全 文 :·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(2):116-122
纤维二糖酶又称为 β-葡萄糖苷酶[1],能够水解
纤维二糖产生两分子的葡萄糖[2],并能极大地促进
内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的水解作用,加快纤
维素酶系的整体水解速度,促使纤维素的水解更完
全[3]。现在对真菌中纤维二糖酶产生菌研究较多的
是丝状真菌,主要为曲霉属和木霉属[4],而细菌中
研究较多的是芽孢杆菌属[5,6]。
黑曲霉(Aspergillus niger)是纤维二糖酶的高
产菌株[7,8],但是关于黑曲霉纤维二糖酶基因的研
究报道仍然较少[9,10]。2000 年,美国 Dan 等[11]研
究者在 GenBank 上登录了第一个黑曲霉纤维二糖酶
的全基因序列。2007 年,荷兰工业化学公司首次完
成了对一株黑曲霉的全基因组测序,该黑曲霉基因
组有 3 390 万个碱基对,并且构成超过 14 000 个独
收稿日期 :2015-04-30
基金项目 :湖南省教育厅科学研究重点项目(13A123),中南林业科技大学研究生科技创新基金项目(CX2014B30)
作者简介 :朱永瑞,男,硕士研究生,研究方向 :微生物方面的基因克隆与表达研究 ;E-mail :1006398396@qq.com
通讯作者 :曾柏全,博士,教授,研究方向 :生物资源利用与分子技术 ;E-mail :baiquanzhn@163.com
黑曲霉 C112 纤维二糖酶基因的克隆与生物信息学分析
朱永瑞 曾柏全 曾磊 刘辉
(中南林业科技大学 生命科学与技术学院,长沙 410004)
摘 要 : 以紫外诱变获得的高产纤维素酶黑曲霉 C112 菌株为模板,采用 RT-PCR 技术克隆黑曲霉 C112 的纤维二糖酶基因
bgl(GenBank 登录号 :KP307454);该基因全长 2 934 bp,含有非编码序列,编码 860 个氨基酸,等电点为 4.70,核酸序列与数据
库的 Aspergillus niger(GenBank 登录号 JX982101.1)同源性达到了 99% ;生物信息学分析表明,纤维二糖酶为具有一定亲水性的稳
定酸性分泌蛋白;二级结构以 α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲为结构元件;该基因经 IPTG 诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE 检测结果表明,
重组表达产物的相对分子量约为 93.3 kD,与预期相符;纤维二糖酶在大肠杆菌 BL21 中胞内融合表达,重组蛋白 pNPG 酶活为 5.847
U/mL,最适反应温度为 50℃,最适 pH 值为 5.0。
关键词 : 黑曲霉 C112 ;纤维二糖酶 ;克隆 ;生物信息学
DOI :10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.015
Cloning and Bioinformatics Analysis of Cellobiase Gene from
Aspergillus niger C112
ZHU Yong-rui ZENG Bai-quan ZENG Lei LIU Hui
(College of Life Science and Technology,Central South University of Forestry and Technology,Changsha 410004)
Abstract: The cellobiase gene(GenBank accession number :KP307454)was cloned by RT-PCR from high-yield cellulase Aspergillus
niger strain C112 mutated by UV. The whole length of cellobiase was 2 934 bp containing non-coding sequence, and encoding 860 amino acids
with the pI of 4.70. The homology of nucleotide sequence with Aspergillus niger(GenBank accession number :JX982101.1)reached 99%.
Bioinformatics analysis showed that cellobiase was a hydrophilic, stable, and secreted protein ;its secondary structure consisted of the structural
elements of α-helix, β-folding and random coil. As expected, recombinant fusion protein was expressed after IPTG induction, and the relative
molecular mass was approximately 93.3 kD by SDS-PAGE. The fused β-Glucosidase was expressed in Escherichia coli BL21. The enzyme activity
of recombinant protein pNPG was 5.847 U/mL, the optimal reaction temperature was 50℃, and the optimal reaction pH was 5.0.
