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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(2):116-122
纤维二糖酶又称为 β-葡萄糖苷酶［1］，能够水解
纤维二糖产生两分子的葡萄糖［2］，并能极大地促进
内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的水解作用，加快纤
维素酶系的整体水解速度，促使纤维素的水解更完
全［3］。现在对真菌中纤维二糖酶产生菌研究较多的
是丝状真菌，主要为曲霉属和木霉属［4］，而细菌中
研究较多的是芽孢杆菌属［5，6］。
黑曲霉（Aspergillus niger）是纤维二糖酶的高
产菌株［7，8］，但是关于黑曲霉纤维二糖酶基因的研
究报道仍然较少［9，10］。2000 年，美国 Dan 等［11］研
究者在 GenBank 上登录了第一个黑曲霉纤维二糖酶
的全基因序列。2007 年，荷兰工业化学公司首次完
成了对一株黑曲霉的全基因组测序，该黑曲霉基因
组有 3 390 万个碱基对，并且构成超过 14 000 个独
收稿日期 ：2015-04-30
基金项目 ：湖南省教育厅科学研究重点项目（13A123），中南林业科技大学研究生科技创新基金项目（CX2014B30）
作者简介 ：朱永瑞，男，硕士研究生，研究方向 ：微生物方面的基因克隆与表达研究 ；E-mail ：1006398396@qq.com
通讯作者 ：曾柏全，博士，教授，研究方向 ：生物资源利用与分子技术 ；E-mail ：baiquanzhn@163.com
黑曲霉 C112 纤维二糖酶基因的克隆与生物信息学分析
朱永瑞  曾柏全  曾磊  刘辉 
（中南林业科技大学 生命科学与技术学院，长沙 410004）
摘 要 ： 以紫外诱变获得的高产纤维素酶黑曲霉 C112 菌株为模板，采用 RT-PCR 技术克隆黑曲霉 C112 的纤维二糖酶基因
bgl（GenBank 登录号 ：KP307454）；该基因全长 2 934 bp，含有非编码序列，编码 860 个氨基酸，等电点为 4.70，核酸序列与数据
库的 Aspergillus niger（GenBank 登录号 JX982101.1）同源性达到了 99% ；生物信息学分析表明，纤维二糖酶为具有一定亲水性的稳
定酸性分泌蛋白；二级结构以 α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲为结构元件；该基因经 IPTG 诱导重组蛋白表达，SDS-PAGE 检测结果表明，
重组表达产物的相对分子量约为 93.3 kD，与预期相符；纤维二糖酶在大肠杆菌 BL21 中胞内融合表达，重组蛋白 pNPG 酶活为 5.847
U/mL，最适反应温度为 50℃，最适 pH 值为 5.0。
关键词 ： 黑曲霉 C112 ；纤维二糖酶 ；克隆 ；生物信息学
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.015
Cloning and Bioinformatics Analysis of Cellobiase Gene from
Aspergillus niger C112
ZHU Yong-rui ZENG Bai-quan ZENG Lei LIU Hui
（College of Life Science and Technology，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004）
Abstract: The cellobiase gene（GenBank accession number ：KP307454）was cloned by RT-PCR from high-yield cellulase Aspergillus
niger strain C112 mutated by UV. The whole length of cellobiase was 2 934 bp containing non-coding sequence, and encoding 860 amino acids
with the pI of 4.70. The homology of nucleotide sequence with Aspergillus niger（GenBank accession number ：JX982101.1）reached 99%.
Bioinformatics analysis showed that cellobiase was a hydrophilic, stable, and secreted protein ；its secondary structure consisted of the structural
elements of α-helix, β-folding and random coil. As expected, recombinant fusion protein was expressed after IPTG induction, and the relative
molecular mass was approximately 93.3 kD by SDS-PAGE. The fused β-Glucosidase was expressed in Escherichia coli BL21. The enzyme activity
of recombinant protein pNPG was 5.847 U/mL, the optimal reaction temperature was 50℃, and the optimal reaction pH was 5.0.
