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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(2):70-75
收稿日期 ：2015-04-30
基金项目 ：国家自然科学基金青年科学基金项目（51108029），中央高校基本科研业务费专项资金资助项目（TD2012-03），北京市优秀人才
培养资助项目（2013D002006000001）
作者简介 ：孔维文，硕士研究生，研究方向 ：植物病原体互作 ；E-mail ：kongweiwen90@126.com
通讯作者 ：何晓青，博士，副教授，研究方向 ：环境中微生物学 ；E-mail ：lenahe@bjfu.edu.cn
黄瓜细菌性角斑病 PMA-qPCR 检测方法的建立和应用
孔维文1  李云龙2  王敬琦1  刘婷婷1  陈南1  金一1  何晓青1
（1. 北京林业大学生物科学与技术学院，北京，100083 ；2 北京市植物保护站，北京 100029）
摘 要 ： 黄瓜细菌性角斑病为黄瓜常见的一种细菌病害，其致病菌为丁香假单胞菌黄瓜致病型。目前该病在全球范围内已
经造成严重的经济损失。针对于 PMA 染料能够区分细胞死活的特性将其与荧光定量 PCR 技术结合。（1）通过比对分析 GenBank
中该菌种不同株的 gap1 基因序列，找出 gap1 基因的保守区并根据保守区基因序列设计了一对特异性引物 Dxf1 和 Dxr1，以其他 5
种非丁香假单胞菌基因组为模板进行实时定量 PCR 扩增，只有丁香假单胞菌有扩增曲线，证明引物非常特异。（2）以 gap1 基因
为目的基因构建其克隆载体，将克隆载体导入到大肠杆菌感受态细胞中进行培养，使其大量复制。再将质粒提取，以提取的质粒
作为标准品，根据其浓度将其稀释为 5×101-5×107 7 个梯度绘制标准曲线，获得的扩增效率为 96.6%，并做组内重复和组间重复，
变异系数均在 2% 内，证明标准曲线重复性良好。（3）将构建好的方法用于实际样品的检测，得到的 Ct 值为 27.99，根据标准曲线
所得的起始模板与 Ct 值之间的线性关系公式，检测到 100 mg 患病叶片中含有的菌体为 7.69×102 拷贝。研究表明，该方法可以快
速鉴定并检测实际样品中的活的致病菌的数量，为黄瓜细菌性角斑病的防控提供技术支持。
关键词 ： 黄瓜细菌性角斑病 ；PMA-qPCR ；丁香假单胞菌 ；检测 ；有活力菌体
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.009
The Establishment of PMA-qPCR for Detecting Bacterial Angular Leaf
Spot on Cucumber and Its Preliminary Application
KONG Wei-wen1 LI Yun-long2 WANG Jing-qi1 LIU Ting-ting1 CHEN Nan1 JIN Yi1 HE Xiao-qing1
（1. College of Biological Science and Technology，Beijing Forestry University，Beijing 100083 ；2. Beijing Plant Protection Station，
Beijing 100029）
Abstract: Bacterial angular leaf spot on cucumber is a common bacterial disease for cucumber, and its causative pathogen is Pseudomonas
syringae pv. lachrymans. Currently this disease has caused a worldwide serious economic loss. Duo to the feature of PMA dyes that may
distinguish whether the bacterial cells are alive or dead, PMA-qPCR was established by combining it with fluorescence quantitative PCR（qPCR）
technology. （1）We compared the sequences of gene gap1 in different strains of the bacteria in GenBank, and found out the conservative area
of gene gap1, and designed a pair of specific primers Dxf1 and Dxr1 for this bacterium according to the sequences of conservative area of gene
gap1. Then we applied the qPCR method to do amplification using the genome of 5 non-Pseudomonas syringae pv. Lachrymans as template, and
only P. syringae pv. lachrymans showed the positive result, proving that primers had specificity. （2）We used the gene gap1 as the target gene to
construct a clone vector that was inserted into the competent cells of Escherichia coli. Then the E. coli cells were cultured to have a lot of copies.
