T4 DNA 连接酶。反应体
系于 25℃孵育不同时间（10、30、60、90 min）和
37℃条件下孵育 120 min。最后用含有 0.5 μg/mL 溴
化乙锭的 1% 琼脂糖凝胶电泳进行分析鉴定。
1.2.5 连接后处理（纯化） 将 1.2.4 的体系加热到
80℃维持 20 min 从而使 T4 DNA 连接酶失活。加入
1 U 的促旋酶置于 37℃水浴中孵育 2 h 后，应用 1%
琼脂糖凝胶电泳检测分析。
1.2.6 稳态和时间分辨荧光光谱分析 选择稳态激
发波长为 375 nm，发射波长为 425 nm 测定 pBR322
质粒的时间分辨荧光光谱和稳态光谱。室温下，在
固定波长为 375 nm 的激发光作用下，检测样品发射
荧光强度在 390 nm 和 570 nm 波长之间的分布情况。
并检测在波长为 280 nm 和 380 nm 之间的激发光作
用下，样品在发射波长为 425 nm 处的荧光强度。时
间分辨激发光谱用具有激发和发射单色器的 K2 多
频互相关相位调制荧光仪，采用相位调制方式收集。
室温下，使用含二甲基 POPOP 激光燃料的无水乙醇
溶液（其荧光寿命在无水乙醇为 1.45 ns）作为参考。
氙灯为样品激发源。采用单指数拟合，利用 ISS187
衰减分析软件对相位延迟和调制延迟进行分析。
2 结果
2.1 野生型pBR322和扩增后的pBR322的电泳图的
比较
pBR322 质粒经 PCR 扩增后，由 1% 琼脂糖凝
胶电泳结果（图 1）可以看出，野生型 pBR322 质粒
与扩增后的 pBR322 质粒图谱相似，说明 pBR322 质
粒成功被扩增出来。
2.2 细胞扩增pBR322的电泳图
将突变产物转入 XL10-gold 超级感受态细胞，
质粒提取和纯化后 1% 琼脂糖凝胶电泳结果（图 2）
表明，成功获得突变的 pBR322 质粒。
2.3 双突变型pBR322质粒的酶切鉴定
双突变的质粒因为被酶切了两次，一条含有
113 个碱基的 DNA 片段被释放出来，因此，泳道
表 1 实验中所用到的 DNA 序列
名称 序列（5-3）
引物 1 GACCAAAATCCCTTAACCTCAGCTTTCGTTCCACTGAGCGTC
引物 2 GACGCTCAGTGGAACGAAAGCTGAGGTTAAGGGATTTTGGTC
引物 3 GTATATATGAGTAAACTTGGGCTGAGGGTTACCAATGCTTAATC
引物 4 GATTAAGCATTGGTAACCCTCAGCCCAAGTTTACTCATATATAG
插入链 1 TGAGGTTAAGGGATTTTGGTXATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGT
TTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGGC
插入链 2 TGAGGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACXTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGT
TTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGGC
插入链 3 TGAGGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGT
TTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAAXTTGGGC
注 ：下划线部分为 BbvC I 或 Nb. BbvC I 酶识别序列 ；上述 3 条插入链 5 端从 3175 位点列起，3195、3222 和 3281 位点的 X 分别代表 PdC
2016,32(4) 213夏岚等：稳态和时间分辨荧光光谱法检测 pBR322 质粒中十字形结构
2 所显示的 DNA 的泳动速度比泳道 4 的 DNA 稍快
（图 3）。
易形成正超螺旋结构，导致连接后的超螺旋产物比
对照 pBR322 的泳动速度快（图 4）。从泳道 7 可以
看出，当温度升高时，连接产物的产量增多，所以
减少了酶切质粒。
ᶮᕋර䎵㷪᯻
1 2 3 4 5 6
1、3 和 5 ：野生型 pBR322 质粒，对照 ；2、4 和 6 ：突变型 pBR322 质粒 ；