Key words: Aspergillus niger C112 ；cellobiase ；cloning ；bioinformatics
2016,32(2) 117朱永瑞等：黑曲霉 C112 纤维二糖酶基因的克隆与生物信息学分析
特的基因，其中编码纤维二糖酶的基因已被完全确
定［12］。国内 2006 年首次出现关于黑曲霉纤维二糖
酶基因克隆研究的报道。
本研究通过参照 GenBank 上已发表的黑曲霉纤
维二糖酶基因序列（登录号 ：AJ132386）设计引物，
实验菌株是经过紫外诱变筛选获得的高产纤维素酶
黑曲霉菌，以此菌株总 RNA 为模板克隆了纤维二糖
酶的基因，进行基因序列测序。国内外对该基因生
物学信息还未见报道，因此本研究对该基因进行初
步的生物信息学分析，以更好地了解纤维二糖酶的
功能性质，并且实现该基因在大肠杆菌 BL21 中胞
内融合表达。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌 株 与 质 粒 黑 曲 霉（Aspergillus niger）
C112［13］，保存于中南林业科技大学发酵工程实验室。
大 肠 杆 菌 DH5α、BL21（DE3），pEASY-T1 购 自 北
京全式金生物技术有限公司。
1.1.2 酶与试剂 总 RNA 提取试剂（Trigol）、焦碳
酸二乙酯（DEPC），北京鼎国昌盛生物技术有限公司；
普通琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒、质粒小提试剂盒，
北京天根公司 ；M-MLV 逆转录试剂、EasyTaq PCR
SuperMix，北京全式金生物公司 ；其它试剂均为国
产分析纯。
1.1.3 培养基 PDA 培养基 ：马铃薯 200 g/L（将
马铃薯切成方块，置于 1 000 mL 水中煮沸，过滤收
集液体，即得），葡萄糖 20 g/L，琼脂粉 15 g/L。纤
维素酶诱导培养基 ：蛋白胨 10 g/L，麦芽糖 4 g/L，
MgSO4 0.5 g/L，KH2PO4 1 g/L。LB 液 体 培 养 基 ：胰
蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，加入去离
子水 950 mL，用 10 mol/L NaOH 调 pH 值至 7.0，加
去离子水定容 1 L。LB 固体培养基 ：配方和液体培
养基一样，并加入 15 g 琼脂粉。所配的培养基均在
1×105 Pa 灭菌 20 min，4℃保存备用。
1.2 方法
1.2.1 引物设计 参照 GenBank 上已发表的黑曲霉
纤维二糖酶（bgl1）基因序列（GenBank 登录号为
AJ132386），利用 Primer premier 5.0 设计引物，引物
序列为上游引物 P1 ：5-CGGAATTCATGAGGTTCACT
TTGATCGAGGCGG-3，下游引物P2：5-ATGCGGCCGC
TTAGTGAACAGTAGGCAGAGACG-3， 由 苏 州 金 唯
智生物科技有限公司合成。为了便于与载体连接，
在引物中加入酶识别位点，bgl1 的引物中加入了
EcoR I 和 Not I 位点（引物中的划线部分）。
1.2.2 黑曲霉 C112 的复苏和保藏 从真空冻干菌
管中用接种环刮下少量细胞接于 PD 液体培养基，
30℃培养 24 h，用接种环从培养液中蘸取少量菌液
画线于 PDA 斜面，30℃静置培养到长出孢子，于 4℃
保存。
1.2.3 黑曲霉 C112 总 RNA 提取及 cDNA 的合成
总 RNA 的提取方法参照北京鼎国昌盛生物技术有限
公司的 Trigol 试剂盒的说明。cDNA 的合成按照北京
全式金生物公司的 RT-PCR 试剂盒说明书操作。
1.2.4 纤维二糖酶基因的测序及系统发生分析 将
PCR 产物回收纯化后，克隆到 pEASY-T1 载体中，
转化大肠杆菌 DH5α，经蓝白斑筛选重组子，挑取
经菌落 PCR 验证的阳性克隆子进行序列测定。利用
Blast 工具进行序列相似性分析，选取部分同源序列，
利用 Clustal X 软件包进行序列同源进化比对，形成
一个多重序列匹配排列矩阵，构建系统发育进化树。
1.2.5 测序及序列的生物信息学分析 测序结果
采用在线软件对纤维二糖酶基因氨基酸序列进行
物 理 性 质（http://web.expasy.org/protparam/）、 二 级
结 构（http://npsa-pbil.Ibcp.fr/cgi-bin/npsa-auomat.