Key words: Aspergillus niger C112 ;cellobiase ;cloning ;bioinformatics
2016,32(2) 117朱永瑞等:黑曲霉 C112 纤维二糖酶基因的克隆与生物信息学分析
特的基因,其中编码纤维二糖酶的基因已被完全确
定[12]。国内 2006 年首次出现关于黑曲霉纤维二糖
酶基因克隆研究的报道。
本研究通过参照 GenBank 上已发表的黑曲霉纤
维二糖酶基因序列(登录号 :AJ132386)设计引物,
实验菌株是经过紫外诱变筛选获得的高产纤维素酶
黑曲霉菌,以此菌株总 RNA 为模板克隆了纤维二糖
酶的基因,进行基因序列测序。国内外对该基因生
物学信息还未见报道,因此本研究对该基因进行初
步的生物信息学分析,以更好地了解纤维二糖酶的
功能性质,并且实现该基因在大肠杆菌 BL21 中胞
内融合表达。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌 株 与 质 粒 黑 曲 霉(Aspergillus niger)
C112[13],保存于中南林业科技大学发酵工程实验室。
大 肠 杆 菌 DH5α、BL21(DE3),pEASY-T1 购 自 北
京全式金生物技术有限公司。
1.1.2 酶与试剂 总 RNA 提取试剂(Trigol)、焦碳
酸二乙酯(DEPC),北京鼎国昌盛生物技术有限公司;
普通琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒、质粒小提试剂盒,
北京天根公司 ;M-MLV 逆转录试剂、EasyTaq PCR
SuperMix,北京全式金生物公司 ;其它试剂均为国
产分析纯。
1.1.3 培养基 PDA 培养基 :马铃薯 200 g/L(将
马铃薯切成方块,置于 1 000 mL 水中煮沸,过滤收
集液体,即得),葡萄糖 20 g/L,琼脂粉 15 g/L。纤
维素酶诱导培养基 :蛋白胨 10 g/L,麦芽糖 4 g/L,
MgSO4 0.5 g/L,KH2PO4 1 g/L。LB 液 体 培 养 基 :胰
蛋白胨 10 g,酵母提取物 5 g,NaCl 10 g,加入去离
子水 950 mL,用 10 mol/L NaOH 调 pH 值至 7.0,加
去离子水定容 1 L。LB 固体培养基 :配方和液体培
养基一样,并加入 15 g 琼脂粉。所配的培养基均在
1×105 Pa 灭菌 20 min,4℃保存备用。
1.2 方法
1.2.1 引物设计 参照 GenBank 上已发表的黑曲霉
纤维二糖酶(bgl1)基因序列(GenBank 登录号为
AJ132386),利用 Primer premier 5.0 设计引物,引物
序列为上游引物 P1 :5-CGGAATTCATGAGGTTCACT
TTGATCGAGGCGG-3,下游引物P2:5-ATGCGGCCGC
TTAGTGAACAGTAGGCAGAGACG-3, 由 苏 州 金 唯
智生物科技有限公司合成。为了便于与载体连接,
在引物中加入酶识别位点,bgl1 的引物中加入了
EcoR I 和 Not I 位点(引物中的划线部分)。
1.2.2 黑曲霉 C112 的复苏和保藏 从真空冻干菌
管中用接种环刮下少量细胞接于 PD 液体培养基,
30℃培养 24 h,用接种环从培养液中蘸取少量菌液
画线于 PDA 斜面,30℃静置培养到长出孢子,于 4℃
保存。
1.2.3 黑曲霉 C112 总 RNA 提取及 cDNA 的合成
总 RNA 的提取方法参照北京鼎国昌盛生物技术有限
公司的 Trigol 试剂盒的说明。cDNA 的合成按照北京
全式金生物公司的 RT-PCR 试剂盒说明书操作。
1.2.4 纤维二糖酶基因的测序及系统发生分析 将
PCR 产物回收纯化后,克隆到 pEASY-T1 载体中,
转化大肠杆菌 DH5α,经蓝白斑筛选重组子,挑取
经菌落 PCR 验证的阳性克隆子进行序列测定。利用
Blast 工具进行序列相似性分析,选取部分同源序列,
利用 Clustal X 软件包进行序列同源进化比对,形成
一个多重序列匹配排列矩阵,构建系统发育进化树。
1.2.5 测序及序列的生物信息学分析 测序结果
采用在线软件对纤维二糖酶基因氨基酸序列进行
物 理 性 质(http://web.expasy.org/protparam/)、 二 级
结 构(http://npsa-pbil.Ibcp.fr/cgi-bin/npsa-auomat.