右侧标注为同一行所对应的 DNA 状态
图 1 PCR 产物凝胶电泳 ᶮᕋර䎵㷪᯻㓯ර
1 2 3 4 5 6 7 8
1 ：对照 ；2-8 ：突变型 pBR322 质粒 ；右侧标注为同一行所对应
的 DNA 状态
图 2 纯化产物凝胶电泳
ᶮᕋර㓯ර1 2 3 4 5
1 ：pBR322 质粒 ；2 ：BbvC I 酶切双突变质粒 ；3 ：Nb. BbvC I 酶切双突变质粒 ；
4 ：BbvC I 酶切单突变质粒 ；5 ：Nb. BbvC I 酶切单突变质粒 ；右侧标注为同
一行所对应的 DNA 状态
图 3 酶切鉴定凝胶电泳
ᶮᕋර䎵㷪᯻㓯ර1 2 3 4 5 6 7
1 ：pBR322 质粒 ；2 ：Nb. BbvC I 酶切质粒 ；3-7 ：DNA 连接时间分别为 10、
30、60、90 和 120 min ；右侧标注为同一行所对应的 DNA 状态
图 4 不同时间连接产物凝胶电泳
2.5 纯化后的PdC-pBR322连接产物电泳图
超螺旋和松弛型 PdC-pBR3222 的含量足够用于
稳态和时间分辨荧光光谱的测量（图 5）。
（A）1 ：pBR322 质 粒 ；2 ：Nb. BbvC I 酶 切 双 突 变 质 粒 ；3 ：3222 位 点 为
PdC 的连接质粒 ；4 ：纯化的超螺旋 PdC-pBR322（3222）；5 ：纯化的松弛
型 PdC-pBR322（3222）。 （B）1、6 ：pBR322 质粒 ；2、7 ：Nb. BbvC I 酶切
双突变质粒 ；3、8 ：分别为 3195、3281 位点为 PdC 的连接质粒 ；4、9 ：分
别为纯化的超螺旋 PdC-pBR322（3195、3281）；5、10 ：纯化的松弛型 PdC-
pBR322（3195、3281）；右侧标注为同一行所对应的 DNA 状态
图 5 连接产物纯化凝胶电泳
2.4 连接产物的琼脂糖凝胶电泳图
用溴化乙锭处理后的共价闭合双链 DNA 环，极
ᶮᕋර䎵㷪᯻㓯ර1 2 3 4 5 6 7 9 108
ᶮᕋර䎵㷪᯻㓯ර
1 2 3 4 5A
B
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600000
500000
400000
300000
200000
100000
0
㦗ݹᕪᓖcps 㦗ݹᕪᓖcps
250
1400000
1200000
1000000
800000
600000
400000
200000
0
350
PdC-pBR3223195 PdC-pBR3223222 PdC-pBR3223281CBA
450 550 600500400300 ⌒䮯nm
600000
500000
400000
300000
200000
100000
0
㦗ݹᕪᓖcps
250 350 450 550 600500400300 ⌒䮯nm250 350 450 550 600500400300 ⌒䮯nm
2.6 稳态荧光分析
稳态荧光分析结果（图 6）显示，PdC-pBR322
（3195）和 PdC-pBR322（3281）的激发和发射光谱
没有显著变化。松弛型和超螺旋 PdC-pBR322 光谱
几乎相同。然而，能够观察到松弛型的 PdC-pBR322
（3222） 的 激 发 和 发 射 光 谱 淬 灭， 这 表 明 超 螺 旋
PdC-pBR322（3222）中 PdC 没有配对，十字形环状
部分含有 PdC。
2.7 时间分辨荧光寿命
荧光寿命检测结果（表 2）表明，荧光寿命长
短相当接近，除了超螺旋 PdC-pBR322（3222）的荧
光寿命 1.72 ns 比松弛型 PdC-pBR322（3222）的荧
光寿命 1.42 ns 大约延长了 0.3 ns。结果表明，超螺
旋 PdC-pBR322（3222）中 PdC 没有配对，这可能
意味着在这个位置形成了一个环状结构。
表 2 质粒荧光寿命检测结果
样品 PdC-pBR322 PdC 位置 荧光寿命 /ns
松弛型 3195 1.44 ± 0.004
超螺旋 3195 1.46 ± 0.004
松弛型 3222 1.42 ± 0.004
超螺旋 3222 1.72 ± 0.003
松弛型 3281 1.41 ± 0.003
超螺旋 3281 1.45 ± 0.001
2.8 盐浓度对荧光寿命的影响
应用荧光寿命探讨了溶液中离子强度对 PdC-