pl/page=/NPSA/npsa-hnn.html）、 三 级 结 构（http://
swissmodel.expasy.org/SWISS -MODEL.html）及信号肽
（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0）等信息的
预测分析，氨基酸序列同源比对用 Blast 在线工具和
DNAMAN8.0 软件完成。
1.2.6 纤维二糖酶的诱导表达验证 将阳性重组
子接种到新鲜含有相应抗体的液体 LB 培养基中，
37℃、200 r/min 过夜培养，以 1% 的比例接种到 30
mL 抗性 LB 液体培养基，37℃、200 r/min 培养细菌
生长到对数生长期后（OD600=0.4-0.5），加入终浓度
为 1 mmol/L 的 IPTG 诱导目的基因表达，30℃诱导 3
h，取 1 mL 菌液，4℃、12 000 r/min 离心 2 min，收
集菌体，用 PBS 缓冲液（pH7.0）洗涤沉淀，并溶于
500 μL 相同缓冲液中。超声破碎细胞 ：功率 200 W，
超声 2 s 间隔 4 s，共 60 次。4℃、12 000 r/min 离心
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.2118
30 min，得到上清液即粗酶液。取适量菌液做诱导
表达效果的检测，实验以未加 IPTG 诱导为对照，并
运用 Western blotting 技术对重组蛋白进行验证。
1.2.7 纤维二糖酶的酶活检测 采用国际通用的方
法测定纤维二糖酶的活力［14］：取 0.1 mL 稀释了适
当倍数的粗酶液（对照管不加），加入 1 mL pH4.8
的 0.05 mol/L 柠檬酸缓冲溶液，于 50℃水浴预热 10
min ；加入已预热 10 min 的 0.9 mL 5 mmol/L pNPG 溶
液，计时，10 min 后立即加入 1 mL 1 mol/L Na2CO3
溶液终止反应 ；加入蒸馏水定容到 25 mL ；室温放
置 5 min，于 410 nm 处测吸光度值 A。在上述条件下，
1 mL 酶液 1 min 水解产生 1 μmol 的对硝基苯酚的酶
活力，定义为一个酶活单位（U）。
1.2.8 重组酶学性质的初步研究
1.2.8.1 温度对酶活力的影响 粗酶液在不同温度
下（30、40、50、60、70、80℃） 保 温 30 min 后，
按照 1.2.7 中的方法测定酶活。
1.2.8.2 pH 对酶活力的影响 粗酶液分别在不同 pH
值的醋酸缓冲液条件下（pH4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、
6.5、7.0）室温处理 30 min 后，按照 1.2.7 中的方法
测定酶活。
2 结果
2.1 纤维二糖酶基因的克隆
利用所设计的引物，以黑曲霉菌株的 cDNA 为
模板进行 PCR 扩增，电泳结果（图 1）显示扩增片
段约为 2 900 bp 左右，与预期相符。
2.2 纤维二糖酶的生物信息学分析
2.2.1 纤维二糖酶基因的序列分析 纤维二糖酶
基 因 片 段 大 小 为 2 934 bp， 将 该 基 因 命 名 为 bgl，
GenBank 数据库登录号为 KP307454。其中 A ：644
个、T ：666 个、G ：834 个、C ：790 个，G+C 含 量
为 55.35%。该基因编码 860 个氨基酸和一个终止
密码子，以 ATG 为起始密码子，含有非编码序列。
BLAST 序列分析表明，该片段与数据库的 Aspergillus
niger（GenBank 登录号 JX982101.1）核苷酸序列有
着 99% 的相似性（表 1），由此可以确定 PCR 扩增
产物确实是 bgl 基因。
表 1 与部分微生物来源的纤维二糖酶基因相似性比较
基因登录号 菌株来源 一致性 /%
JX982101.1 Aspergillus niger 99
GQ337056.1 Aspergillus awamori 93
