全 文 ： 杜宇，孙雪，徐年军. 不同盐度和 Fe3+浓度对小球藻生长、硝酸还原酶活性及基因表达的影响[J]. 生态科学, 2012, 31(4)：441-445.
DU Yu, SUN Xue, XU Nian-jun. Effects of different salinity and iron concentration on growth, nitrate reductase activity and its
expression in Chlorella [J]. Ecological Science, 2012, 31(4)：441-445.
不同盐度和 Fe3+浓度对小球藻生长、硝酸还原酶活
性及基因表达的影响
杜宇，孙雪*，徐年军
宁波大学生命科学与生物工程学院，浙江，宁波 315211

【摘要】 论文以一株紫外诱变获得的蛋白核小球藻 F-9-3 为材料，研究了 4 个盐度和 5 个 Fe3+浓度对其生长和硝酸还原酶
（NR）活性及其基因表达的影响。盐度实验结果表明在 0~0.30 mol•L-1 NaCl 浓度范围内，小球藻生长较快；NR 酶活性及其
基因表达量都是在 0.15 和 0.30 mol•L-1 NaCl 较高。铁浓度实验结果表明在 0.03 和 0.06 mmol•L-1 Fe3+浓度培养小球藻生长较
快，NR 酶活性和基因表达量较高；而高铁浓度组（0.12 mmol•L-1）其生长受抑制，缺铁情况下 nr 基因表达量最高。因此适
合该小球藻生长的最适盐度范围是 0~0.30 mol•L-1 NaCl 和 0.03~0.06 mmol•L-1 Fe3+浓度
关键词： 小球藻；盐度；Fe3+浓度；硝酸还原酶；基因表达
doi:10.3969/j.issn. 1008-8873.2012.04.017 中图分类号： Q5 文献标识码：A 文章编号：1008-8873(2012)04-441-05

Effects of different salinity and iron concentration on growth, nitrate reductase
activity and its expression in Chlorella
DU Yu, SUN Xue*, XU Nian-jun
College of Life Science and Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, China

Abstract: The effects of four different salinity and five iron concentrations on the growth, nitrate reductase (NR) activity and its
expression were investigated in Chlorella pyrenoidosa F-9-3, which was selected after ultraviolet radiation. The salinity experiment
showed that C. pyrenoidosa F-9-3 grew faster in 0-0.30mol•L-1NaCl medium than in 0.45 mol•L-1NaCl medium. And NR activity
and its expression were higher in 0.15 and 0.30mol•L-1NaCl groups than those of other two groups. The iron experiment showed that
the growth, NR activity and gene expression of C. pyrenoidosa F-9-3 were all higher in 0.03 and 0.06 mmol•L-1Fe3+ treatments than
those in other Fe3+ concentration mediums. The growth was inhibited in 0.12 mmol•L-1 iron medium and NR expression was the
highest in iron deficiency group. It can be concluded that optimum culture condition of the alga was 0-0.30 mol•L-1NaCl and
0.03-0.06 mmol•L-1 iron concentration.
Key words: Chlorella；salt；Fe3+concentration；nitrate reductase；gene expression

收稿日期：2011-08-10 收稿，2011-10-05 接受
基金项目：浙江省科技厅公益性研究项目（2010C33066），浙江省创新团队项目（2009R50012-6），宁波市科技攻关项目（2010C10022），宁波市国
际合作项目（2010C10022）
作者简介：杜宇（1987—），女，硕士生，从事藻类生理学方面研究
*通讯作者:孙雪，E-mail: sunxue@nbu.edu.cn
第 31 卷 第 4 期 生 态 科 学 31(4): 441-445
2012 年 7 月 Ecological Science Jul. 2012
1 引言（Introduction）

