全 文 ：第29卷第3期
2010年6月
生态科学
EcologicalScience
29(3)：247—250
Jun．2010
乐小亮，赵爽，刘海林，章群．基于线粒体细胞色素b基因全序列的海南长臀统南渡江种群遗传变异分析【J】．生态科学，2010，
29(3)：247—250．
YUEXiao·liang，ZHAOShuang，LIUHai—lin，ZHANGQun． eneticvar ationofcranoglanisbouderiusmultiradiatuspopulationin
NandujiangR verbaseonmitochondrialcytochromebsequences[J】．EcologicalS ience，2010，29(3)：247-250．
基于线粒体细胞色素b基因全序列的海南长臀能南
渡江种群遗传变异分析
乐小亮，赵 爽，刘海林，章 群+
暨南大学水生生物研究所，广东广州510632
【摘要】 测定了海南南渡江15尾海南长臀旎(Cranoglanisbouderiusmultiradiatus)的cytb基因全序列1138bp，发现3个可变位
点和1个简约信息位点，共检测到4种单倍型。海南长臀鲍Cytb基因具有典型的起始密码子(ATG)和不完全终止密码子(T幸·1，
共编码379个氨基酸，密码子第三位点G的含量仅2．9％，而C和A的含量分别为39．1％和38．5％，在第二位点上T的使用频
繁高达41．3％，表明cytb基因在密码子碱基的使用具有偏倚性。海南长臀能基于Kimura．2．parameter模型的单倍型间遗传距离
为0．0009-0．0017，在NJ系统树中没有明显的谱系结构，单倍型多样性(0．600)和核苷酸多样性(0．0006)都较低，表明海南长臀鲍
遗传多样性非常贫乏，应及时采取有效措施保护海南南渡江种群。
关键词：海南长臀觥；细胞色素b；遗传变异
doi：10．3969／j．issn．1008-8873．2010．03．009中图分类号：Q178．532文献标识码：A 文章编号：1008．8873(2010)03．247-04
GeneticvariationofcranoglanisbouderiusmultiradiamspopulationinNa dujiang
Riverbaseonmitochondrialcytochromebsequences
YUEXiao-liang,ZHAOShuang，LIUHai—lin，ZHANGQun+
ResearchCenterofHydrobiology,JinanUniversity,Guangzhou510632,Chh,a
Abstract：The1138bpsequenceof ompletemitochondrialcytochromebgene(cytb)of15individualsofCranoglanisbouderius
multiradiatuspopulationinNa dujiangRiver，HaiNanProvinceweredetermined．3variablesitesand1parsimony—informativesites
wered tectedin4hapoltypes；therewereatypicalinitiationcodon(ATG)andincompleteterminationcodon(T”)intheCytbgeneof
Cranoglanisbouderiusmultiradiatus，andthecontentofGsinthethirdcodonpositionwasonlyaccountedfor2．9％，butthecontentof
CsandAswas39．1％and38．5％respectively．Thecontentof"Isinthesecondcodonpositionwas41．3％．indicatingthatheusageof4
basesindifferentcodonpositionsofcytbgeuew rebiased．Geneticdis ancesbasedonKimura2-parameterod lamong4haplotypes
rangedfrom0．0009tO0．0017．andnoobviousgenealogicalclusterw efoundintheneighbor-Joiningtree．Theresultthathaplotype
dive体ity01d)andnucleotided v rsity(Pi)were0．600and0．0006respectivelyinthepopulationsuggestedthatgeneticd ve硌i哆of
sequencesofcytbgeneofCranoglanisbouderiusmultiradiatusintheNandujiangRiverWasverypoor，andurgentandeffective
measuresshouldbetakentocouseivcthealuablefish．
Keyword：Cranoglanisbouderiusmultiradiatus；cytochromeb：Genenticva iation
收稿日期：2009—12-01收稿，2010．04．20接受
