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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(4):190-197
收稿日期 ：2015-12-17
基金项目 ：国家“973”项目（2015CB755700），国家自然科学基金项目（31470174），广东省引进创新创业团队计划项目（2013S033）
作者简介 ：柯琪，女，硕士，研究方向 ：固氮微生物与基因工程，E-mail ：543274382@qq.com ；陈清华为本文并列第一作者
通讯作者 ：燕永亮，博士，副研究员，硕士生导师，研究方向 ：固氮微生物分子生物学及基因工程 ；E-mail ：yanyongliang@caas.cn
生物固氮是微生物在某些特定的条件下将空气
中的氮气还原为铵的过程［1］，是自然生态系统中氮
大肠杆菌氮代谢调节蛋白 GlnG 与固氮施氏假单胞菌氮
代谢调节蛋白 NtrC 的功能互补研究
柯琪1，2  陈清华2  战嵛华2  陆伟2  燕永亮2
（1. 西南科技大学生命科学与工程学院，绵阳 621010 ；2. 中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081）
摘 要 ： 旨在围绕大肠杆菌 DH10B（Escherichia coli DH10B）中氮代谢调节蛋白 GlnG 与施氏假单胞菌 A1501（Pseudomonas
stutzeri A1501）中氮代谢调节蛋白 NtrC 在一般氮代谢调控网络中是否存在功能互补展开研究。利用 DH10B 菌的 glnG 基因回补
A1501 菌的 ntrC 突变株，以及 A1501 菌的 ntrC 基因回补 DH10B 菌的 glnG 突变株，对所获得的功能互补株分别展开生理生化表型
测定。结果表明，在以硝酸钾或尿素为唯一氮源的培养条件下，DH10B glnG 基因可以回补 A1501 ntrC 突变株的氮源利用能力，并
且部分恢复 ntrC 突变株的固氮酶活性（约为野生型 A1501 固氮酶活性的 45%）；与 DH10B glnG 突变株相比，A1501 菌的 ntrC 基因
回补了 DH10B glnG 突变株以精氨酸为唯一氮源的生长能力。以上结果说明 DH10B 菌的 GlnG 蛋白与 A1501 菌的 NtrC 蛋白不仅在
进化关系上紧密联系而且在所测试的氮代谢途径中存在功能互补。
关键词 ： 施氏假单胞菌 A1501 NtrC ；大肠杆菌 DH10B GlnG ；一般氮代谢 ；功能互补
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.025
Functional Complement Between General Nitrogen Regulator GlnG in
Escherichia coli and General Nitrogen Regulator NtrC in Pseudomonas
KE Qi1，2 CHEN Qing-hua2 ZHAN Yu-hua2 LU Wei2 YAN Yong-liang2
（1. School of Life Science and Engineering，Southwest University of Science and Technology，Mianyang 621010 ；2. Biotechnology Research
Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）
Abstract: This study aims to investigate whether or not there is functional complement in general nitrogen-regulation network between
nitrogen metabolism regulator GlnG from Escherichia coli DH10B and NtrC from Pseudomonas stutzeri A1501. Using gene glnG of DH10B
to complement gene ntrC of A1501 or vice versa，the physiological and biochemical phenotypes of the obtained functionally complementary
strains were measured. The results showed that while nitrate or urea as the sole nitrogen source，DH10B’s glnG complemented the nitrogen-
utilizing ability and partially restored the nitrogenase activity（about 45% of wild type）of mutant A1501’s ntrC. Comparing with DH10B’s
glnG，A1501’s ntrC only complemented mutant DH10B glnG while arginine as sole nitrogen source. Above results revealed that not only was
there close phylogenetical relationship，but also the functional complement in the tested nitrogen metabolism between DH10B’s GlnG and
A1501’s NtrC.