Using the extracted plasmids as the standard sample, and it was diluted to seven gradients of 5×101-5×107 and then drew a standard curve.
The amplification efficiency obtained from the standard curve was 96.6%, and the coefficients of variation both within groups and between groups
were less than 2%, showing a fine repeatability of the standard curve. （3）We applied the PMA-qPCR method to detect the actual samples and
gained a Ct value of 27.99. Based the linear correlation between initial template from the standard curve and Ct values, we measured 7.69×102
copies viable cells per 100 mg sick leaves. This study showed that PMA-qPCR method could quickly identify and quantify the number of living
bacteria in actual samples, and provided a technical support for the prevention and control of bacterial angular leaf spot on cucumber.
Key words: bacterial angular leaf spot on cucumber ；PMA-qPCR ；Pseudomonas syringae ；detection ；viable cell
2016,32(2) 71孔维文等：黄瓜细菌性角斑病 PMA-qPCR 检测方法的建立和应用
黄瓜细菌性角斑病是世界范围内的黄瓜的主
要病害之一，是为黄瓜由丁香假单胞菌黄瓜致病型
（Pseudomonas syringae pv. lachrymans）引起，是一种
重要的细菌性病害，于 20 世纪初首次被 Carsener 等［1］
报道。20 世纪 80 年代，日本、加拿大和美国等地
因为细菌性角斑病遭受了严重的经济损失［2-4］。我
国在 20 世纪 50 年代时对黄瓜细菌性角斑病也有初
步报道，但由于病害并不严重，所以没有引起广泛
重视，直到 80 年代，该病害在华北、东北和内蒙古
等黄瓜的主要产区逐渐肆虐，已成为黄瓜种植中的
严重灾害，才引起了人们的重视。该病散布快，传
播范围广，如果黄瓜遭遇此病害，严重时可导致绝
产，造成严重经济损失［5，6］。近几年来，该病已散
布到全国的黄瓜保护地。此外，丁香假单胞菌的寄
主非常广泛，1988 年，孙福在等［7］证明该病原菌
除了可侵染黄瓜外，还可以侵染葫芦、西葫芦和丝
瓜等葫芦科植物。
传统的检测方法如生理生化指标鉴定，细菌的
分离培养等都是依靠表型来鉴定致病菌，耗时长，
灵敏度很低，并且不准确［8］。ELISA 等血清学鉴定
致病菌，快速而灵敏，近来也有过一些报道［9］。但
丁香假单胞菌有 50 多个致病型［10］，因此对抗体的
筛选也增加了很多困难，综上原因，构建一个重复
性好，灵敏度高的致病菌的分子检测方法对于农业
生产中预防和控制该疾病有着很重要的意义。普通
的 qPCR 虽然能够对病原菌进行定量，但不能区分
病原菌的死活［11，12］。有研究表明病菌在死亡后数
天甚至数周内 DNA 都能够保持完整［13］，因此如何
区分病原菌的死活就成为分子检测手段的巨大挑战。
叠氮溴化丙锭（PMA）是一种能与 DNA 高度亲和
的荧光染料，它能穿过受损细胞膜内，在可见光的
照射下能与其 DNA 共价交联，从而达到阻碍受损
细胞中的 DNA 进行 PCR 扩增的作用［14，15］。在农业
生产中针对于患病植株有很多处理方法的建立可以
成为判断各处理方法有效性的一种手段［16］。因此将
PMA 染料与实时定量 PCR 结合可以准确、快速的鉴
定致病菌并准确对活菌数进行定量。