基金项目：国家自然科学基金(30770415)、留学归国人员科研启动基金(2005)资助项目
作者简介：乐小亮(1982_-)，男，湖北浠水人，硕士，主要研究方向为分子生态学
。通讯作者，章群．E—mail：tqzhang@jnu．edu．ca，Tel：13431042736
万方数据
1引言(Introduction)
长臀鳙(Cranoglanisbouderius)隶属于鲇形目
(Siluriformes)长臀兢科(Cranoglanididae)长臀鲍属
(Cranoglanis)，俗称骨鱼，为东亚特有种，一般认
为有2个种，即珠江长臀,,鲍(C．bouderiusbouderius)
和海南长臀鲍(Cbouderiusmultiradiatus)|¨，在我国
分布于珠江水系、云南(元江水系)及海南岛诸水系
(如南渡河、万泉河等)，为亚热带山麓河溪底层鱼
类。长臀鲍肉味鲜美，为珠江地区深受欢迎的食用
鱼类之一。近年来，我国野生长臀锍资源严重衰退，
现己被《中国濒危动物红皮书》列为易危动物12J。
国内关于长臀旎的地理分布、生态习性、胚胎发育
及人工繁殖技术已经有较多报道13硎，但有关海南
长臀鲵遗传多样性的研究就鲜有报道，仅见于程飞
等分别利用微卫星标记和AFLP技术分析珠江长臀
筑和海南长臀觥的遗传变异【7{J。遗传多样性相关数
据是制定物种资源管理与保护策略的重要依据之
一，因此开展海南长臀能遗传多样性研究是十分必
要的。
线粒体DNA因母系遗传、没有重组和进化速
度快等特点成为一种有效的研究物种进化和遗传
多样性的材料，其中线粒体细胞色素b基因
(Cytochromeb，Cytb)的结构和功能已了解得比较详
细，广泛用于种类鉴定和系统发生等方面的研刭91，
也是鱼类分子进化研究中最常用的标记之一。作为
核基因的重要补充，通过分析线粒体基因特征了解
我国海南长臀觥遗传多样性情况是很有必要的。因
此，本研究通过测定分析海南长臀虢cytb基因全序
列，对其遗传变异进行检测和分析，为其资源保护
及开发利用提供参考数据。
2材料与方法(MaterialsandMethods)
2．1样本来源
实验用的15尾海南长臀觥样品采于海南南渡
江(编号QBShl-15)，保存在95％酒精中。
2．2 DNA的提取和PCRj旷增
取约0．019鱼背部肌肉，晾干后加入400I_tL
SDS-buffer(10mMTris-cl，0．1MEDTA，0．5％SDS，
pH8．0)和8此的20mg／mL的蛋白酶K于55。C水浴
消化3h，用等体积的酚一氯仿抽提至澄清，上清液
经等体积异丙醇沉淀3h后，12，000rpm离心10min获
得DNA沉淀，并用70％酒精润洗2次，晾干后溶于
40I_tLTE(pH7．4．8．0)，一20℃保存备用。
采用自行设计的引物cytbF：5-ACCGA-
GACCAArGACTTGAARAACCACCGTTG·3’，cytbR：
5’一a册GGAGnAGGGGTGGG．3’，进行PCR扩增，
反应体系为30pL：DNA模板1止，上下游引物(10I．tM)
各为0．31aL，10×PCR缓冲液(with1．5mMMgCl2)3I_tL，
BSA(0．5mg／mL)和dNTPs(2mM)各为1．2I_tL，2．5U／rtL
的Taq酶0．6I．tL，用灭菌双蒸水补充至300L。PCR反
应程序为94℃变性4min后，进行94℃30s，54℃30s，
72℃lmin热循环30次，最后72℃延伸10min。经
k％TAE琼脂糖凝胶检测合格的PCR产物送至北京六
和华大基因有限公司切胶纯化，并在ABl3730DNA测
序仪上进行双向测序。
2．3数据处理
测定的序列经人工校对后，用Contig．Express
7．1(InforMax，Inc．)软件进行序列拼接，并用ClustalX
1．83软件【10】进行序列比对，用MEGA4．0软件【111统计碱
基组成、碱基变异情况、转换和颠换值和碱基变异情
况等，并采用Kimura．2．parameter(K-2．p)模型计算各单
倍型间遗传距离，构建邻接树(Neighborjoiningtree)，
1000次bootstrap计算置信度【12】。采用DnaSPv5软件【131
分析核苷酸多样性Pi(Nucleotidediversity)、单倍型多
样性Hd(Haplotypediversity)和单倍型分布情况等。
3结果与讨论(ResultsandDi cussion)
3．1细胞色素b基因序列特征
除去两端不确定的序列后，获得cytb基因全序列
1138bp，序列具有典型的起始密码子(ATG)和不完全终
止密码予(T和畸，与彭作刚测得长臀兢cytb序列的结果
一样Il41，表明本研究所得序列确为海南长臀虢cvtb基
因序列。基因共编码379个氨基酸，其中亮氨酸(Leu)
含量最高，为17．41％，其次是异亮氨酸(Ile)，为8．71％，
含量最低的为半胱氨酸(Cys)，仅为0．79％。
15尾海南长臀鲍cytb基因全序列中没有发现碱基
缺失和碱基插入，共检测到3个变异位点(Variablesites)
和1个简约信息位点(Parsimonynformativesites)，都
发生在密码子第三位碱基上，且没有造成氨基酸位点
的变化：平均转换／颠换比为4．1，表明序列位点没有达
到突变饱和Il51，其中位点261和831发生T-C转换，
万方数据
3期 乐小亮，等：基于线粒体细胞色素b基冈全序列的海南长臀鲍南渡江种群遗传变异分析
