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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(6):47-53
核酸体外扩增是分子生物学、遗传学、医学等
研究领域最常用的技术之一。其中聚合酶链式反应
（polymerase chain reaction，PCR）以及在此基础上发
展的多重 PCR、单分子 PCR、实时荧光定量 PCR 等
技术使用最为广泛，但这些技术均依赖于控温准确
的热循环仪器，限制了其在临床现场检测中的应用。
核酸恒温扩增技术由于不需反复热变性，无需特殊
仪器，反应速度更快，适合现场快速检测，在生命
科学研究及相关诸多领域已经得到了广泛应用。
目前已有 10 余种核酸恒温扩增技术，其中重组
酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，
RPA）是 2006 年由英国公司 TwistDx Inc 研发的一种
核酸恒温扩增技术［1］。RPA 技术使用重组酶与引物
结合形成的复合物能在模板上寻找同源序列，定位
后就会引发链交换反应并启动 DNA合成，对模板上
的目标区域进行指数式扩增。RPA 技术可以在 25-
42℃恒温条件下快速完成核酸扩增，产物可以通过
探针法荧光定量进行实时监测，也可以与侧流层析
试纸条、生物芯片、凝胶电泳等多种方法相结合进
行检测［2-4］。目前基于 RPA 技术建立的检测方法在
收稿日期：2015-08-31
作者简介：景志刚，男，硕士，研究方向：人畜共患病流行病学；E-mail ：damonjing@126.com
通讯作者：范伟兴，男，博士，研究员，研究方向：人畜共患病流行病学；E-mail ：fwxsjl@126.com
重组酶聚合酶扩增技术研究进展
景志刚1  董浩2  狄栋栋1  田莉莉1  范伟兴1
（1. 中国动物卫生与流行病学中心，青岛  266032 ；2. 中国动物疫病预防控制中心，北京  102600）
摘 要： 重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA）技术是一种新兴的核酸恒温扩增技术，具有灵敏度高、
特异性强、反应快速等特点。利用 RPA 技术可以对核酸拷贝数进行绝对定量并且可以同时检测多个靶标核酸序列，结合侧流层析
试纸条或荧光信号监测装置等简易实验设备即可直接观察检测结果。就 RPA 技术的原理、发展、技术特点及其近年来在体外诊断、
病原检测等领域的研究进展作一综述，旨在为该技术的深入研究和应用提供参考。 
关键词 ： 重组酶聚合酶扩增技术 ；核酸恒温扩增 ；核酸检测
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.008
Research Progress on Recombinase Polymerase Amplification
JING Zhi-gang1  DONG Hao2  DI Dong-dong1  TIAN Li-li1  FAN Wei-xing1
（1. Laboratory of Zoonoses，China Animal Health & Epidemiology Center，Qingdao 266032；2. China Animal Disease Prevention and Control
Center，Beijing 102600）
Abstract:  Recombinase Polymerase Amplification（RPA）is a recently developed isothermal amplification method that offers highly 
sensitive and specific DNA and RNA detection. Using RPA，the initial copy number of target nucleic acid sequence from different samples can 
be absolutely quantified，and multiple target nucleic acid sequences can also be detected simultaneously. Combining with less complicated 
device such as lateral flow strips or a sequence-specific fluorescent probe，the results can be observed directly. This article summarized the 
fundamental principles，continuous development and technical  features of RPA. In addition，research and application progress of RPA in 
the  field of  in vitro diagnostic，pathogen detection and so  forth were reviewed，aiming at providing guidance for  further development and 
application of this method.
Key words:  recombinase polymerase amplification ；nucleic acid isothermal amplification technologies ；nucleic acid detection