gap1 基因是甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶基因，作为
参与新陈代谢的基因，丁香假单胞菌的 gap1 基因具
有高度的保守性，因此 gap1 基因可以用于检测该致
病菌。本研究将 GenBank 中丁香假单胞菌黄瓜致病
型的 gap1 基因序列进行比对，根据其保守区设计特
异性引物，构建针对于 gap1 基因的 PMA-qPCR 检测
方法。并将该方法应用于实际样品的检测，旨为快
速鉴定、测取单位患病叶片中活菌含量提供一种检
测手段。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株及实际样本 丁香假单胞菌黄瓜致
病型菌株（Pseudomonas syringae pv. lachrymans）；水
稻白叶枯病病原菌（Xanthomonas oryzae）；番茄溃疡
病病原菌（Clavibacter michiganensis subsp. michigan-
ensis）；黑腐病病原菌（Xanthomonas campestris）；青
枯病病原菌（Ralstonia solanacearum），黄瓜缘枯病
致 病 菌（Pseudomonas marginalis pv. marginalis） 和
大肠杆菌（E.coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus
aureus）；患细菌性角斑病黄瓜叶片（采自房山区）。
1.1.2 主要试剂及设备 PMA 染料（Biotium，美
国 ），RNase-free ddH20（TIANGEN， 北 京 ），ExTaq
DNA 聚 合 酶（TaKaRa， 大 连 ），100 mmol/L dNTP
（TIAN-GEN，北京），Marker I，50×TAE Buffer，质
粒提取试剂盒，pGM-T 载体构建试剂盒，细菌基因
组提取试剂盒，DNA 产物纯化回收试剂盒，TRIZOL
试剂（TIANGEN，北京）Goldview（Biodee，北京）。
SuperReal PreMix Plus（TIANGEN， 北 京 ）Qubit 核
酸 / 蛋白定量仪（Invitrogen，美国），H2O3 程控金属
浴（GingkoBio，北京），电泳仪（Bio-Rad，美国），
凝胶成像仪（Bio-Rad，美国），MX3000P 荧光定量
PCR 仪（Stratagene，美国）。
1.2 方法
1.2.1 丁香假单胞菌黄瓜致病型 gap1 基因片段的扩
增 取 Pseudomonas syringae pv. lachrymans 甘油保存
液 10 μL 于液体 LB 培养基中在 28℃过夜培养，取
5 mL 菌液提取基因组，以提取的基因组为模板进行
PCR 扩增，用 primer5 根据 GenBank 上 Pseudomonas
syringae pv. lachrymans gap1 基因保守区设计引物 Xf1
Xf2，引物序列见表 1。PCR 反应体系为 2 μL 模板，
10×PCR buffer 5 μL 2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，Ex Taq
酶 0.5 μL，上下游引物各 1 μL，加 ddH2O 补足至 50
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.272
μL。反应程序 ：94℃ 5 min ；94℃ 45 s，51℃ 45 s，
72℃ 2 min，共 30 个循环 ；72℃ 10 min。对 PCR 产
物进行 1% 琼脂糖凝胶电泳，回收扩增产物保存并
测序（北京瑞博兴科）。与 GenBank 上 Pseudomonas
syringae pv. lachrymans gap1 基因 91％同源，可知此
菌为丁香假单胞菌黄瓜治病型中的其中一种。
1.2.2 荧光定量 PCR 引物设计和特异性验证 荧光
定量 PCR 引物的长度要求为 80-200 bp 间最好，最
长不能超过 300 bp，根据 primer5 根据上一步扩增并
回收的 636 bp 产物序列进行引物设计，得到扩增产
物为 126 bp 的一对引物 Dxr1 和 Dxf1，序列见表 1。
为验证引物特异性，以丁香假单胞菌黄瓜致病型基
因组为模板进行荧光定量 PCR 验证，常见的植物病
原细菌，包括水稻白叶枯病病原菌 ；番茄溃疡病病