Key words: Pseudomonas stutzeri A1501 NtrC ；Escherichia coli DH10B GlnG ；general nitrogen metabolism ；functional complement
的主要来源，在氮素的生态平衡和农、林生产业中
发挥重要作用，而对于生物固氮调控过程的研究是
2016,32(4) 191
柯琪等 ：大肠杆菌氮代谢调节蛋白 GlnG 与固氮施氏假单胞菌氮代谢调节蛋白 NtrC 的
功能互补研究
目前微生物研究领域的热点之一。
氮源是自然环境中影响生物固氮效率的一个
重要的限制性因素，固氮微生物能否高效利用环境
中的氮源，使生物固氮仅发生在有利和必要的条
件下是关键性问题。目前已有研究表明在大肠杆
菌（Escherichia coli）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella
typhimurium）、克雷伯氏菌（Klebsiella）和肺炎克氏
杆菌（Klebsiella pneumoniae）中氮素吸收和氮源代
谢由 NtrBC（Nitrogen regulation，ntr）双组份系统全
局调控［2］。NtrBC 双组份系统（亦称 GlnLG 双组份
系统）在革兰氏阴性菌中广泛存在，由组氨酸激酶
NtrB 和转录调控因子 NtrC 构成。在细菌所处生长
环境缺乏氮源时，NtrB 能够自身磷酸化，并且发挥
激酶作用将 NtrC 磷酸化，磷酸化以后的 NtrC 转录
激活氮源转运吸收和代谢相关基因的表达［3］。其中
NtrC 蛋白（在固氮施氏假单胞菌 A1501 中由 ntrC 基
因编码）是固氮施氏假单胞菌 A1501 中固氮岛基因
表达激活的关键调节蛋白。在大肠杆菌中，GlnG 蛋
白（在 DH10B 菌中由 glnG 基因编码）是氮限制条
件下氮源选择性同化途径的全局激活子［4］。研究表
明假单胞菌中的 NtrC 蛋白是激活一系列编码参与氮
源吸收和利用的蛋白基因表达所必需的因素［5］，包
括自身操纵子 glnA-ntrBC 及 atzDEF 操纵子。同时
NtrC 在施氏假单胞菌中也参与固氮调控过程［6］，也
有许多研究表明肠杆菌中的氮调节系统与假单胞菌
很多相同之处［6，7］。大肠杆菌的代谢调控网络目前
研究较为透彻，具有可进行厌氧生长、易于培养以
及遗传操作方便等显著优点。而作为第一株完成测
序的联合固氮菌，施氏假单胞菌 A1501 含有一全
长 49 kb 的固氮岛，含有 59 个编码基因，其中传统
的 20 多个固氮相关基因是其实现生物固氮的遗传基
础［8］。本实验室已经成功将 A1501 的固氮岛基因转
入大肠杆菌 DH10B 获得了具有固氮酶活性的重组大
肠杆菌，使得联合固氮菌摆脱了遗传背景不清楚的
局限。然而重组大肠杆菌的固氮酶活性只有野生型
A1501 的 1/10，因此，研究固氮条件下大肠杆菌内
的氮代谢相关基因与施氏假单胞菌固氮岛内相关基
因的表达调控是否具有相关性，是提高重组大肠杆
菌固氮能力的关键。
本研究通过构建 DH10B glnG 回补 A1501 ntrC
突变株的功能互补株和 A1501 ntrC 回补 DH10B glnG
突变株的功能互补株，对突变株和功能互补株在
唯一氮源条件下生长能力进行分析，旨在为揭示
DH10B GlnG 与 A1501 NtrC 两蛋白在细菌一般氮代
谢过程中是否具有调控功能的相关性奠定理论基础，
也为进一步提高重组菌固氮酶活性提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 本研究中所涉及的细菌菌株主要是固氮施氏
假单胞菌野生型及相关突变株和互补株（表 1）。
表 1 实验所用菌株
菌株或质粒 相关特性 来源
大肠杆菌 DH10B（E.coli DH10B）
DH10B 大肠杆菌 DH10B 实验室保藏
ΔglnG 大肠杆菌 DH10B glnG 突变株 ；Kmr 实验室构建
ntrC-comp-E A1501 ntrC 互补大肠杆菌 DH10B glnG 突变株 ；Tcr、Kmr 本研究构建
固氮施氏假单胞菌 A1501（P.stutzeri A1501）