pl/page=/NPSA/npsa-hnn.html)、 三 级 结 构(http://
swissmodel.expasy.org/SWISS -MODEL.html)及信号肽
(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0)等信息的
预测分析,氨基酸序列同源比对用 Blast 在线工具和
DNAMAN8.0 软件完成。
1.2.6 纤维二糖酶的诱导表达验证 将阳性重组
子接种到新鲜含有相应抗体的液体 LB 培养基中,
37℃、200 r/min 过夜培养,以 1% 的比例接种到 30
mL 抗性 LB 液体培养基,37℃、200 r/min 培养细菌
生长到对数生长期后(OD600=0.4-0.5),加入终浓度
为 1 mmol/L 的 IPTG 诱导目的基因表达,30℃诱导 3
h,取 1 mL 菌液,4℃、12 000 r/min 离心 2 min,收
集菌体,用 PBS 缓冲液(pH7.0)洗涤沉淀,并溶于
500 μL 相同缓冲液中。超声破碎细胞 :功率 200 W,
超声 2 s 间隔 4 s,共 60 次。4℃、12 000 r/min 离心
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.2118
30 min,得到上清液即粗酶液。取适量菌液做诱导
表达效果的检测,实验以未加 IPTG 诱导为对照,并
运用 Western blotting 技术对重组蛋白进行验证。
1.2.7 纤维二糖酶的酶活检测 采用国际通用的方
法测定纤维二糖酶的活力[14]:取 0.1 mL 稀释了适
当倍数的粗酶液(对照管不加),加入 1 mL pH4.8
的 0.05 mol/L 柠檬酸缓冲溶液,于 50℃水浴预热 10
min ;加入已预热 10 min 的 0.9 mL 5 mmol/L pNPG 溶
液,计时,10 min 后立即加入 1 mL 1 mol/L Na2CO3
溶液终止反应 ;加入蒸馏水定容到 25 mL ;室温放
置 5 min,于 410 nm 处测吸光度值 A。在上述条件下,
1 mL 酶液 1 min 水解产生 1 μmol 的对硝基苯酚的酶
活力,定义为一个酶活单位(U)。
1.2.8 重组酶学性质的初步研究
1.2.8.1 温度对酶活力的影响 粗酶液在不同温度
下(30、40、50、60、70、80℃) 保 温 30 min 后,
按照 1.2.7 中的方法测定酶活。
1.2.8.2 pH 对酶活力的影响 粗酶液分别在不同 pH
值的醋酸缓冲液条件下(pH4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、
6.5、7.0)室温处理 30 min 后,按照 1.2.7 中的方法
测定酶活。
2 结果
2.1 纤维二糖酶基因的克隆
利用所设计的引物,以黑曲霉菌株的 cDNA 为
模板进行 PCR 扩增,电泳结果(图 1)显示扩增片
段约为 2 900 bp 左右,与预期相符。
2.2 纤维二糖酶的生物信息学分析
2.2.1 纤维二糖酶基因的序列分析 纤维二糖酶
基 因 片 段 大 小 为 2 934 bp, 将 该 基 因 命 名 为 bgl,
GenBank 数据库登录号为 KP307454。其中 A :644
个、T :666 个、G :834 个、C :790 个,G+C 含 量
为 55.35%。该基因编码 860 个氨基酸和一个终止
密码子,以 ATG 为起始密码子,含有非编码序列。
BLAST 序列分析表明,该片段与数据库的 Aspergillus
niger(GenBank 登录号 JX982101.1)核苷酸序列有
着 99% 的相似性(表 1),由此可以确定 PCR 扩增
产物确实是 bgl 基因。
表 1 与部分微生物来源的纤维二糖酶基因相似性比较
基因登录号 菌株来源 一致性 /%
JX982101.1 Aspergillus niger 99
GQ337056.1 Aspergillus awamori 93