原菌 ；黑腐病病原菌 ；青枯病病原菌，黄瓜缘枯病
致病菌和大肠杆菌、金黄色葡萄球菌两种模式细菌
基因组为对照。qPCR 体系为 SuperReal PreMix Plus
12.5 μL 引物各 0.4 μL 模板 2 μL加水补足至 25 μL。
扩增程序为 ：95℃ 10 min ；95℃ 1 min，60℃ 30 s，
72℃1 min，共 40 个循环。
表 1 引物序列
引物名称 引物序列（5-3） 目的产物长度
Xr1
Xf1
ATTCGAATGCACCGGTCTGT
TTGAGCAATTTGCCGCTGAC
636 bp
Dxr1
Dxf1
TCATCAGCGCGTTGACTTCT
ATGCCTACACCAACGACCAG
126 bp
1.2.3 构建重组质粒 使用 pGM-T 载体与 636 bp 的
PCR 产物连接，并转化到 DH5α 感受态细胞。进行
蓝白斑筛选，挑单个白斑于 20 mL LB 培养基中过夜
培养，提取质粒（天根质粒提取试剂盒）进行 PCR
鉴定和测序鉴定。
1.2.4 Real-time PCR 标准曲线的建立 用 Qubit 测
得质粒浓度，根据质粒拷贝数计算公式算出质粒拷
贝数，公式为（6.02×1023）×（ng/μL×10-9）/（DNA
length× 660）= copies/μL。 将 标 准 质 粒 稀 释 成
5×101-5×107 7 个体度在 MX3000P 荧光定量 PCR
仪上进行扩增，条件体系参见 1.2.2。总反应结束后
自动获得标准曲线和熔解曲线。
1.2.5 黄瓜细菌性角斑病实际样本的检测
1.2.5.1 PMA-qPCR 的技术原理 PMA-qPCR 技术以
细胞膜的完整性作为评判细菌死活的标准，主要是
由于当细胞的细胞膜不完整时，PMA 能够进入细胞
与细胞内的 DNA 结合，而细胞膜完整时 PMA 则会
被阻隔在细胞外面，当强光照射时，与 DNA 结合的
PMA 会形成叠氮基团使之结合的更紧密，从而阻止
其之后的 qPCR 扩增，而未与 DNA结合的 PMA 在
强光照射下会与水反应而被消除，所以细胞膜完整
的细胞，也就是活菌内的 DNA 可以扩增，而细胞膜
不完整的死亡细菌内的 DNA 则不会扩增［17］。根据
PMA 的技术原理可知 PMA 染料是在 DNA 提取时起
作用。
1.2.5.2 PMA 的预处理及 DNA 的提取 根据李聪
聪 等［18］ 的 方 法， 将 PMA 用 20 ％ DMSO 配 制 成 1
μg/μL 的 工 作 液，-20℃ 避 光 保 存。 称 取 患 细 菌 性
角斑病的黄瓜叶片 100 mg 迅速放进研钵用液氮研
磨，将粉末转移至 2 mL 的 EP 管中。向 EP 管内加
995 μL PBS，涡旋震荡。将 EP 管用铝箔纸包住，向
EP 管中加 5 μL PMA 工作液，使 PMA 的终浓度为 5
μg/mL。将加完 PMA 染料的 EP 管放入摇床 150 r/min
震荡 5 min 后，将所有管置于冰上，距离 500 W 氯
素灯下照射 5 min，期间隔 30 s 转动 EP 管，使其
照射均匀［19］。PMA 处理后将 EP 管 10 000 r/min 离
心 5 min，将液体吸干保留固体，再用 Trizol 法提取
DNA。
1.2.5.3 样 品 DNA 的 QPCR 检 测 将 上 步 提 取 的
DNA 为模板，条件体系参照 1.2.2，使用 MX3000P
荧光定量 PCR 仪进行实时荧光定量 PCR 检测，将
测得的 Ct 值代入标准曲线公式中算出样本中丁香假
单胞菌的拷贝数。
2 结果
2.1 丁香假单胞菌黄瓜治病型gap1基因的扩增
将产物回收测序后得到的片段长度为 636 bp，
与 GenBank 上 Pseudomonas syringae pv lachrymans
gap1 基因 91％同源，可知此菌为丁香假单胞菌黄瓜
致病型中的其中一种。
2.2 荧光定量引物的特异性验证
经过荧光定量 PCR 扩增后，只有丁香假单胞菌
黄瓜致病型有扩增，Ct 值为 14.66，其他的植物病原
2016,32(2) 73孔维文等：黄瓜细菌性角斑病 PMA-qPCR 检测方法的建立和应用
细菌，黄瓜病原细菌，模式细菌都没有 Ct 值（表 2）。
证明该引物可以区分黄瓜细菌性角斑病致病菌和其
他病原细菌。
表 2 黄瓜细菌性角斑病菌的特异性扩增结果
中文名称 拉丁文名称 Ct 值
黄瓜细菌性角斑病病原菌
Pseudomonassyringae pv.