A1501 固氮施氏假单胞菌 A1501 实验室保藏
ΔntrC 固氮施氏假单胞菌 A1501 ntrC 突变株 ；Cmr 实验室保藏
ntrC-comp A1501 ntrC 互补 A1501 ntrC 突变株 ；Tcr、Cmr 实验室保藏
glnG-comp DH10B glnG 互补 A1501 ntrC 突变株 ；Tcr、Cmr 本研究构建
大肠杆菌 JM109 含重组质粒 glnG-pLAFR3 实验室保藏
1.1.2 培养基及生化试剂 LB 培养基（固体培养基
含 1.5% 琼脂粉）：0.5% 酵母提取物，1.0% 胰蛋白
胨，1.0% 氯化钠，pH7.0。改良 K 培养基（固体培
养 基 含 1.5% 琼 脂 粉 ）：0.04% KH2PO4，0.01%
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.4192
K2HPO4，0.01% NaCl，0.02% MgSO4·7H2O，0.001%
MnSO4·H2O，0.001% Fe2（SO4）3·H2O，0.001%
Na2MoO4·H2O，0.6% C3H5NaO3，0.04%（NH4）
2SO4，pH6.8 。M9 培养基（固体培养基含 1.5% 琼脂
粉）：20% 5×M9 盐溶液，0.2% 1 mol/L MgSO4，20%
葡萄糖，0.01% 1 mol/L CaCl2。5×M9 盐溶液 ：6.4%
Na2HPO4，1.5% KH2PO4，0.25% NaCl，0.5% NH4Cl。
1.1.3 引物合成和测序 由北京擎科生物技术有限
公司及六合华大基因有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 三 亲 结 合 实 验 活 化 供 体 菌（ 大 肠 杆
菌 JM109）、 受 体 菌（A1501） 以 及 含 有 助 质 粒
pRK2013 的大肠杆菌，转接至相应液体培养基中。
过夜培养后接至新鲜的液体培养基中，30℃，220
r/min 荡培养至 OD600=0.6-0.8。吸取 1.5 mL 液离心
收集菌体沉淀。用 0.85% 的生理盐水洗涤菌体 2 次，
并将 3 管相同的菌液合为一管，离心收集菌体沉淀
后加入 100 μL 0.85% 的生理盐水将 3 种菌液稀释成
同一浓度，按供体菌∶受体菌∶助质粒为 2∶2∶1
的比例将 3 种混合均匀离心收集菌体沉淀。用 50-
100 μL 0.85% 的生理盐水重悬菌体并点于 LB（无任
何抗性）平板中央，风干后放于 30℃培养箱。培养
24-48 h 后将所有菌苔刮下，用 0.85% 的生理盐水倍
比稀释各取 100 μL 涂在加相应抗生素的 K 培养基平
板上，30℃培养至单菌落长到合适大小。
1.2.2 以 10 mmol/L 硝 酸 钾 和 10 mmol/L 尿 素 为 唯
一氮源条件下的生长曲线测定 活化菌株 A1501、
ΔntrC、ntrC-comp、glnG-comp，接种至新鲜的 K 培
养基中，30℃过夜培养，离心收集菌体沉淀。用 0.85%
的生理盐水洗涤菌体 2 次。用以 10 mmol/L 硝酸钾
和 10 mmol/L 尿素为唯一氮源的液体培养基重悬菌
体，并调节菌液初始 OD600 为 1.0。将 2 mL 菌液接
种于 18 mL 以 10 mmol/L 硝酸钾和 10 mmol/L 尿素为
唯一氮源的液体培养基，30℃，220 r/min 震荡培养，
每个体系 3 个重复。分别于 2、4、6、8、10、12、
14、16、18、20、22 和 24 h 取 样， 测 定 各 菌 液 的
OD600。
1.2.3 施 氏 假 单 胞 菌 固 氮 酶 活 测 定 活 化 菌 株
A1501、ΔntrC、ntrC-comp、glnG-comp，接种至新鲜
无氮培养基中，30℃过夜培养，离心收集菌体沉淀。
用 0.85% 的生理盐水洗涤菌体 2 次。用液体无氮培
养基 K 重悬菌体，并调节菌液初始 OD600 为 1.0。将
1 mL 菌液接种于 9 mL 无氮 K 培养基中，封口后每
瓶充 5 min 氩气并注入 0.5% 的氧气和 10% 的乙炔，