pBR322 的作用。结果（图 7）显示，随着盐浓度的
增加，荧光寿命有变化，然而，当盐浓度低于 20
实线表示超螺旋 PdC-pBR322，虚线表示松弛型 PdC-pBR322
图 6 质粒的稳态荧光图谱分析
mmol/L 时，寿命变化相对较大，但仍不显著，表明
十字形结构在该实验研究的盐浓度范围内处于稳定
状态。
3 讨论
十字形结构 DNA 与复制，基因表达调控，核小
体结构重组等生物过程有关，也与癌症、沃纳氏综
合征等疾病的演变与发展有密切联系［26］。很多蛋白
质与十字形结构 DNA 的识别与结合有关。在转录过
程中高迁移率族蛋白家族（HMGB）、乳腺癌 1 号蛋
白（BRCA1）等优先与十字形结构 DNA 结合［27，28］。
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
-20 0 20 40 60ⴀ⎃ᓖmmoL·L-180 100 120
㦗ݹሯભns
● ：促 旋 酶 处 理 的 PdC-pBR322（3222）（o） 拓 扑 异 构 酶 I 处 理 的 PdC-
pBR322（3222）；■ ：促旋酶处理的 PdC-pBR322（3281）；□ ：拓扑异构酶
I 处理的 PdC-pBR322（3281）；▲ ：促旋酶处理的 PdC-pBR322（3195）；△ ：
拓扑异构酶 I 处理的 PdC-pBR322（3195）
图 7 不同盐浓度下的荧光寿命变化
2016,32(4) 215夏岚等：稳态和时间分辨荧光光谱法检测 pBR322 质粒中十字形结构
研究表明，P53 在体内更易于结合错配的双链、十
字形结构等非典型 DNA［29，30］。14-3-3 蛋白能够在
DNA 复制的 S 期通过与复制起始暂时形成的十字形
结合参与真核生物的 DNA 复制过程［31］。因此，十
字形结构 DNA 的形成过程以及其发挥的生物学作用
有待深入研究。
在本实验中我们探讨了如何用 PdC 取代特定位
点的 dC 掺入 pBR322 质粒，并用稳态和时间分辨荧
光光谱法来探测十字形结构 DNA 的形成。该实验方
法与酶解消化法相比，pBR322 质粒不用被酶解成不
同 DNA 片段，因此适用于研究某些完整质粒特性的
实验，如超螺旋结构条件下蛋白质和 DNA 的结合。
尽管在连接步骤中的产率很低，但 PdC 的荧光非常
敏感，浓度为 1 ng/mL 足够应用于荧光光谱测量。
本实验由 3 种不同位点引入 PdC 的光谱分析结
果分析推测，当 DNA 片段中只有 PdC 位点不与 G
配对时，只能够形成“泡”的形式。唯有 PdC 位点
不与 G 形成配对，且该 DNA 具有反向重复序列，其
单链 DNA 在被 PdC 取代位点相邻的两侧能够互补
配对形成一种二元对称结构时，才能够形成十字形
结构（图 8）。
盐浓度可能影响了酶的功能作用。
4 结论
用 PdC 取代质粒中指定位置的 dC 而没用改变
质粒的结构，并利用配对的 PdC 的荧光寿命比非
配对的短的理论，用时间分辨荧光光谱分别测量了
3 195、3 222 和 3 281 位置的荧光寿命，得到 3 222
处 的 PdC 未 配 对。 根 据 3 222 处 的 碱 基 序 列 特 点
（3 222 处的碱基序列具有回文结构），推断出质粒在
该处具有十字形结构。
参 考 文 献
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of ligands targeting triplet repeating transcripts that cause RNA
图 8 PdC-pBR322（3222）质粒中形成的十字形结构 DNA
该实验中光谱分析检测了十字形结构的形成，
除盐浓度对十字形结构的形成影响不明显，其余均
与先前文献报道的一致［32］。我们在盐浓度为 100
mmol/L NaCl 中发现不配对的 PdC，而酶解消化法分
析在 20 mmol/L 以上的 NaCl 中检测不到这种十字环
结构 DNA。光谱数据清楚地表明，即使在高盐浓度
下仍然存在十字形结构 DNA，因此我们推测更高的
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.4216
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（责任编辑 李楠）