小球藻（Chlorella）是一种常见的单细胞绿藻，
分布范围极广，主要存在于各种淡水水域，也可在海
水中生长繁殖。作为水体中重要的初级生产者，小球
藻有着生物量大，蛋白含量高，脂肪和多糖含量相对
较少等优势，是一种优良的经济微藻，具有较高的应
用价值和广阔的研究前景[1]。目前小球藻多用于保健
食品、水产饵料、医药化工、环境生态等各个领域。
硝酸还原酶（nitrate reductase，简写为 NR，EC
1.6.1.1）是氮代谢过程的关键酶, 其活力大小直接影
响硝酸盐的生物利用度，在氮循环中占有极其重要的
地位。NR 酶主要催化 NO3-转化生成 NO2-，是植物
吸收利用 NO3-过程中的第一个酶。NR 酶在植物的其
他生理活动，如能量代谢、铁离子同化与转运、水分
胁迫、光呼吸、氯离子还原和分子 O2 分解释放等过
程中也有重要作用[2]。近年来，低等藻类中关于 NR
酶的研究逐渐增多，如江蓠、盒形藻、栅藻中关于光
照、氮盐及重金属等对 NR 酶活性影响的研究[3-5]。
小球藻具有生长周期短，个体小等优势，是碳、
氮代谢研究的良好材料，也是研究环境因子影响的良
好材料。目前普通小球藻和椭圆小球藻 nr 基因全序
列已递交到 NCBI 数据库[6-7]，但蛋白核小球藻中未
见 nr 序列。本文以一株经过紫外诱变小球藻 F-9-3
为材料，研究盐度和 Fe3+浓度对其生长和 NR 代谢酶
的影响，以期筛选出适合该小球藻生长的最优盐度和
Fe3+浓度条件，为小球藻大规模培养提供参考，也为
小球藻氮循环机制的深入研究奠定基础。

2 材料与方法（Materials and methods）

2.1 藻种与培养
实验用原始藻种蛋白核小球藻（C. pyrenoidosa）
F-9 购自中科院水生生物研究所，经紫外诱变后筛选
一株自养生长速度较快的诱变株，命名为 F-9-3。培
养温度为 25℃，光周期为 12L:12D，光照强度约 40
μmol•m-2•s-1。使用 knop 培养基[8]，其中 NO3-浓度为
10 mmol•L-1，实验前再加入 10 mmol•L-1NaNO3 诱导
NR 酶活。

2.2. 不同盐度和Fe3+浓度的处理
用NaCl调节knop培养基的浓度，以初始培养基
的盐度记为0，分别加入NaCl使其终浓度达到0.15
mol•L-1、0.30 mol•L-1、0.45 mol•L-1。每个浓度设置
3个平行。
初始knop培养基中Fe3+浓度为0.06 mmol•L-1，在
不加铁盐的培养基中分别加入不同量的FeCl3母液使
其终浓度分别为0 mmol•L-1、0.015 mmol•L-1、0.030
mmol•L-1、0.06 mmol•L-1和0.12 mmol•L-1。每个浓度
设置3个平行。

2.3 生长和NR酶活测定
细胞密度测定采用颗粒计数仪（ INNOVATIS
CASY，Germany）测定。培养时间为 5 d。
NR酶活测定参考陈薇建立的离体法的测定方
法，其活力以单位时间内所生成的NO2-含量来表征
[9]。其中NO2-N生成量采用磺胺-α-萘乙二胺显色比色
法测定。
2.4 nr 基因序列的克隆
参照普通小球藻，团藻、杜氏藻和莱茵衣藻等的
NR 酶保守氨基酸序列设计一对简并引物：NF900—
TACCACTT/ACC/AA/TC/GGACAAC,F1220—GGC
AAGC/ TA/TCTGGG/TG/CCTGGGT。总 RNA 的提
取使用 Trizol 试剂（Invitrogen 公司），以反转录合
成的 cDNA 为模板，扩增获得了 311 bp nr 序列。

1.5 nr 表达的荧光定量分析
实验材料经过盐度和铁离子处理后光照6h，取样
进行实时荧光定量PCR检测。根据2.4中获得序列设
计荧光定量PCR引物：

NR56—ACAAGGAGGGCTGGTGGTAC
NR226—ACACCTCGCAGCGGATGAT。

18S rDNA内标引物为：
18S372—ACCGTCCTAGTCTCAACCATAA和
18S502—AGTTTCAGCCTTGCGACCATAC。
RNA提取和反转录同2.4。样品荧光定量 PCR
的反应体系为：SYBR Premix Ex Taq (2)10 μL,
Forward Primer 0.5 μLReverse Primer 0.5μL,cDNA 模
板2 μL，加dH2O至20 μL。反应条件为: 94℃预变性
30s，接着按94℃ 10s、56℃ 15s、72℃ 20s程序进行
40个循环。
442 生 态 科 学 Ecological Science 31 卷
3 结果和分析（Results and analysis）