30℃，220 r/min 震荡培养，每个体系 3 个重复。分
别于 4、6、8、10 h 取样 250 μL 气体进行气谱检测，
并记录乙烯的峰面积。
利用公式 固氮酶活 = 乙烯峰面积 ×（摇瓶中
气相总体积 / 进样量）/（1 nmol 标准乙烯峰面积 ×
反应时间 × 蛋白量）计算固氮酶活性。其中摇瓶
中气相总体积为 70 mL，1 nmol 标准乙烯峰面积为
1 962.9，蛋白量为 0.68 mg。
1.2.4 以精氨酸为唯一氮源条件下的生长曲线测
定 活 化 菌 株 DH10B、ΔglnG、ntrC-comp-E， 接 种
至液体培养基 M9 中，37℃过夜培养。离心收集菌
体。用 0.85% 的生理盐水洗涤菌体 2 次。用以精氨
酸为唯一氮源的液体培养基重悬菌体，并调节菌液
初始 OD600 为 1.0。接种 200 μL 菌液于 19.8 mL 以精
氨酸为唯一氮源的液体培养基，37℃，220 r/min 震
荡培养，每个体系 3 个重复。分别于 2、4、6、8、
10、12、14、16、18、20、22 和 24 h 取样，测定各
菌液的 OD600。
1.2.5 引物设计 根据 NCBI 数据库的 GenBank 中
获 得 大 肠 杆 菌 DH10B 及 施 氏 假 单 胞 菌 A1501 的
基因组序列后分别找到目标基因 glnG 和 ntrC，用
Primer premier 5.0 设 计 引 物 glnG（F）/glnG（R）
和 ntrC（F）/ntrC（R）。glnG（F）：5-CAAAGCTT
C C A C T C G A T A C C A G A T T A - 3 和 g l n G （ R ）
5-CGGGATCC AGGAAATAAAGGTGACG-3， 下 划
线分别为 Hind III 和 BamH I 酶切位点。ntrC（F）：
5-TTTAAGCTTTGTCGCAGGTCGGAT-3，和 ntrC（R）：
5-TTGGATCCAGAACATCATCAGTCAG-3， 下 划 线
分别为 Hind III 和 BamH I 酶切位点。以基因组 DNA
为模板用引物 glnG（F）/glnG（R）和 ntrC（F）/ntrC（R）
扩增 glnG 和 ntrC 基因片段。PCR 扩增条件 ：95℃
10 min ；95℃ 30 s，54-62℃ 1.5 min，72℃ 30 s，30
个循环 ；72℃ 10 min。
2016,32(4) 193
柯琪等 ：大肠杆菌氮代谢调节蛋白 GlnG 与固氮施氏假单胞菌氮代谢调节蛋白 NtrC 的
功能互补研究
2 结果
2.1 DH10B GlnG和A1501 NtrC的生物信息学及理
化性质分析
在 NCBI 数 据 库 中（http://blast.ncbi.nlm.nih.
gov/Blast.cgi） 分 别 检 索 DH10B GlnG 及 A1501 NtrC
两蛋白质的氨基酸序列，获得序列后利用 DNAMAN
软件对两个序列进行序列比对分析，比对结果（图
1）显示两个蛋白的一级结构相似，氨基酸序列相似
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Q
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M
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A
439DH10B.seq
436A1501.seq
Consensus
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A
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476A1501.seq
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D
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D
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G
.
