全 文 ：第 32卷 第 5期 生 态 科 学 32(5): 636-641
2013年 9月 Ecological Science Sept. 2013
收稿日期：2013-01-07收稿，2013-04-05接受
基金项目：国家海洋公益性行业科研专项(201305021; 201105008-E).
作者简介：张瑜斌(1970—), 男, 博士, 副教授, 主要从事滨海湿地生态学研究. E-mail: zhangyb@gdou.edu.cn.
*通讯作者：张瑜斌, E-mail: zhangyb@gdou.edu.cn

张瑜斌，崔焱芸，郑运，孙省利. 甲醛固定对 Live/Dead BacLight Bacterial Viability Kit死活细菌染液荧光显微计数海洋细菌的
影响[J]. 生态科学, 2013, 32(5): 636-641.
ZHANG Yu-bin, CUI Yan-yun, ZHENG Yun, SUN Xing-li. Effect of formaldehyde fixation on fluorescent microscope enumeration of
bacteria in marine samples stained with the Live/Dead BacLight Bacterial Viability Kit dye[J]. Ecological Science, 2013, 32(5):
636-641.

甲醛固定对 Live/Dead BacLight Bacterial Viability
Kit死活细菌染液荧光显微计数海洋细菌的影响

张瑜斌
*
，崔焱芸，郑运，孙省利
广东海洋大学海洋资源与环境监测中心，湛江 524088

【摘要】利用 Live/Dead BacLight Bacterial Viability Kit死活细菌染液对采自湛江东海大堤海水、沉积物细菌和大型海藻拟刚毛
藻（Cladophoropsis zollingeri）内生细菌数量进行了甲醛固定处理前后的荧光显微计数对比分析。结果表明，新鲜样品（不加甲
醛固定）、甲醛刚固定样品、甲醛固定 1周样品和甲醛固定 2周样品中海洋细菌数量差异不显著（p>0.05）。甲醛固定对 Live/Dead
BacLight Bacterial Viability Kit死活细菌染液荧光显微计数海洋细菌数量无显著影响，固定后的样品可在 2周内完成计数。
关键词：甲醛固定；Live/Dead BacLight Bacterial Viability Kit染液；细菌荧光显微计数
doi:10.3969/j.issn. 1008-8873.2013.05.019 中图分类号：P714.5; X834 文献标识码：A 文章编号 1008-8873(2013)05-636-06
Effect of formaldehyde fixation on fluorescent microscope enumeration of bacteria
in marine samples stained with the Live/Dead BacLight Bacterial Viability Kit dye

ZHANG Yu-bin*, CUI Yan-yun, ZHENG Yun, SUN Xing-li
Monitoring Center for Marine Resources and Environments, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China

Abstract: Effect of formaldehyde fixation on bacteria numeration of seawater, sediment and macroalga (Cladophoropsis zollingeri)
tissue collected from Donghai embankment in Zhanjiang, Guangdong was studied on the basis of fluorescent microscopic enumeration
stained with the Live/Dead BacLight Bacterial Viability Kit dye. No significant difference in bacteria densities was found between
pre-formaldehyde fixation samples (fresh samples) and post-formaldehyde fixation ones (just fixed sample, fixed for 1 week and 2 weeks
sample) (ANOVA, p>0.05). Therefore, the formaldehyde fixation was unable to influence bacteria densities of marine samples
numerated by fluorescent microscopic enumeration stained with the Live/Dead BacLight Bacterial Viability Kit dye, and the bacterial
densities of marine samples should be measured within two weeks after fixation.
Key words：formaldehyde fixation; Live/Dead BacLight Bacterial Viability Kit dye; bacteria fluorescent microscopic enumeration
5期 张瑜斌，等. 甲醛固定对 Live/Dead BacLight Bacterial Viability Kit死活细菌染液荧光显微计数海洋细菌的影响 637
1 引言 (Introduction)