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.648
疾病诊断、食品安全检测、转基因作物检测、病原
学检测等多个领域的应用越来越广泛。现就 RPA 技
术的发展及其当前应用研究进展作一介绍。
1 RPA 技术的原理
RPA 技术包括 3 种关键组分，分别是重组酶
（如 T4 uvsX、E.coli recA 等）、单链结合蛋白（如 T4 
gp32 等）和链置换 DNA聚合酶（如 B. subtilis Pol I、
S. aureus Pol 等）。RPA 技术的原理，见图 1［5］：a. 
重组酶与长约 30-35 nt 的引物结合形成的复合物在
双链 DNA模板中寻找靶位点；b. 复合物在模板上定
位后可以直接引发链交换反应形成 D-Loop 结构，单
链结合蛋白随即结合被置换的 DNA链，稳定形成的
D-Loop 结构并且防止引物解离；c. 重组酶 - 引物复
合物主动水解体系中的 ATP 导致复合物构象改变，
重组酶解离后引物 3 端暴露并被 DNA聚合酶识别，
DNA聚合酶按照模板序列在引物 3 末端添加相应碱
基，DNA 扩增启动；d. 链置换 DNA 聚合酶在延伸
引物的同时继续解开模板的双螺旋 DNA结构，DNA
合成过程继续进行；e. 两条引物扩增完成即形成一
个完整的扩增子。RPA 扩增体系中还含有 T4 uvsY
和 Carbowax20M 等成分，可以改变重组酶 - 引物复
合体解离及重新结合的可逆反应过程，使反应向更
有利于 RPA的进行［1］。同时，RPA体系中可以加入
反转录酶将 RNA作为模板合成 DNA后再进行扩增，
使 RPA 可以同时应用于 RNA 的检测［6，7］。按照上
述体系建立的 RPA反应体系一般称为 Basic-RPA。
图 1 RPA 反应的原理示意图
2 RPA 技术的发展
最初使用的 RPA技术，即 Basic-RPA 的反应条
件一般为 37-39℃恒温 20-40 min，然后通过琼脂糖
凝胶电泳检测扩增产物。Basic-RPA反应具有很高的
敏感性，Rohrman 等［8］建立的 Basic-RPA 方法可以
检测低至 10 拷贝的 HIV 病毒核酸。Basic-RPA 的缺
点是反应体系中存在一些可能影响 DNA在琼脂糖凝
胶中迁移的物质，可能导致电泳结果出现抹带等现
象，因此扩增产物一般需要纯化后才可以进行电泳
检测［9］。尽管如此，Basic-RPA 仍有很大的实用价
2016,32(6) 49景志刚等：重组酶聚合酶扩增技术研究进展
值，利用 RPA可以常温扩增的特点与生物芯片结合，
研究者建立了 on-chip RPA 检测方法，可以在 20 min
内特异性检测淋病奈瑟氏菌、沙门氏菌和耐甲氧西
林金黄色葡萄球菌［2］。Sara Santiago-Felipe 等［10］基
于 Basic-RPA 建立的 disc-based RPA 技术可以高灵
敏度检测多种病原体。
在 Basic-RPA 基础上，Piepenburg 等［1］利用序
列特异性荧光探针建立了可以实时监测荧光信号判
断产物扩增情况的探针法 RPA 以及可以直接肉眼观
察最终扩增结果的侧流层析试纸条 RPA（lateral flow 
RPA，LF-RPA）。
2.1  探针法RPA
与 Basic-RPA 的反应体系相比，探针法 RPA 体
系中一般含有核酸外切酶 III（exonuclease III，即
exo）和 exo 荧光探针（根据酶的名称命名为 exo 探
针），通过检测荧光信号实时监测 RPA 产物的扩增
情况。exo 探针含有一个碱基模拟物四氢呋喃分子
（tetrahydrofuran，THF），THF 分子两侧分别带有荧
光基团和淬灭基团，探针 3 端带有防止探针延伸的
阻断物。当探针与靶 DNA 结合形成双链杂合 DNA
结构后，exo III 作为一种 DNA 修复酶，识别 THF
位点并切割探针使荧光基团和淬灭基团分离从而产
生荧光［11，12］。用 exo 探针的 RPA 反应不能使用凝
胶电泳等方法进行终点定量，一般使用可以实时收
集荧光信号的装置（如荧光定量 PCR 仪、ESEQuant 
Tube Scanner device、Twista® 等）监测反应情况。此 
外，exo 探针法 RPA 反应速度更快，一般在 20 min
内即可完成检测，灵敏度和特异性均很高［13-15］。
2.2  侧流层析试纸条RPA 
与 Basic-RPA 的反应体系相比，LF-RPA 体系中
加入了核酸外切酶 IV（endonuclease IV，即 nfo）和
nfo 探针（根据酶的名称命名为 nfo 探针），而且在
反应中使用带有生物素或者地高辛等标记物的反向