D
图 1 DH10B GlnG 与 A1501 NtrC 蛋白质氨基酸序列比对
性为 63.5%。
利 用 ExPASy（Expert Protein Analysis System）
数据库中进行氨基酸理化参数计算的工具 ProtParam
（http://expasy.org/tools/protparam.html）对两个蛋白质
进行了比较分析。结果（表 2）显示两个蛋白的分
子量、等电点等都非常接近。以上结果表明 DH10B
GlnG 蛋白与 A1501 NtrC 蛋白在结构上具有一定相似
性，两蛋白可能具有功能相关性。
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表 2 A1501 NtrC 与 DH10B GlnG 理化性质比较（预测）
理化性质 A1501 NtrC DH10B GlnG
氨基酸数目 478 469
分子量 53481.2 52254.7
等电点 5.53 6.04
总负电荷残基数（Asp + Glu） 70 60
总正电荷残基数（Arg + Lys） 53 52
不稳定系数 45.87 38.16
脂肪系数 87.82 97.40
亲疏水性总和 -0.460 -0.246
2.2 glnG互补ΔntrC功能互补株的构建及表型分析
本实验室已经采用广宿质粒 pLAFR3 通过双酶
切成功构建了 pLAFR3-glnG 重组质粒，本研究通
过三亲结合的方法将重组质粒 pLAFR3-glnG 导入
ΔntrC 中。在含有四环素（Tc）和氯霉素（Cm）双
抗性的固体限制性培养基 K 上进行阳性克隆筛选，
再利用引物 glnG（F）/glnG（R）进行菌落 PCR 验证
（图 2），得到 glnG 互补 ΔntrC 的功能互补株（glnG-
comp）。
一氮源进行生长，野生型 A1501 在该条件下生长良
好。而不论是用 ntrC 还是用 glnG 回补 ΔntrC 都能使
其恢复一定的生长能力。结果表明，glnG 已在 ΔntrC
中成功表达，并能够替代 ntrC 实现对硝酸钾和尿素
功能的利用，这一结果表明 GlnG 蛋白与 NtrC 蛋白
在氮代谢过程中具有功能相关性。
bp
5000
2000
750
500
250
M 1 2 3
M ：Trans 2k plus Ⅱ DNA Marker ；1 ：阳性对照（以 DH10B 单菌落为模板）；
2 ：阴性对照（DH10B glnG 突变株单菌落为模板）；3 ：阳性克隆
图 2 菌落 PCR 验证 glnG 基因
为了研究 GlnG 能否替代 NtrC 在 ΔntrC 一般氮
代谢过程中行使功能，我们构建了 glnG 互补 ΔntrC
的功能互补株并进行了相应功能表型测定。因本实
验室已经证实 ΔntrC 不能在以硝酸钾或尿素为唯一
氮源的培养基上生长，所以本研究测定了 A1501、
A1501ΔntrC、ntrC-comp 以及 glnG-comp 在培养基 K
中以硝酸钾和尿素为唯一氮源的生长曲线（图 3）。
从图中可以看到 ΔntrC 能够利用硝酸钾和尿素为唯
2.0
1.5
1.0
0.5
0
O
D
60
0
0
A
4 8 12ᰦ䰤h 16 20 24
A1501
ntrC mutant
ntrC-comp
glnG-comp
B 2.0
1.5
1.0
0.5
0
O
D
60
0
0 4 8 12ᰦ䰤h 16 20 24
A1501
ntrC mutant
ntrC-comp
glnG-comp
图 3 四种菌株在以 10 mmol/L 硝酸钾（A）及 10 mmol/L
尿素（B）为唯一氮源条件下的生长曲线
为了进一步验证 GlnG 蛋白与 NtrC 蛋白在固氮
调控过程中是否具有功能相关性，我们对 A1501、
ΔntrC、ntrC-comp 及 glnG-comp 的固氮酶活性进行了
测定。结果（图 4）发现 ntrC 突变以后使菌株的固
氮酶活性基本丧失，而 glnG-comp 具有一定的固氮
酶活性，约为野生型 A1501 的 45%。说明在固氮过
2016,32(4) 195
柯琪等 ：大肠杆菌氮代谢调节蛋白 GlnG 与固氮施氏假单胞菌氮代谢调节蛋白 NtrC 的