JN121997.1 Aspergillus aculeatus 78
XM 001212225.1 Aspergillus terreus 77
AP007150.1 Aspergillus oryzae 76
XM 002383199.1 Aspergillus flavus 76
2.2.2 纤维二糖酶基因的系统发生分析 Blastp 同
源性检索表明,黑曲霉 C112 菌株纤维二糖酶基因
与 黑 曲 霉(GenBank 登 录 号 :JX982101.1) 的 bgl1
具有很高的同源性。采用 Mega 4.0 软件(Neighbor-
Joining 法)对已报道的黑曲霉纤维二糖酶氨基酸序
列进行系统发生分析(图 2),该基因与其他 bgl 基
因聚类在一起,进一步表明克隆获得的基因确实为
bgl 基因。
2.2.3 纤维二糖酶的氨基酸序列分析 采用在线软
件对纤维二糖酶的氨基酸序列进行分析(http://web.
expasy.org/protparam/),结果显示,纤维二糖酶的蛋
白质理论分子量为 93.33 kD ;预测等电点为 4.70 ;
分子式为 C4153H6311N1117O1300S20 ;不稳定系数为 30.65,
是物理性质稳定的蛋白质 ;疏水性分析的 GRAVY
值为 -0.357,该蛋白为亲水蛋白。酸性氨基酸残基
总数(Asp+Glu)为 99,碱性氨基酸(Arg+Lys)为
64,表明其为酸性蛋白质。20 种氨基酸中甘氨酸(Gly)
含量最高,为 10.7%;丙氨酸(Ala)次之,为 9.07%。
利用 SignalP-NN 软件分析发现其 1-20 位氨基
酸为该蛋白信号肽序列(图 3)。C score :酶切位
5000
bp
3000
2000
M 1 2 3
M :DL5000 marker ;1-3 :纤维二糖酶基因
图 1 纤维二糖酶基因的 PCR 扩增电泳图
2016,32(2) 119朱永瑞等:黑曲霉 C112 纤维二糖酶基因的克隆与生物信息学分析
点 :数值越高说明其作为酶切位点的可能性越高 ;S
score :单氨基酸数值 :越高说明该氨基酸作为信号
肽部分的可能性越高;Y score:C 值和 S 值的派生值,
更准确地确定酶切位点,数值最高处为酶切位点。
2.2.4 纤维二糖酶的二级结构预测分析 通过国际
蛋白质生物学和化学研究所(PBIL)在线分析网站
对该基因进行蛋白质二级结构预测。分析结果(图
4)表明,该蛋白质富含无规卷曲(Random coil),
含量高达 60.35% ;其次为 α-螺旋(Alpha helix),含
量为 22.09%;而 β-折叠(Extended strand)含量最低,
只有 17.56%。
2.2.5 纤维二糖酶的三级结构预测分析 利用自动
比较蛋白建模服务器 SWISS-MODEL,与蛋白质数据
库中已知蛋白质的三级结构进行同源建模,从而预
测该蛋白的三级结构模型(图 5)。该蛋白的三级结
构与 Aspergillus aculeatus 的纤维二糖酶三级结构相
似,相似度为 83.10%,结果较可靠。
2.2.6 重组蛋白的诱导表达和 SDS-PAGE 分析 经
过优化条件,最终获得目的蛋白最优诱导表达条件
为 :30℃下用 1 mmol/L 的 IPTG 诱导表达 3 h,SDS-
PAGE 电泳(图 6)显示,表达产物的分子量为 93.3
kD。通过 Western blotting 对重组蛋白进行验证,获
得目的条带(图 7),再次说明表达的重组蛋白是纤
维素酶 Bgl。
2.2.7 不同发酵时间内重组纤维二糖酶的酶活 挑
选酶活最高的重组酵母菌再进行诱导培养,每隔 24
h 测定一次酶活,其产酶曲线见图 8。其纤维二糖酶
活在连续诱导的前 72 h 一直呈增长趋势,72 h 以后
便不再增长,呈缓慢下降趋势。
Aspergillus niger C112
Aspergillus nigergb|KJ866182.1
Aspergillus nigergb|JX982101.0Aspergillus nigergb|KJ739789.196