lachrymans
14.66
水稻白叶枯病病原菌 Xanthomonas oryzae No Ct
番茄溃疡病病原菌
Clavibacter michiganensis
subsp. michiganensis
No Ct
黑腐病病原菌 Xanthomonas campestris No Ct
青枯病病原菌 Ralstonia solanacearum No Ct
黄瓜缘枯病致病菌
Pseudomonas marginalis
pv. marginalis
No Ct
大肠杆菌 E. coli No Ct
金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus No Ct
2.3 标准曲线的建立
重组质粒经测序表明插入的 gap1 基因片段与预
期的片段序列 100％同源。稀释的 5×101-5×107 7
个梯度的质粒经实时定量 PCR 扩增后自动生成基线、
阈值和熔解曲线。以质粒的拷贝数为横坐标，反应
的 Ct 值为纵坐标，绘制丁香假单胞菌 gap1 基因检
测的标准曲线，可得初始模板数与 Ct 值之间的线性
关系公式，为 Ct=-3.407×log 拷贝数 + 37.78，扩增
效率为 96.6％（图 1）。根据样本的 Ct 值通过此公式
可以计算出对应的初始拷贝数。另外熔解曲线为单
一峰，Tm 值为 88.2℃（图 2），证明引物特异性极好，
无引物二聚体和非特异性扩增。
2.4 重复性分析
选择 102、104、106 三个梯度的质粒进行组内和
组间的重复性分析，结果（表 3 和表 4）显示，组
内变异系数均小于 1％。组间变异系数均小于 2％。
2.5 实际样本的定量
将实验建立的 PMA-qPCR 方法应用于检测将黄
瓜细菌性角斑病叶片，PMA 预处理后提取基因组实
时荧光定量 PCR 进行检测（图 3），测得实际样品
的 Ct 值为 27.99，将实验测出的 Ct 值带入模板数与
Ct 之间的线性关系公式得出 gap1 基因的拷贝数为
7.69×102。
3 讨论
实时荧光定量 PCR 主要有两种方法，Taqman
探针法和 SYBR Green 荧光染料法［20］，后者能与所
有双链 DNA 结合，因此对 DNA 模板没有选择性，
34
32
30
28
26
24
22
20
18
16
14
12
10
C
tdR
1.00 e+02 1.00 e+03 1.00 e+04 1.00 e+05
Initial Quantitycopies1.00 e+06 1.00 e+07
Y=-3.407×LOGX+37.78 Eff.=96.6ˁ
图 1 gap1 基因标准曲线
3000
2000
1000
0
60 62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94
Fl
uo
re
so
en
ce
-R1 T Tm٬=88.2ć
温度 /℃
图 2 gap1 基因熔解曲线
表 3 gap1 基因 Real-time PCR 组内重复试验
拷贝数
Ct 值
平均值 标准差 变异系数 /％
1 2 3
102 25.67 25.72 25.64 25.68 0.040 415 0.16
104 18.69 18.81 18.68 18.73 0.072 342 0.52
106 10.61 10.81 10.72 10.71 0.100 167 1
表 4 gap1 基因 Real-time PCR 组内重复试验
拷贝数
Ct 值
平均值 标准差 变异系数 /％
1 2 3
102 25.67 25.89 25.64 25.73 0.137 1.86
104 18.69 18.92 18.67 18.76 0.139 1.93
106 10.61 10.67 10.80 10.69 0.097 9 0.94