功能互补研究
程中，glnG 能够部分互补 ntrC 的调节功能，使菌株
表现出固氮酶活性。结果表明，在重组大肠杆菌中
GlnG 参与了固氮表达调控，与 NtrC 蛋白具有功能
相关性。
为了研究 NtrC 蛋白能否在 E.coli DH10B 中代替
GlnG 在一般氮代谢过程中行使功能，我们对 ΔglnG
和 ntrC-comp-E 进行了相应表型测定。因为有研究
表明 ΔglnG 不能在以精氨酸为唯一氮源的条件下进
行生长［9］，所以本研究测定了 E.coli DH10B、ΔglnG
以及 ntrC-comp-E 在培养基 M9 中以精氨酸为唯一氮
源条件下的生长曲线。结果（图 6）显示 ΔglnG 在
M9 培养基中不能够以精氨酸为唯一氮源进行生长，
野生型 E.coli DH10B 在该条件下生长良好。而当用
ntrC 互补 ΔglnG 突变株时，功能互补菌株基本恢复
了生长能力。结果表明，ntrC 已在 ΔglnG 中成功表达，
并能够替代 glnG 在 E.coli DH10B 菌的一般氮代谢过
程中行使功能，实现对精氨酸利用功能的互补。
1000
750
500
250
0
A1501
പ≟䞦⍫ᙗmmol҉✟m
g㳻ⲭh
ntrC mutant ntrC-comp glnG-comp
图 4 四种菌株固氮酶活性的测定
2.3 ntrC互补ΔglnG功能互补株的构建及表型分析
本实验室已成功地将 A1501ntrC 片段克隆到广
宿主质粒载体 pLAFR3 上，构建了 A1501 NtrC 蛋白
的表达载体 pLAFR3-ntrC。本研究首先提取了重组
质粒 pLAFR3-ntrC，然后通过电击转化将重组质粒
pLAFR3-ntrC 导入到 ΔglnG 中，再利用含有四环素
（Tc）和卡那霉素（Km）双抗性的固体 LB 平板进
行阳性克隆筛选。最后利用 ntrC（F）/ntrC（R）引
物进行菌落 PCR 验证（图 5），得到 ntrC 回补 ΔglnG
的功能互补株（ntrC-comp-E）。
bp
5000
2000
1000
750
250
100
M 1 2 3 4
M ：Trans 2k plus Ⅱ DNA Marker ；1 ：阳 性 对 照（A1501 单 菌 落 为 模 板 ）；
2 ：阳性对照（含质粒 pLAFR3-ntrC 的单菌落为模板）；3 ：阴性对照（质粒
pLAFR3 为模板）；4 ：阳性克隆
图 5 菌落 PCR 验证 ntrC 基因
0 2
O
D
60
0
4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0 ᰦ䰤h
E.coli
ntrC-comp-E
glnG mutant
图 6 三种菌株在以精氨酸为唯一氮源条件下的生长曲线
3 讨论
氮调节是涉及多个信号转导和效应蛋白的复杂
调控网络，该领域在肠道菌中已经进行了深层研究。
假单胞菌的氮代谢系统与肠细菌相比有很多共同特
点，均含有典型的氮代谢调节系统即 NRII-NRI 双组
分调节系统［3］，该系统由尿苷转移酶（GlnD）、PII
（GlnB、GlnK）、NRII（GlnL/NtrB）和 NRI（GlnG/NtrC）
等具有双功能的蛋白组成。然而，施氏假单胞菌的
氮调节与大肠杆菌也有很多不同之处。首先，施氏
假单胞菌中 Ntr 系统的功能仅由 glnK 基因编码的
PII 蛋白调控，其产物直接编码高亲和力转运蛋白
的 amtB 基因相互作用。而在大肠杆菌中，glnB 和
glnK 都编码 PII 蛋白，其中组成型表达的 GlnB 蛋白
由 glnB 编码，由于 GlnK 的转录依赖于 NRI，因此
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.4196
glnK 编码的 GlnK 蛋白只在低氮条件下表达，GlnB
和 GlnK 的功能也部分重叠［10］。
Schumacher 等［5］研究表明，NRI（NtrC）的存
在导致恶臭假单胞菌中 glnK 和 amtB 的表达受氮源
调控，其功能仅在氮限制的条件下由 NtrC 激活［5］。