Aspergillus nigergb|JX127252.1Aspergillus kawachiidbj|AB003470.1
Aspergillus awamorigb|GQ337056.1
Paecilomyces sp.J18gb|HM998770.1Aspergillus aculeatusgb|JN121996.1Zymoseptoria tritici IPO323ref|XM_003853007.1
100
100
100
85
83
100
0.05
各分支数值代表置信度 /%
图 2 纤维二糖酶基因的系统发生进化树
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
Sc
or
e
0 10 20 30
Position
C score
S score
Y score
40 50 60 70
图 3 Bgl 蛋白信号肽分析
50
1 860
100 150 250 350 450 550 650 750 800700600500400300200
H E R
H :α-螺旋 ;E :β-折叠 ;R :无规卷曲
图 4 纤维二糖酶二级结构预测
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.2120
3 讨论
纤维二糖酶是纤维素彻底降解为单糖的一个瓶
颈[15],采用基因工程与蛋白质工程手段获得酶活较
高的纤维二糖酶已经成为研究热点[16]。国外许多研
究机构正致力于纤维二糖酶的分子生物学研究,从
94.0
kD
M 1 2
66.2
45.0
26.0
图 5 纤维二糖酶的三维结构预测图
M :蛋白分子量标记 marker ;1,2 :诱导 3 h 蛋白
图 6 重组质粒蛋白表达产物的 SDS-PAGE 鉴定
M 1
M :蛋白质分子量标记 Marker ;1 :重组蛋白
图 7 重组蛋白免疫印迹
2.2.8 温度和 pH 值对重组纤维二糖酶的影响 重
组后的菌株诱导 72 h 后,在不同温度反应条件下测
得酶活力。以温度值为横坐标,酶活力为纵坐标,
作出温度曲线(图 9),可以看出,纤维二糖酶的
最适温度为 50℃。在最适温度条件下(图 10),分
别在 pH4.0-7.0 条件下测定重组纤维二糖酶的活力,
该酶最适 pH 为 5.0。
6
5
4
3
2
1
0
䞦⍫U·mL-1
20 40 60 80 100ᰦ䰤h 120 140
图 8 重组纤维二糖酶酶活测定曲线
6
5
4
3
2
1
0
䞦⍫U·mL-1
30 40 50 60 70ᓖć 80 90
图 9 温度对重组纤维二糖酶的影响
6
7
5
4
3
2
1
0
䞦⍫U·mL-1
4 4.5 5 5.5 6.56
pH
7 7.5
图 10 pH 值对重组纤维二糖酶的影响
2016,32(2) 121朱永瑞等:黑曲霉 C112 纤维二糖酶基因的克隆与生物信息学分析
基础领域研究酶的催化机制及表达调控机制,以期
更好地改善纤维素酶的催化效率[17]。周晓明等[18]
克隆了 bgl 基因,与黑曲霉已知序列同源性达到了
99% ;王冰冰等[19]克隆了纤维二糖酶基因,并且实
现了在里氏木霉中的表达 ;朱龙宝等[20]在毕赤酵
母中成功分泌表达了纤维二糖酶,蛋白酶活力达到
38 U/mL。由于大肠杆菌表达系统遗传背景清楚、操
作手段较为成熟,并且大肠杆菌繁殖快、营养要求低,
表达的外源蛋白稳定、易纯化等特点,因此大肠杆
菌在基因表达技术中应用广泛[21]。本研究为了获取
高产量的重组纤维素酶,并进一步研究其酶学性质、
功能与结构,将克隆到的纤维素酶基因与表达载体
pEASY-T1 构建重组表达载体 pEASYT-bgl,并转化
大肠杆菌 BL21 得到了重组工程菌,实现了 bgl 基因
的胞内融合表达。
1974 年,Bause 等[22]提出纤维二糖酶活性位
点中的 Asp 是糖苷水解酶家族 3 的高度保守氨基酸,
作为该酶的催化亲和试剂,此位点以及周围的几个
氨基酸序列 GFVMSDW 等在糖苷水解酶家族 3 中也
是高度保守的。大多数微生物所产的 β-葡萄糖苷酶
也属于家族 3 的成员,糖苷水解酶家族 3 有 A 区和