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.274
菌准确定量。PMA-qPCR 方法联合应用此前也有很
多文献［23-26］报道过，但基本都是应用于水体中致
病菌的检测，很少应用于植物中病原体的检测。长
期以来，农业上也有很多种预防和处理黄瓜细菌性
角斑病的方法［27，28］，但由于细菌有活的不可培养
这一状态［29］，所以常规的平板技术法并不能准确的
验证这些处理技术的杀菌效果，结合本研究的 PMA-
qPCR 方法，可以对实际样本中活菌的数量进行准确
的定量，筛选出最有效的杀菌技术，为黄瓜细菌性
角斑病的防治提供有力的保证。
4 结论
本研究将 PMA 与 qPCR 技术结合，设计了一对
特异性引物 Dxf1、Dxr1，可以对活的黄瓜细菌性角
斑病致病菌进行准确定量，qPCR 体系为 SuperReal
PreMix Plus 12.5 μL 引 物 各 0.4 μL 模 板 2 μL 加 水
补 足 至 25 μL。 程 序 为 ：95℃ 10 min ；95℃ 1 min，
60℃ 30 s，72℃ 1 min，共 40 个循环。灵敏度为 5×
101 copies/μL。此外，以黄瓜细菌性角斑病病原菌为
实验组，其他植物细菌性病原菌和模式细菌为对照
组，进行荧光定量 PCR 扩增，验证引物特异性。结
果表明只有黄瓜细菌性角斑病致病菌有扩增。证明
该引物可以特异检测黄瓜细菌性角斑病病原菌。
参 考 文 献
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ᇎ䱵ṧᵜ1000
100
2 4 6 8 10 12 14 16 18
Cycles
20 22 24 26 28 30 32 34
Fl
uo
re
so
en
ce
/d
R
图 3 实际样品和标准品扩增曲线
因此，采用 SYBR Green 荧光染料法时对引物的特
异性要求高，应避免发卡结构，非特异性扩增，引
物二聚体生成。Taqman 法虽然针对特定的 DNA 模
板，但合成探针费用较高。本研究根据丁香假单胞
菌黄瓜致病型 gap1 基因设计的引物熔解曲线 Tm 值
单一，因此适用于 SYBR Green 荧光染料法，可以省
去 Taqman 探针合成的费用。
黄瓜细菌性角斑病与黄瓜霜霉病的早期性状十
分相似，单凭患病表征难以判定，在农业生产中容
易导致霜霉病和细菌性角斑病的混淆，引起误诊，
造成很严重的经济损失。近来也不乏有许多针对于
黄瓜细菌性角斑病的分子检测的研究，王哲等［21］
针对丁香假单胞菌的 gap1 基因设计一对特异性引
物，对不同来源的 12 株丁香假单胞菌进行 PCR 扩
增，均扩增出 179 bp 的条带，其他参试菌株都没有
扩增出条带，该方法的灵敏度为 7. 5×103 CFU/mL，
利用该方法可从接种后的黄瓜叶片中检测到特异条
带。王平等［22］针对丁香假单胞菌的 ITS 序列设计特
异性引物，扩增出 473 bp 的条带，利用该方法可直
接对黄瓜叶片汁液进行病原菌检测，并且可在接种
后病症发生前 72 h 内检测到病原。此外，Fogliano 等［8］
也建立了血清学的检测方法，在每克鲜植株中可以
检测出近 0.1 mg 的 syringpeptins。这些方法都可以快
速地检测丁香假单胞菌，但灵敏度不够。用于检测
该致病菌的荧光定量 PCR 检测方法也未见报道。本
研究构建的实时荧光定量的方法不仅可以快速鉴定
致病菌，还能准确的对其进行定量，可以检测 5×101
copies/μL。
将 PMA 与 qPCR 联合应用可以对有活性的致病
2016,32(2) 75孔维文等：黄瓜细菌性角斑病 PMA-qPCR 检测方法的建立和应用
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（责任编 狄艳红）