引物［16，17］。nfo 探针的 5 末端带有荧光基团，3 端
带有阻断物，探针序列中也带有一个 THF 分子。随
着反应的进行，剪切后的探针与下游引物形成既带
有探针荧光基团标记物又带有引物特殊标记物的双
标记扩增子。这种双标记扩增产物可以使用凝胶电
泳等终点定量方法和侧流层析法进行检测，目前主
要使用的基于“夹心法”的侧流试纸条进行检测。
侧流试纸条包括检测线和对照线，也有的只使用检
测线，其原理是：检测线处使用相应的抗体来捕获
引物所带有的标记物，胶体金颗粒标记的抗探针荧
光基团抗体结合扩增子带有的荧光基团即可以观察
到检测产物（也可以先捕获探针标记物，再结合引
物标记物）［8］。LF-RPA 的优点是经过 37-39℃的恒
温短时间扩增反应后，肉眼即可观察扩增产物在侧
流试纸条上的检测结果，不需复杂仪器设备，适合
现场快速检测。
3 RPA 技术与其他核酸恒温扩增技术的比较
目前应用较多的核酸恒温扩增技术主要有：
核酸依赖性扩增检测（nuclear acid sequence-based 
amplification，NASBA）、环介导恒温扩增（loop-me-
diated isothermal amplification，LAMP）、链替代扩增 
（strand displacement amplification，SDA）、滚环扩增 
（rolling circle amplification，RCA）、依赖解旋酶的恒 
温基因扩增（helicase-dependent isothermal DNA amp-
lification，HDA）及转录介导的扩增技术（transcrip- 
tion mediated amplification）等［18-21］。核酸恒温扩增
技术与基于 PCR 的核酸扩增技术相比，具有高敏感
性、高特异性、操作简便、反应时间短、不需复杂
仪器设备等优点，在检验检疫、医学、法医等需要
快速现场检测的一些领域实用性更强。以上扩增技
术各有优缺点，RPA与这些技术相比，操作更简单，
并且可以根据条件选择恰当的检测方法，目前在病
原学检测领域应用特别广泛。RPA 技术与其他核酸
恒温扩增方法简要对比，见表 1［22］，从表中可以看
出 RPA 技术不需热变性因此反应时间更短，可以多
通道同时检测多个靶基因，而且有多种方法可用来
检测扩增产物。
4 RPA 技术的应用进展
RPA 技术具有灵敏度高、特异性强、操作快速
便捷等优点，而且可以实现定量分析，因此在疾病
诊断和病原鉴定等许多领域具有广阔的应用前景。
在癌症研究中，RPA 技术可以用于癌症突变检测和
抗癌药物筛选［23，24］。RPA 技术在病原学检测领域
的研究尤为热门，目前已经建立了针对细菌、病毒、
寄生虫等多种病原体的 RPA检测方法（表 2）。RPA
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.650
表 1 RPA 与其他核酸恒温扩增方法比较
扩增方法        模板 引物数量 反应温度 /℃ 反应时间 /min 变性步骤 产物检测 2 多重通道
NASBA DNA & RNA 2 42 90-120 √ GE，RT √
LAMP DNA1 4-6 60-65 60-90 × GE，RT，TE ×
SDA DNA1 4 37 120 √ GE，RT √
RCA DNA1 1 37 60 × GE ×
HDA DNA1 2 65 75-90 × GE，RT √
TMA DNA & RNA 2 42 15-60 × GE，ECL ×
RPA DNA1 2 30-42 20 × GE，RT √
注：1：体系中引入逆转录酶可以扩增 RNA；2：GE表示凝胶电泳，RT表示实时监测，TE表示浊度，ECL 表示化学发光
表 2 RPA 检测在病原学检测领域的应用
病原体 方法 灵敏度 扩增时间 参考文献
细菌
Mycobacterium tuberculosis Exo 探针法 6.25 fg <20 min ［5］
Francisella tularensis Exo 探针法 10-100 拷贝 10 min ［30］
Group B Streptococci Exo 探针法 98 拷贝 <20 min ［31］
Salmonella LF-RPA 10-100 CFU/mL <30 min ［32］
Clostridium difficile Exo 探针法 1 fg <20 min ［33］
Shiga toxin-producing Escherichia coli Exo 探针法 5-50 CFU/mL 5-10 min ［34］
Staphylococcus aureus Exo 探针法 /LF-RPA 10 拷贝 60 min ［1］