体外纯化蛋白实验表明，glnK 的转录直接被 NtrC 激
活［5］。通过对施氏假单胞菌 A1501 中 glnK 基因的
序列分析，发现在 glnK 基因的启动子上游 -12/-24
处具有与 σ54 结合位点相似的序列。在低氮的条件下，
依赖于 σ54 的启动区开始转录后 glnK 基因开始表达，
该表达受 NtrC 蛋白调控 ；在高氮条件下，glnK 基因
可能在一个不依赖于 σ54 和 NtrC 蛋白调控的启动子
区开始转录并进行低水平表达［11］。
在大肠杆菌中，glnK 基因上游区域也含有一
个 σ54 结合位点，一个 NRI（GlnG）结合位点，操纵
子表达也依赖 GlnG 同时也受到氮素调控［12，13］。另
外，与大肠杆菌 glnKp 不同的是恶臭假单胞菌 glnKp
开放复合物的形成强烈依赖于 IHF，这在体内才能
观察到。并且 IHF 的参与，加上其螺旋的同一侧存
在两个连续的 NtrC 结合位点，表明恶臭假单胞菌
glnKp 的转录激活对低浓度的 NtrC 是敏感的。这两
个不同点可能与缺乏组成型 GlnB 蛋白进行高效氮抑
制有关［14］。其次，大肠杆菌氮调节的操纵子也包含
能被 σ70 RNA 聚合酶全酶识别的启动子［15］，这些操
纵子的转录受到氮同化控制蛋白（Nac）-LysR 型调
节子的调控。在大肠杆菌中受 Nac 激活的基因和操
纵子涉及氮化分子的转运［16］，这也可能作为氮的来
源。然而施氏假单胞菌 A1501 全基因组数据表明其
不含有 nac 基因［17］，并且已测序的假单胞菌基因组
表明该属菌中不含有 Nac 同源物［18］。有研究证实在
恶臭假单胞菌中，由 NtrC 直接激活的基因同时含有
σ54 依赖型启动子和 Nac 激活基因同源物，这避免了
需要一个适配器来共同调节 σ54 和 σ70 依赖型基因［19］。
进而推测通过 Nac 介导的依赖 σ70 的级联氮调控不
是肠杆菌所必须的，因为许多菌中不含有 nac 基因。
在沙门氏菌中，最近发现似乎 Nac 也丢失了，因为
在响应氮的情况下它不能控制依赖 σ70 基因的表达。
然而沙门氏菌中 hutC 基因的启动子仍易受克雷伯氏
菌 Nac 的激活［20，21］。相反在恶臭假单胞菌中，这
些基因有的仍然响应氮的调控，但是它们的启动子
依赖 σ54，直接受到 NtrC 的调控，从而避免了额外
的调控［22］。由此可知施氏假单胞菌 A1501 中由氮介
导的调控网络也是大肠杆菌中氮调控网络的简化模
式 ：只含有一个 PII 蛋白，没有 Nac 参与的级联调
控［23］，这可能是造成 DH10B GlnG 和 A1501 NtrC 调
控功能差异的因素。
本 研 究 证 实 了 DH10B GlnG 和 A1501 NtrC 蛋
白在一级结构、理化性质以及功能上都具有很大的
相似性。这些数据表明，在大肠杆菌和施氏假单孢
菌中的 NRI 蛋白的功能是高度保守的，两个蛋白可
以进行相互替换。同时也发现，DH10B glnG 互补
A150 ntrC 突变株时，在一般氮代谢方面的功能互补
性高于调控固氮过程的功能互补性，推测这可能与
大肠杆菌和施氏假单胞菌中氮介导的调节网络的不
同有关，也可能是在进化过程中，由于大肠杆菌所
处的环境营养条件优越，造成其一般氮代谢调节蛋
白 GlnG 在功能上产生了分化。
4 结论
本 研 究 成 功 构 建 了 DH10B glnG 回 补 A1501
ΔntrC 的功能互补株和 A1501ntrC 回补 DH10B ΔglnG
的功能互补株，并对互补株和突变株与野生型的氮
源利用和生物固氮能力等方面进行了比较分析，结
果显示 DH10B glnG 能够互补 A1501 ntrC 在氮源利
用和氮限制条件下的调节功能，而 A1501 ntrC 能够
互补 DH10B glnG 在氮源条件下的生长能力，这一结
果表明 DH10B 菌中的 GlnG 可能通过互补 A1501 菌
中 NtrC 蛋白在氮限制条件下的调节功能进而参与到
一般氮代谢调控网络过程中。
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（责任编辑 马鑫）