JN121997.1 Aspergillus aculeatus 78
XM 001212225.1 Aspergillus terreus 77
AP007150.1 Aspergillus oryzae 76
XM 002383199.1 Aspergillus flavus 76
2.2.2 纤维二糖酶基因的系统发生分析 Blastp 同
源性检索表明，黑曲霉 C112 菌株纤维二糖酶基因
与 黑 曲 霉（GenBank 登 录 号 ：JX982101.1） 的 bgl1
具有很高的同源性。采用 Mega 4.0 软件（Neighbor-
Joining 法）对已报道的黑曲霉纤维二糖酶氨基酸序
列进行系统发生分析（图 2），该基因与其他 bgl 基
因聚类在一起，进一步表明克隆获得的基因确实为
bgl 基因。
2.2.3 纤维二糖酶的氨基酸序列分析 采用在线软
件对纤维二糖酶的氨基酸序列进行分析（http://web.
expasy.org/protparam/），结果显示，纤维二糖酶的蛋
白质理论分子量为 93.33 kD ；预测等电点为 4.70 ；
分子式为 C4153H6311N1117O1300S20 ；不稳定系数为 30.65，
是物理性质稳定的蛋白质 ；疏水性分析的 GRAVY
值为 -0.357，该蛋白为亲水蛋白。酸性氨基酸残基
总数（Asp+Glu）为 99，碱性氨基酸（Arg+Lys）为
64，表明其为酸性蛋白质。20 种氨基酸中甘氨酸（Gly）
含量最高，为 10.7%；丙氨酸（Ala）次之，为 9.07%。
利用 SignalP-NN 软件分析发现其 1-20 位氨基
酸为该蛋白信号肽序列（图 3）。C score ：酶切位
5000
bp
3000
2000
M 1 2 3
M ：DL5000 marker ；1-3 ：纤维二糖酶基因
图 1 纤维二糖酶基因的 PCR 扩增电泳图
2016,32(2) 119朱永瑞等：黑曲霉 C112 纤维二糖酶基因的克隆与生物信息学分析
点 ：数值越高说明其作为酶切位点的可能性越高 ；S
score ：单氨基酸数值 ：越高说明该氨基酸作为信号
肽部分的可能性越高；Y score：C 值和 S 值的派生值，
更准确地确定酶切位点，数值最高处为酶切位点。
2.2.4 纤维二糖酶的二级结构预测分析 通过国际
蛋白质生物学和化学研究所（PBIL）在线分析网站
对该基因进行蛋白质二级结构预测。分析结果（图
4）表明，该蛋白质富含无规卷曲（Random coil），
含量高达 60.35％ ；其次为 α-螺旋（Alpha helix），含
量为 22.09％；而 β-折叠（Extended strand）含量最低，
只有 17.56％。
2.2.5 纤维二糖酶的三级结构预测分析 利用自动
比较蛋白建模服务器 SWISS-MODEL，与蛋白质数据
库中已知蛋白质的三级结构进行同源建模，从而预
测该蛋白的三级结构模型（图 5）。该蛋白的三级结
构与 Aspergillus aculeatus 的纤维二糖酶三级结构相
似，相似度为 83.10%，结果较可靠。
2.2.6 重组蛋白的诱导表达和 SDS-PAGE 分析 经
过优化条件，最终获得目的蛋白最优诱导表达条件
为 ：30℃下用 1 mmol/L 的 IPTG 诱导表达 3 h，SDS-
PAGE 电泳（图 6）显示，表达产物的分子量为 93.3
kD。通过 Western blotting 对重组蛋白进行验证，获
得目的条带（图 7），再次说明表达的重组蛋白是纤
维素酶 Bgl。
2.2.7 不同发酵时间内重组纤维二糖酶的酶活 挑
选酶活最高的重组酵母菌再进行诱导培养，每隔 24
h 测定一次酶活，其产酶曲线见图 8。其纤维二糖酶
活在连续诱导的前 72 h 一直呈增长趋势，72 h 以后
便不再增长，呈缓慢下降趋势。
Aspergillus niger C112
Aspergillus nigergb|KJ866182.1
Aspergillus nigergb|JX982101.0Aspergillus nigergb|KJ739789.196