海洋细菌是海洋生态系统的主要分解者, 它们
能分泌各种酶来水解有机物，并且吸收所产生的可溶
性有机物，释出无机物质[1]，这一过程是由活细菌承
担的，所以估算活细菌的数量和生物量对于研究细菌
在海洋生物地球化学过程中的作用具有积极意义。海
洋细菌荧光显微直接计数常用的方法有吖啶橙染色
法（AODC）、DAPI染色法、活菌直接计数法（DVC）
法[2,3]。
AODC法中采用吖啶橙染色剂，它和细菌接触以
后, 可以和细胞中的核酸物质特异结合, 然后在激发
光的激发下产生绿色或红色的荧光，处于静止期或不
活动状态时将是绿色荧光, 因为它们的核酸主要是
双螺旋DNA，而死细菌细胞中的DNA则被破坏成单
螺旋DNA，它与吖啶橙反应呈现红色的荧光，但在
培养过程中，处于高速生长的细菌细胞中，由于其
RNA 占优势，因此也成红色荧光，因此吖啶橙染色
法是无法准确区分死活细菌的[2,3]。DAPI即4, 6-二脒
基-2-苯基吲哚，是一种能够穿透细胞膜与DNA强力
结合的荧光染料，它与DNA结合的后的荧光强度要
比与RNA结合后的强度强，可以用于活细菌计数[4,5]。
活菌直接计数法(DVC)采用向样品加入微量的酵母
膏及萘啶酮酸(Nalidixic acid)，阻碍革兰氏阴性细菌
的细胞分裂, 而其它合成作用代谢途径则照常进行,
这就导致形成大型丝状细胞, 视野中伸长、变粗、发
橙红色荧光的菌体被认为是活菌，这种方法也只能对
革兰氏阴性活细菌计数，而无法对革兰氏阳性细菌和
死细菌计数的 [2,3]。而采用 Live/Dead BacLight
Bacterial Viability Kit死活细菌染液对细菌样品进行
荧光染色，对具完整细胞结构的活细菌可以染成绿
色，而对细胞膜受损的死细菌则染成红色，进而对活
细菌/死细菌区别计数[6]。
在对海洋细菌样品计数实验中，往往遇到样品采
集地离实验室路途远、样品多、工作量大而无法在短
时间内完成计数的情况，故经常采用现场加适量甲醛
固定后回实验室再在定期内进行荧光显微计数，如此
处理出来的计数结果尤其是AODC或DAPI法都是经
过甲醛固定后的死细菌的结果。本文利用Live/Dead
BacLight Bacterial Viability Kit死活细菌荧光染色剂
对海水细菌、沉积物细菌和大型海藻拟刚毛藻
（Cladophoropsis zollingeri）内生细菌的新鲜样品（不
加甲醛固定）、甲醛刚固定样品、甲醛固定1周样品
和甲醛固定2周样品进行计数比较，探讨甲醛固定在
利用Live/Dead BacLight Bacterial Viability Kit死活细
菌荧光染液对死活细菌荧光显微计数的影响，为海洋
细菌荧光显微计数的准确性提供方法依据。

2 材料与方法 (Materials and methods)

Live/Dead BacLight Bacterial Viability Kit荧光
染料由 SYTO 9染料与 Propidium iodide（碘化丙啶）
组成。SYTO 9染料能透过完整的细胞膜与结构受损
的细胞膜，并把细胞膜染成绿色，而碘化丙啶只能渗
透受损的死细菌细胞膜，当两染料结合在一起的时候
将呈红色荧光[6]，由此可对死活细菌分别计数。一般
而言，样品中的细菌量在 103～108ind./mL时，用此
法效果较好，准确性高[7]。

2.1 试剂配制和处理
绿红荧光染料：购置的 Live/Dead BacLight
Bacterial Viability Kit荧光染料由组分A和组分 B组
成。组分 A为 SYTO 9 dye，浓度 3.34 mM，用二甲
基亚砜稀释；组分 B为 Propidium iodide, 浓度 20
mM，用二甲基亚砜稀释。使用时等体积混合，储存
于-20℃，避光保存。无菌冲洗水：用蒸馏水经 0.22mm
微孔滤膜抽滤而成。甲醛溶液：市售 40％的甲醛经
0.22mm微孔滤膜抽滤，用于固定水样，按水样量的
3％～5％加入。