3.1 盐度对小球藻生长、NR 酶活性以及转录水平的
影响
不同盐度对小球藻的生长影响情况见图 1。从图
中可以看出，本实验所用小球藻在低盐下生长要比无
盐快，其中当盐浓度为 0.30 mol•L-1时小球藻生长情
况最好，藻密度增长最大。当盐度为 0.45 mol•L-1（相
当于海水盐度）时，小球藻生长明显变慢，但仍可生
长，这说明该小球藻的耐盐范围较广。


图 1 不同盐度对蛋白核小球藻 F-9-3 生长的影响
Fig. 1 Effect of different salinity on the growth of C.
pyrenoidosa F-9-3

图2表示的是不同盐度下小球藻NR酶活性的变
化情况。除在 0.15 mol•L-1 盐度下小球藻 NR 酶活性
在第 3 d 达到最大值外，其余三个盐浓度下均在第 1 d
就达到了最大值，并随时间的推移 NR 酶活性逐渐降
低。总体来看，0.15~0.30 mol•L-1 的盐度 NR 酶活性
较高，而高盐度（0.45 mol•L-1）酶活性受抑制。



图2 不同盐度对蛋白核小球藻F-9-3 NR酶活性的影响
Fig. 2 Effect of different salinity on nitrate reductase
activity of C. pyrenoidosa F-9-3
在光照 6 h 后，不同盐度培养小球藻的 nr 基因表
达差异显著（见图 3）。以 0 mol•L-1盐度组的表达量
作为 1，0.15 molL-1 盐浓度培养小球藻表达量最高，
其表达量为 0 mol•L-1 组的 6 倍左右，其次为 0.3
mol•L-1 盐度组，其表达量是 0 mol•L-1 的 4 倍左右。
在高盐（0.45 mol•L-1）培养环境中的小球藻 nr 酶基
因表达量最低，为 0 mol•L-1 盐度组表达量的 0.68 倍。

图3 不同盐度对蛋白核小球藻F-9-3 nr表达的影响
Fig. 3 Effect of different salinity on NR expression of C.
pyrenoidosa F-9-3

3.2 Fe3+浓度对小球藻生长、NR 酶活性以及转录水平
的影响
Fe3+浓度的变化对小球藻生长的影响见图 4。当
培养基中缺乏铁离子时，小球藻在前 3 d 的生长情况
都明显好于其他不同 Fe3+浓度的实验组，但第 5d 后
细胞死亡，密度下降。低 Fe3+浓度（0.015 mmol•L-1）
下培养的小球藻生长状态不好，细胞密度变化幅度
小。当 Fe3+浓度达到 0.03 mmol•L-1和 0.06 mmol•L-1
时，小球藻的密度呈快速上升趋势。而高铁环境小球
藻的密度不增反而呈现下降的趋势，说明铁离子浓度
过高对小球藻生长有抑制作用。


图 4 不同 Fe3+浓度对蛋白核小球藻 F-9-3 生长的影响
Fig. 4 Effect of different Fe3+concentrations on the growth of
C. pyrenoidosa F-9-3
4 期 杜宇，等. 不同盐度和 Fe3+浓度对小球藻生长、硝酸还原酶活性及基因表达的影响 443
不同 Fe3+浓度对小球藻的 NR 酶活性影响见图 5
中。从图中可以看出，在培养的第 1 d 小球藻 NR 酶
活性均达到了最高，并呈现出逐日递减的趋势，除了
Fe3+浓度为 0.06 mmol•L-1下 NR 酶活性在第 5d 略有
上升。0.03~0.06 mmol•L-1Fe3+浓度处理组 NR 酶活性
在 5 d 内均较高，而 0.12 mmol•L-1Fe3+浓度 NR 酶活
性受到一定程度的抑制。

0
5
10
15
20
25
30
35
0 0.015 0.03 0.06 0.12
酶活
/μg
.g-
1 h
-1


Ac
tiv
ity
Fe3+ c/mol-1
第1天
First
day
第3天
Third
day
第5天
Fifth
day

图5 不同Fe3+浓度对蛋白核小球藻F-9-3 NR酶活性的影响
Fig. 5 Effect of different Fe3+concentrations on the nitrate
reductase activity of C. pyrenoidosa F-9-3

在不同 Fe3+浓度处理下小球藻 nr 基因的转录表
达差异显著（图 6）。将 knop培养基中的Fe3+浓度（0.06
mmol•L-1）记为 1，其中缺乏 Fe3+时 nr 表达量最大，
而 0.015 mmol•L-1 的 Fe3+浓度下 nr 表达量最低，只为
0.06 mmol•L-1 的一半。而其它两个 Fe3+浓度处理小球
藻 nr 表达量差异不显著。
图6 不同Fe3+浓度对蛋白核小球藻F-9-3 nr表达的影响
Fig. 6 Effect of different Fe3+concentrations on the NR
expression of C. pyrenoidosa F-9-3