Aspergillus nigergb|JX127252.1Aspergillus kawachiidbj|AB003470.1
Aspergillus awamorigb|GQ337056.1
Paecilomyces sp.J18gb|HM998770.1Aspergillus aculeatusgb|JN121996.1Zymoseptoria tritici IPO323ref|XM_003853007.1
100
100
100
85
83
100
0.05
各分支数值代表置信度 /%
图 2 纤维二糖酶基因的系统发生进化树
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
Sc
or
e
0 10 20 30
Position
C score
S score
Y score
40 50 60 70
图 3 Bgl 蛋白信号肽分析
50
1 860
100 150 250 350 450 550 650 750 800700600500400300200
H E R
H ：α-螺旋 ；E ：β-折叠 ；R ：无规卷曲
图 4 纤维二糖酶二级结构预测
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.2120
3 讨论
纤维二糖酶是纤维素彻底降解为单糖的一个瓶
颈［15］，采用基因工程与蛋白质工程手段获得酶活较
高的纤维二糖酶已经成为研究热点［16］。国外许多研
究机构正致力于纤维二糖酶的分子生物学研究，从
94.0
kD
M 1 2
66.2
45.0
26.0
图 5 纤维二糖酶的三维结构预测图
M ：蛋白分子量标记 marker ；1，2 ：诱导 3 h 蛋白
图 6 重组质粒蛋白表达产物的 SDS-PAGE 鉴定
M 1
M ：蛋白质分子量标记 Marker ；1 ：重组蛋白
图 7 重组蛋白免疫印迹
2.2.8 温度和 pH 值对重组纤维二糖酶的影响 重
组后的菌株诱导 72 h 后，在不同温度反应条件下测
得酶活力。以温度值为横坐标，酶活力为纵坐标，
作出温度曲线（图 9），可以看出，纤维二糖酶的
最适温度为 50℃。在最适温度条件下（图 10），分
别在 pH4.0-7.0 条件下测定重组纤维二糖酶的活力，
该酶最适 pH 为 5.0。
6
5
4
3
2
1
0
䞦⍫U·mL-1 
20 40 60 80 100ᰦ䰤h 120 140
图 8 重组纤维二糖酶酶活测定曲线
6
5
4
3
2
1
0
䞦⍫U·mL-1 
30 40 50 60 70⑙ᓖć 80 90
图 9 温度对重组纤维二糖酶的影响
6
7
5
4
3
2
1
0
䞦⍫U·mL-1 
4 4.5 5 5.5 6.56
pH
7 7.5
图 10 pH 值对重组纤维二糖酶的影响
2016,32(2) 121朱永瑞等：黑曲霉 C112 纤维二糖酶基因的克隆与生物信息学分析
基础领域研究酶的催化机制及表达调控机制，以期
更好地改善纤维素酶的催化效率［17］。周晓明等［18］
克隆了 bgl 基因，与黑曲霉已知序列同源性达到了
99% ；王冰冰等［19］克隆了纤维二糖酶基因，并且实
现了在里氏木霉中的表达 ；朱龙宝等［20］在毕赤酵
母中成功分泌表达了纤维二糖酶，蛋白酶活力达到
38 U/mL。由于大肠杆菌表达系统遗传背景清楚、操
作手段较为成熟，并且大肠杆菌繁殖快、营养要求低，
表达的外源蛋白稳定、易纯化等特点，因此大肠杆
菌在基因表达技术中应用广泛［21］。本研究为了获取
高产量的重组纤维素酶，并进一步研究其酶学性质、
功能与结构，将克隆到的纤维素酶基因与表达载体
pEASY-T1 构建重组表达载体 pEASYT-bgl，并转化
大肠杆菌 BL21 得到了重组工程菌，实现了 bgl 基因
的胞内融合表达。
1974 年，Bause 等［22］提出纤维二糖酶活性位
点中的 Asp 是糖苷水解酶家族 3 的高度保守氨基酸，
作为该酶的催化亲和试剂，此位点以及周围的几个
氨基酸序列 GFVMSDW 等在糖苷水解酶家族 3 中也
是高度保守的。大多数微生物所产的 β-葡萄糖苷酶
也属于家族 3 的成员，糖苷水解酶家族 3 有 A 区和