Madurella mycetomatis Basic-RPA 0.23 ng 40 min ［35］
病毒
Human immunodeficiency virus Basic-RPA 10 拷贝 40 min ［8］/LF-RPA 10 拷贝 30 min
H7N9 Exo 探针法 10-100 拷贝 2-7 min ［29］
H5N1 Exo 探针法 1拷贝 7 min ［36］
Dengue virus Exo 探针法 10 拷贝 <20 min ［37］
White spot syndrome virus Exo 探针法 10 拷贝 <7 min ［14］
Yellow fever virus LF-RPA 21 拷贝 <20 min ［17］
Schmallenberg Virus Exo 探针法 5 × 104 拷贝 20 min
［11］
Bovine viral diarrhea virus Exo 探针法 6 × 103 拷贝 20 min
Plum pox virus LF-RPA 1 fg <20 min ［38］
Little cherry virus 2 LF-RPA 100 fg 约 25 min ［6］
Middle East respiratory syndrome coronavirus Exo 探针法 10 拷贝 3-7 min ［39］
Foot-and-mouth disease virus Exo 探针法 1436 拷贝 4-10 min ［7］
Bovine coronavirus Exo 探针法 19 拷贝 10-20 min ［40］
Yam mosaic virus Exo 探针法 14 pg <30 min ［41］
Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis 
virus
Exo 探针法 4拷贝 约 7 min ［42］
其他
Leptospira Exo 探针法 ≤ 10 fg 25 min ［13］
Chlamydia trachomatis LF-RPA 5-12 拷贝 ≥ 30 min ［43］
Plasmodium falciparum LF-RPA 100 fg 15 min ［16］
Orientia tsutsugamushi Exo 探针法 50 拷贝 20 min
［44］
Rickettsia typhi LF-RPA 20 拷贝 30 min
Mycoplasma capricolum Exo 探针法 50 CCU <15 min ［27］
Entamoeba histolytica LF-RPA 2.5 fg <20 min ［45］
Giardia LF-RPA 20 拷贝 <40 min ［46］
Visceral leishmaniasis LF-RPA 40 病原体 /mL >15 min ［47］
Schistosoma haematobium LF-RPA 100 fg 10 min ［48］
2016,32(6) 51景志刚等：重组酶聚合酶扩增技术研究进展
技术在维护人类公共卫生和生物反恐方面发挥着重
要作用，如 Euler 等［12］研发的 RPA 检测板可以同
时检测土拉弗朗西斯氏菌、鼠疫耶尔森氏菌、炭疽
芽孢杆菌、天花病毒、裂谷热病毒、埃博拉病毒及
马尔堡病毒等多种生物恐怖因子。在食品安全方面，
RPA 技术也应用广泛，如 Santiago-Felipe 等［25］建
立的 RPA-ELISA 方法可以同时检测食品中多种过敏
原（榛子、花生、番茄、大豆及玉米）、病原微生物
以及转基因成分；Chao 等［26］建立的 RPA 方法可以
检测玉米、水稻、棉花和大豆等作物中转基因成分。
由于 RPA 技术对实验设备的要求非常低，使得该技
术在经济条件差，资源不足的区域具有广阔的应用
前景［7，17，27-29］。
5 结语
RPA 技术被称作有望替代 PCR 的核酸检测技
术，主要优势在于不需温控仪器即可快速进行痕量
DNA 或 RNA 的特异性扩增，在临床检测和现场快
速诊断方面具有显著的优越性。以 RPA 技术为基础
建立的 RPA-ELISA、on chip RPA 等扩增技术可以
高通量检测多种病原体，因此 RPA 技术在癌症突变
检测、遗传病的定期和快速普查、转基因成分检测
等领域也有广阔的应用前景。虽然目前 RPA 技术
的检测成本高于 PCR 等其他核酸扩增技术，但随着
RPA技术的进一步发展、完善以及生产工艺的改良，
RPA 技术有望成为常规的快速诊断手段，并在分子
生物学、医学、遗传学等各个研究领域得到更加广
泛的应用。
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（责任编辑  狄艳红）