B 区两个域构成,B 区包括 SDW 序列,内有活性为
点 Asp(D)残基。在分子水平上,糖苷水解酶家族
3 的编码基因有 5 个典型的区域构成 :N 端区、N 端
催化区、非同源区、C 端未知功能区和 C 端残基[23]。
本研究所得到的 bgl 的氨基酸序列也具有文献提到
这一特征,因此它属于糖苷水解酶家族 3 的成员。
本研究构建的工程菌酶活低于原菌株,可能因
为构建的重组菌的表达产物为胞内酶,而且本研究
仅在摇瓶做了初步实验,未对 IPTG 诱导浓度、金属
离子、温度、pH 值等影响目的基因表达的条件进行
优化,也是影响重组蛋白表达和酶活力的原因之一。
今后有必要对重组菌株的发酵条件进一步优化,为
该基因的工业应用奠定基础。
4 结论
本研究通过 RT-PCR 方法从菌株黑曲霉 C112
克 隆 了 纤 维 素 酶 基 因 bgl, 并 测 得 了 其 核 酸 序 列
(GenBank 登录号 KP307454)。序列分析表明 bgl 基
因大小为 2 934 bp,含有非编码序列,编码具有 860
个氨基酸分子的成熟纤维素酶,分子量大约为 93.3
kD ;二级结构以 α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲为结
构元件。该基因成功在大肠杆菌中进行了胞内融合
表达,重组蛋白 pNPG 酶活最大为 5.847 U/mL,最
适反应温度为 50℃,最适 pH 值为 5.0 ;并且初步探
索了诱导纤维素酶基因表达的条件,用 1 mmol/L 的
IPTG 诱导重组菌 3 h 后能够检测到目的蛋白。
参 考 文 献
[1] Foreman P, Brown D, Dankmeyer L, et al. Transcriptional regulation
of biomass-degrading enzymes in the filamentous fungus Trichoderma
reesei[J]. The Journal of Biological Chemistry, 2003, 278 :
31988-31997.
[2] Watanabe H, Tokuda G. Animal cellulases[J]. Cellular and
Molecular Life Sciences, 2001, 58(9):1167-1178.
[3] Dekker RFH. Kinetic, inhibition and stability properties of acomme-
rcial β-glucosidase(cellobiase)preparation from Aspergillus
niger and its suitability in the hydrolysis of lignocellulose[J].
Biotechnology and Bioengineering, 1986, 28(9):1438-1442.
[4]Nina A, Marja I, Anu S, et al. ACEI of Trichoderma reesei is a
repressor of cellulase and xylanase expression[J]. Applied and
Environmental Microbiology, 2003, 69(1):56-65.
[5]Imjongjirak C, Amparyup P, Sittipraneed S. Cloning, genomic
organization and expression of two glycosyl hydrolase family
10(GHF10)genes f rom golden apple snai l(Pomacea
canaliculata)[J]. Food Technology, 2008, 19(3):224-236.
[6]钟斐 , 叶秀云 , 李仁宽 , 等 . 长梗木霉 β- 葡萄糖苷酶基因的克
隆及表达[J]. 微生物学通报 , 2012, 39(8):1102-1111.