2.2 仪器设备
荧光显微镜(Nikon Eclipse 80i型)；过滤器：内径
25 mm，容积 15 mL，玻璃制；荧光染色微孔滤膜：
孔径 0.22 mm，直径 25 mm，whatman公司产品；移
液器；一般实验室常用设备。

2.3 样品采集与处理
海水样品用干净无菌的 50 mL玻璃瓶采集湛江
东海大堤沿岸海域的大约 40 mL 的天然海水。沉积
物无菌采集湛江东海大堤潮滩表层 1～2 cm 的沉积
物，混合均匀后装入无菌培养皿中立即送实验室，然
后称取 1.0 g用 100 mL经 0.22 mm滤膜过滤的陈海水
将沉积物混合均匀，静置后取其上清液存放于 50 mL
的样品瓶中供细菌计数用。大型海藻采于湛江东海大
堤 潮 滩 处 的 天 然 拟 刚 毛 藻 （ Cladophoropsis
zollingeri），海藻样品采集后立即送实验室，先用自
来水冲洗干净，晾干后用 70%的酒精浸泡 40 s，然后
生 态 科 学 Ecological Science 32卷 638
用无细菌颗粒的水冲洗一次，接着用无菌的干棉花将
其擦干，再用千分之一的升汞溶液浸泡 30 s，然后用
无菌水冲洗四次，最后再用无菌的干棉花擦干。经过
如此表面无菌处理的石莼样品再进行研磨，称取 4 g
样品置入研钵中，加入灭菌的石英砂和大约 10 mL的
提取液（无细菌颗粒的陈海水），然后研磨直至样品
呈匀浆状，浆状样品转移到 50 mL的三角瓶中，剩余
的 30 mL 提取液少量多次洗涤研钵后转移到三角瓶
中。再加入 400 µL的两千分之一的吐温 80溶液，漩
涡振荡 1 min再静置 15 min。最后取其上清液存放于
样品瓶中备用。

2.4 细菌荧光染色与荧光显微计数
对于新鲜水样、沉积物和大型海藻内生细菌的新
鲜提取样品，吸取 1 mL样品（未加甲醛固定）注入
过滤器内，抽干样品，使得细菌滞留于微孔滤膜上，
同时加入 1.5 mL 无菌蒸馏水，然后分别加入 5 µL
Live/Dead BacLight Bacterial Viability Kit 染色液的
组分 A和 B，混匀，在黑暗中染色 15 min [6]，即在
负压下滤去染色液，随后用无菌冲洗水沿滤器筒壁冲
洗数次，再将滤液抽干。之后将滤膜制片移置于荧光
显微镜下观察，随机计算 30 个视野的细菌数，并根
据公式计算最终数量结果[7]。上述新鲜水样、沉积物
和大型海藻的新鲜提取样品在测定完其荧光显微计
数结果后，按照海洋监测规范添加适量的甲醛固定
[7]，立即按照上述新鲜样品方法进行荧光显微计数
（作为刚固定样品），之后在加入甲醛 1周、2周后
按照上述方法分别进行荧光显微计数（分别作为固定
1周样品与固定 2周样品），以比较样品处理在时间
上的计数结果差异。

2.5 数据统计
甲醛固定前后各类样品荧光显微计数结果的差
异显著性采用单因子方差分析 [8]，统计过程使用
SPSS16.0软件完成。

3 结果(Results)

3.1海水
海水不同处理类型样品的细菌荧光显微计数结
果显示（表 1），新鲜海水样品的活细菌数量为 6.9
×106 ind./mL，甲醛刚固定的海水样品活细菌数为 7.1
×106 ind./mL，固定 1周和 2周后的海水样品的活细
菌数量分别为 7.0×106 ind./mL和 6.9×106 ind./mL。
方差分析显示，4种处理类型的海水细菌计数平均值
差异不显著（p=0.930>0.05）。由此可见，海水样品
经甲醛固定后，2 周之内使用 Live/Dead BacLight
Bacterial Viability Kit染色液完成活细菌计数工作，
对最终结果的影响不显著。