B 区两个域构成，B 区包括 SDW 序列，内有活性为
点 Asp（D）残基。在分子水平上，糖苷水解酶家族
3 的编码基因有 5 个典型的区域构成 ：N 端区、N 端
催化区、非同源区、C 端未知功能区和 C 端残基［23］。
本研究所得到的 bgl 的氨基酸序列也具有文献提到
这一特征，因此它属于糖苷水解酶家族 3 的成员。
本研究构建的工程菌酶活低于原菌株，可能因
为构建的重组菌的表达产物为胞内酶，而且本研究
仅在摇瓶做了初步实验，未对 IPTG 诱导浓度、金属
离子、温度、pH 值等影响目的基因表达的条件进行
优化，也是影响重组蛋白表达和酶活力的原因之一。
今后有必要对重组菌株的发酵条件进一步优化，为
该基因的工业应用奠定基础。
4 结论
本研究通过 RT-PCR 方法从菌株黑曲霉 C112
克 隆 了 纤 维 素 酶 基 因 bgl， 并 测 得 了 其 核 酸 序 列
（GenBank 登录号 KP307454）。序列分析表明 bgl 基
因大小为 2 934 bp，含有非编码序列，编码具有 860
个氨基酸分子的成熟纤维素酶，分子量大约为 93.3
kD ；二级结构以 α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲为结
构元件。该基因成功在大肠杆菌中进行了胞内融合
表达，重组蛋白 pNPG 酶活最大为 5.847 U/mL，最
适反应温度为 50℃，最适 pH 值为 5.0 ；并且初步探
索了诱导纤维素酶基因表达的条件，用 1 mmol/L 的
IPTG 诱导重组菌 3 h 后能够检测到目的蛋白。
参 考 文 献
［1］ Foreman P, Brown D, Dankmeyer L, et al. Transcriptional regulation
of biomass-degrading enzymes in the filamentous fungus Trichoderma
reesei［J］. The Journal of Biological Chemistry, 2003, 278 ：
31988-31997.
［2］ Watanabe H, Tokuda G. Animal cellulases［J］. Cellular and
Molecular Life Sciences, 2001, 58（9）：1167-1178.
［3］ Dekker RFH. Kinetic, inhibition and stability properties of acomme-
rcial β-glucosidase（cellobiase）preparation from Aspergillus
niger and its suitability in the hydrolysis of lignocellulose［J］.
Biotechnology and Bioengineering, 1986, 28（9）：1438-1442.
［4］Nina A, Marja I, Anu S, et al. ACEI of Trichoderma reesei is a
repressor of cellulase and xylanase expression［J］. Applied and
Environmental Microbiology, 2003, 69（1）：56-65.
［5］Imjongjirak C, Amparyup P, Sittipraneed S. Cloning, genomic
organization and expression of two glycosyl hydrolase family
10（GHF10）genes f rom golden apple snai l（Pomacea
canaliculata）［J］. Food Technology, 2008, 19（3）：224-236.
［6］钟斐 , 叶秀云 , 李仁宽 , 等 . 长梗木霉 β- 葡萄糖苷酶基因的克
隆及表达［J］. 微生物学通报 , 2012, 39（8）：1102-1111.