位点555发生A-C颠换。15尾长臀觥的A、T、C、
G的平均含量分别为28．0％、29．2％、29．7％、13．2％，
A+T含量(57．2％)明显高于G+C含量(42．9％)，表现
出反G偏倚(biasagainstguanine)，与脊椎动物线粒
体DNA的特点相一致116】；序列中T、C、A、G碱
基在密码子中的频率如图1所示。在三联密码子的
不同位置，碱基组成表现出很大的差异。第1位点
碱基含量差异不大，而第2、第3位点碱基含量差
异比较明显。密码子第3位点上G的含量特别的少，
只有2．9％，而C和A的含量分别为39．1％和38．5％；
在第2位点上T的使用最频繁(41．3％)，这反映海南
长臀觥Cytb基因在密码子碱基的使用上具有偏倚
性(Bias)，这与其他鱼类cytb基因密码子组成的情
况类似【161。
镫
g
蝣
誉
昌 薹 —1．_一_一豹．匿_一_一_一曩 耄]． 錾』 l一舞 雪辱j蠹纛篓i宴鬈
T1ClA1GIT2C2A2G2I"3C3A3G3
甯码子3个位点的碱基组成
Basecompositionn3positionsofcodon
图1海南长臀筑cytb基因碱基组成频率
Fig．1BasesfrequencyofcytbofCranoglanisboudedus
3．2系统发育与遗传多样性分析
15尾海南长臀觥中存在4种单倍型(Hapl-4)，
其中单倍型Hap2出现9次，Hap3出现4次，Hapl
和Hap4各1次，推测Hap2很町能是一种较原始的
单倍型类型；4种单倍型序列间最多有2个碱基差
异，表明cytb基因序列在本群体内具有较高的相似
性；同时它们彼此之间的K-2．P遗传距离为
0．0009-0．0017，并根据此模型构建的邻接树如图2
所示，群体内没有形成明显的谱系结构，说明它们
可能来自于同一个母系群体。对于大多数动物
mtDNA而言，其单倍型间平均遗传距离在0．01以
上，被认为变异较大117J，本研究中单倍型间遗传距
离最大为0．0017，远小于0．01，表明我国海南长臀
鲍cytb遗传变异较小。
15尾海南长臀觥的单倍型多样度Hd和核苷酸
多样度Pi分别为0．600和0．0006；这与已濒危的怒江
角鱼的遗传多样性(Hd=0．579，Pi=0．0007)水平相似
【18】，甚至比已被IUCN列入濒危物种名录的香鱼日本琉
球亚种(Plecoglossus口肋旧凰ryukyunsis)遗传多样度
(Hd：0．519，Pi：0．0011)还低E心J，表明我国海南长臀鲍的
遗传多样性非常匮乏，应及时采取措施加以保护。当
然，由于本次研究样品量较少，很难全面反映我国海
南长臀鲍的遗传全貌，所以也不排除在其他地区存在
遗传多样性丰富的群体的可能。
60
QBghlI
QBSM
QBShl3
QBSh9
QBs醛
QBShl4
Q阶112
QBShlO
QBShllHapl
QBSh4IⅡ叠一
I-．--．-1
00∞1
图2基于cytb基因序列的邻接树
Fig．2Neighbor-joiningtreebasedoncytbsequences
海南长臀觥喜好群居，容易被捕捞，再加上海南
省许多地区农民都以捕捞长臀鲵为生，就更加加重了
该资源的衰竭【51；而且海南长臀鳙一般4龄才性成剥引，
分布区域较为狭窄，资源一经破坏就较难在短期内恢
复，这也是野生海南长臀虢数量减少和资源衰退的重
要原因；此外，生境污染、繁殖所需的生态环境遭到
破坏、酷渔滥捕等，也是造成海南长臀鲵遗传多样性
较低的原因。
3．3海南长臀兢管理保护措施
遗传多样性较低可导致生物适应能力和生存能力
的降低，鉴于海南长臀鲵遗传多样性非常匮乏，应尽
快采取有效措施，加大对这一濒危鱼种的保护力度。
虽然目前长臀兢的人工养殖技术获得了成功，但随着
时间的推移，养殖群体内可能积累一定的近交衰退效
应，可能导致种质资源衰退。故保存一部分野生海南
长臀鲵繁殖群体对海南长臀锍资源保护和开发利用都
是非常霞要的。
与此同时，有必要采用多种分子标记技术，分析
海南长臀锍不同地理分布群体的线粒体基因和核基因，
全面揭示我国海南长臀娩的遗传结构和遗传多样性，
为长臀兢资源保护、种质资源开发利用和增殖放流效
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万方数据
250 生态科学EcologicalScience 29卷
果的评估提供科学依据。
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基于线粒体细胞色素b基因全序列的海南长臀鮠南渡江种群遗
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作者： 乐小亮， 赵爽， 刘海林， 章群， YUE Xiao-liang， ZHAO Shuang， LIU Hai-lin，
ZHANG Qun
作者单位： 暨南大学水生生物研究所,广东,广州,510632
刊名： 生态科学
英文刊名： ECOLOGICAL SCIENCE
年，卷(期)： 2010,29(3)

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本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_stkx201003009.aspx