4 结论（Conclusions）

4.1 盐度的影响
小球藻是一种耐盐范围较广的藻。本研究中所用
淡水小球藻在低盐环境中生长速度比淡水培养中快，
培养5 d后，加入不同盐度的小球藻藻体颜色发黄，
并且随盐度增加越明显，可见NaCl影响了小球藻的
色素组成比例，使叶绿素含量下降。
盐度不仅影响小球藻的生长，也影响了NO3-的代
谢。本研究显示，一定盐度范围内小球藻NR酶活性
随盐度增高逐渐增强，当盐度达到某一水平时，活性
又下降。该结果与白骨壤和秋茄幼苗叶质膜NR活性
受培养液盐度的影响趋势一致[10]。
nr 基因表达的调控主要发生在转录水平和转录
后水平。在低等植物中，NR 的 mRNA 合成与降解是
比较迅速的[11]。为了研究 nr 的转录水平调控，Cann-
ons等从普通小球藻nr启动子序列中鉴定了一系列调
控 nr 转录表达的作用元件[12]。本文中荧光定量结果
表明不同盐度培养小球藻 NR 酶在转录水平上差别
很大。其中无盐和高盐（0.45 mol•L-1）培养下的表达
量最低，而0.15 mol•L-1和0.30 mol•L-1盐度培养较高。
4.2 Fe3+浓度的影响
Fe3+浓度对小球藻生长影响也较明显。当培养液
中不加 Fe3+或 Fe3+浓度较低时，小球藻仍可利用细胞
内 Fe3+生长，但导致对数期缩短，无铁环境甚至会造
成小球藻细胞的死亡[13]。当培养液中的 Fe3+浓度达到
0.03 mmol•L-1 和 0.06 mmol•L-1 时，小球藻细胞密度
变化幅度大，生长对数期明显，说明一定浓度的 Fe3+
对小球藻的生长有促进作用。但在高 Fe3+浓度（0.12
mmol•L-1）环境中，小球藻的生长抑制明显，这说明
Fe3+浓度与小球藻生长关系密切。也有研究者认为，
Fe3+由于需求量小，对等鞭金藻生长影响不明显[14]。
NR酶活性也受不同Fe3+离子影响。Mallick等研
究表明铁离子对普通小球藻的NR酶活性有毒性[15]。
本研究结果表明高铁浓度组（0.12 mmol•L-1）在培养
的第5dNR酶活性迅速下降，低于缺铁培养组。而适
当浓度铁离子如0.03 mmol•L-1的NR酶活性在5d内只
有小幅度下降，而0.06 mmol•L-1组甚至稍高于第3d。
不同Fe3+浓度培养小球藻NR酶在转录水平上的
差异幅度小于盐度的影响。当培养液中无铁时，nr
基因表达量最高，在0.015 mmol•L-1的Fe3+浓度下的表
达量最低。0.03 mmol•L-1~0.12 mmol•L-1的Fe3+浓度培
养下，NR酶都保持较高的转录水平，且差异不显著。

4.3 其他因子的影响
除了盐和Fe3+之外，温度、光照、其他金属离子
444 生 态 科 学 Ecological Science 31 卷
等对NR酶活性影响也很大。温度是影响大型海藻NR
酶和生长的重要因素，当环境温度为25℃和45℃时，
NR酶活性只有10℃培养下的33%和23%[16]。墨角藻
等4种褐藻NR酶活性和总氮含量在冬季明显高于夏
季[17]。光照也是调控NR酶活性的一个重要因素，且
对NR酶的诱导具有昼夜节律现象[4]。金属离子对植
物的影响呈现链式结构，首先影响呼吸和光合作用，
然后影响同化作用和硝酸盐的吸收，最后影响其他代
谢过程[18]。Cu2+和Zn2+对斜生栅藻（Scenedesmus sp.）
NR酶的影响的实验中Zn2+更为突出 [19]。当环境中
Cu2+>0.05 mg•L-1，Cd2+>0.1 mg•L-1时，小球藻NR酶
活性受到明显抑制 [20]。对21种北极海藻的研究表明，
Cu2+和Zn2+存在时大部分海藻的NR酶活性增加[20]。

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