[7]Iwashita K, Nagahara T, Kimura H, et al. The bglA gene of
aspergillus kawachii encodes both extracellular and cell wall-bound
β-glucosidases[J]. Applied and Environmental Microbiology.
1999, 65(12):5546-5553.
[8]Dharmawardhana DP, Ellis BE, Carlson JE. cDNA cloning and
heterologous expression of coniferin β-glucosidase[J]. Plant
Molecular Biology, 1999, 40(8):365-372.
[9]Shen XL, Xia LM. Production and immobilization of cellobiase from
Aspergillus niger ZU-07[J]. Process Biochemistry, 2004, 39(11):
1363-1367.
[10]Seidle HF, Marten I, Shoseyov O, et al. Physical and kinetic
properties of the family 3 β-glucosidase from Aspergillus niger
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.2122
which is important for cellulose breakdown[J]. The Protein
Journal, 2004, 23(1):158-163.
[11]Dan S, Marton I , Dekel M, et al . Cloning, expression,
characterization and nucleophile identification of family 3,
Aspergillus niger β-glucosidase[J]. The Journal of Biologicai
Chemistry, 2000, 275(7):4973-4980.
[12]Pel HJ, de Winde JH, Archer DB, et al. Genome sequencing and
analysis of the versatile cell factory Aspergillus niger CBS 513.
88[J]. Biotechnol, 2007, 25(2):221-231.
[13]先天敏 , 陈介南 , 张林 . 黑曲霉改良株 C112 产 β- 葡萄糖苷
酶的诱导及条件优化[J]. 中南林业科技大学学报 , 2013, 33
(11):154-161.
[14]Takashima S, Nakamura A, Hidaka M, et al. Molecular cloningand
expression of the novel fungal β-glucosidase genes from Hu-micola
griseaand Trichoderma reesei[J]. J Biochem, 1999, 125(4):
728-736.
[15] Hong MR, Kim YS, Park CS, et al. Characterization of a recombin-
ant β-glucosidase from the thermophilic bacterium Caldicellulosir-
uptor saccharolyticus[J]. Journal of Bioscience and Bioenginee-
ring, 2009, 108(1):36-40.
[16] 孟宪文 , 宋小红 , 陈历俊 , 等 . β- 葡萄糖苷酶的研究进展[J].
中国乳业 , 2009(10):42-44.
[17]李泰明 , 庄舰峰 , Jean Louis Didier MEKOO, 等 . 黑曲霉 β- 葡
萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达[J]. 安徽医药 ,
2012, 16(5):576-578.
[18]周晓明 , 莫隽颖 , 陶冶 , 等 . 黑曲霉 β- 葡萄糖苷酶基因在大肠
杆菌中的克隆与表达[J]. 化学与生物工程 , 2010, 27(6):
50-53.
[19]王冰冰 , 夏黎明 , 杜风光 . 黑曲霉纤维二糖酶基因的克隆及
其在里氏木霉中的表达[J]. 化工学报 , 2011, 62(2):452-
457.
[20]朱龙宝 , 汤斌 , 陶玉贵 , 等 . 黑曲霉 β- 葡萄糖苷酶基因克隆及
在毕赤酵母中分泌表达[J]. 食品与生物技术学报 , 2012, 31
(9):973-977.
[21]王正祥 , 刘吉泉 , 诸葛健 , 等 . 微生物酶的分子改性和人工进
化的研究进展[J]. 生物工程学报 , 2000, 16 :301-303.
[22]Bause E, Legler G. Isolation and amino acid sequence of a
hexadecapeptide from the active site of beta-glucosidase A3
from Aspergillus wentii[J]. Hoppe-Seyler’s Zeitschrift
fur Physiologische Chemie, 1974, 355(4):438-442.
[23]Li YK, Chir FY. Catalytic mechanism of a family 3 β-glucosidase
and mutageneais study on residue Asp-247[J]. The Biochemical
Journal, 2001, 355(3):835-840.
(责任编辑 李楠)