［7］Iwashita K, Nagahara T, Kimura H, et al. The bglA gene of
aspergillus kawachii encodes both extracellular and cell wall-bound
β-glucosidases［J］. Applied and Environmental Microbiology.
1999, 65（12）：5546-5553.
［8］Dharmawardhana DP, Ellis BE, Carlson JE. cDNA cloning and
heterologous expression of coniferin β-glucosidase［J］. Plant
Molecular Biology, 1999, 40（8）：365-372.
［9］Shen XL, Xia LM. Production and immobilization of cellobiase from
Aspergillus niger ZU-07［J］. Process Biochemistry, 2004, 39（11）：
1363-1367.
［10］Seidle HF, Marten I, Shoseyov O, et al. Physical and kinetic
properties of the family 3 β-glucosidase from Aspergillus niger
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.2122
which is important for cellulose breakdown［J］. The Protein
Journal, 2004, 23（1）：158-163.
［11］Dan S, Marton I , Dekel M, et al . Cloning, expression,
characterization and nucleophile identification of family 3,
Aspergillus niger β-glucosidase［J］. The Journal of Biologicai
Chemistry, 2000, 275（7）：4973-4980.
［12］Pel HJ, de Winde JH, Archer DB, et al. Genome sequencing and
analysis of the versatile cell factory Aspergillus niger CBS 513.
88［J］. Biotechnol, 2007, 25（2）：221-231.
［13］先天敏 , 陈介南 , 张林 . 黑曲霉改良株 C112 产 β- 葡萄糖苷
酶的诱导及条件优化［J］. 中南林业科技大学学报 , 2013, 33
（11）：154-161.
［14］Takashima S, Nakamura A, Hidaka M, et al. Molecular cloningand
expression of the novel fungal β-glucosidase genes from Hu-micola
griseaand Trichoderma reesei［J］. J Biochem, 1999, 125（4）：
728-736.
［15］ Hong MR, Kim YS, Park CS, et al. Characterization of a recombin-
ant β-glucosidase from the thermophilic bacterium Caldicellulosir-
uptor saccharolyticus［J］. Journal of Bioscience and Bioenginee-
ring, 2009, 108（1）：36-40.
［16］ 孟宪文 , 宋小红 , 陈历俊 , 等 . β- 葡萄糖苷酶的研究进展［J］.
中国乳业 , 2009（10）：42-44.
［17］李泰明 , 庄舰峰 , Jean Louis Didier MEKOO, 等 . 黑曲霉 β- 葡
萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达［J］. 安徽医药 ,
2012, 16（5）：576-578.
［18］周晓明 , 莫隽颖 , 陶冶 , 等 . 黑曲霉 β- 葡萄糖苷酶基因在大肠
杆菌中的克隆与表达［J］. 化学与生物工程 , 2010, 27（6）：
50-53.
［19］王冰冰 , 夏黎明 , 杜风光 . 黑曲霉纤维二糖酶基因的克隆及
其在里氏木霉中的表达［J］. 化工学报 , 2011, 62（2）：452-
457.
［20］朱龙宝 , 汤斌 , 陶玉贵 , 等 . 黑曲霉 β- 葡萄糖苷酶基因克隆及
在毕赤酵母中分泌表达［J］. 食品与生物技术学报 , 2012, 31
（9）：973-977.
［21］王正祥 , 刘吉泉 , 诸葛健 , 等 . 微生物酶的分子改性和人工进
化的研究进展［J］. 生物工程学报 , 2000, 16 ：301-303.
［22］Bause E, Legler G. Isolation and amino acid sequence of a
hexadecapeptide from the active site of beta-glucosidase A3
from Aspergillus wentii［J］. Hoppe-Seyler’s Zeitschrift
fur Physiologische Chemie, 1974, 355（4）：438-442.
［23］Li YK, Chir FY. Catalytic mechanism of a family 3 β-glucosidase
and mutageneais study on residue Asp-247［J］. The Biochemical
Journal, 2001, 355（3）：835-840.
（责任编辑 李楠）