3.2沉积物
沉积物不同处理类型样品的细菌荧光显微计数
结果显示（表 2），新鲜沉积物样品的活细菌数量为
7.5×107 ind./g，甲醛刚固定的沉积物样品活细菌数为
7.9×107 ind./g，固定 1周和 2周后的沉积物样品的活
细菌数量分别为 8.0×107 ind./g和 7.9×107 ind./g。方
差分析显示，4种处理类型的活细菌计数平均值差异
不显著（p=0.611>0.05）。因此，沉积物的提取液经
甲醛固定后，2 周之内使用 Live/Dead BacLight
Bacterial Viability Kit染色液完成活细菌计数工作，
对最终结果的影响不显著。
3.3 大型海藻拟刚毛藻
拟刚毛藻不同处理类型的内生细菌荧光显微计
数结果显示（表 3），新鲜样品的内生细菌数量为 7.4
×107 ind./g，甲醛刚固定的样品内生细菌数为 7.2×
107 ind./g，固定 1周和 2周后的样品内生细菌数均为
7.0×107 ind./g。方差分析显示，4种处理类型的内生
细菌活菌计数平均值差异不显著（p=0.170>0.05）。

4 讨论（Discussion）

对于海洋样品细菌数量的分析，在《海洋监测规
范》和《海洋调查规范》中推荐的直接计数方法是吖
啶橙染色法（AODC）与 DAPI法[7,9]。吖啶橙染色法
采用吖啶橙作为染色剂，在激发波长下观察，处于静
止期或不活动状态的细菌细胞呈绿色荧光，死细菌与
吖啶橙反应呈红色的荧光，处于高速生长的细菌细胞
中亦呈红色荧光，因此采用 AODC 无法区分活细菌
与死细菌细胞的。尽管吖啶橙染色法的特异性强、检
出率高，但是染色标本不易保存，所需保存条件高，
仅限实验室内操作，同时 AODC 法的荧光会在短时
间内淬灭，须在短时间内迅速观察，这对实验的可操
作性产生了较大的限制[7,10]。
DAPI法采用 4,6-二脒基-2-苯基吲哚染色剂，可
以跟 DNA强力结合的荧光染料，而活细菌和死细菌
5期 张瑜斌，等. 甲醛固定对 Live/Dead BacLight Bacterial Viability Kit死活细菌染液荧光显微计数海洋细菌的影响 639
的核酸都是 DNA，所以 DAPI 也是无法区分死细菌
和活细菌细胞的[9]。同时，由于 DVC 法采用萘啶酮
酸作抑菌剂，革兰氏阳性菌及部分革兰氏阴性菌对低
浓度的萘啶酮酸有抗性，因而造成计数结果偏差[3]，
且 DVC需要数小时的培养过程，这显然对样品多、
工作量大的海洋样品细菌数量分析不利。Live/Dead
BacLight Bacterial Viability Kit死活细菌染色剂对细
菌样品进行荧光染色，所用核酸染色剂为 SYT0 09
和碘化丙啶，对具完整细胞结构的活细菌可以染成绿
色，而对细胞膜受损的死细菌则染成红色，进而对活
细菌/死细菌区别计数。与其它活菌检测方法相比，
Live/Dead BacLight染色法前处理简单，可使待测样
品中的微生物基本保持原环境中的状态，测定过程所
需时间短，且不受细菌类群的影响[6]。尽管 Boulos
等发现，在无高温度、高氯离子浓度等不利环境的条
件下，Live/Dead BacLight染色法与 AODC法的结果
不存在显著性差异，但 Live/Dead BacLight染色法不
易产生荧光淬灭现象，有利于实验的观察和拍照[11]。
与此同时，Live/Dead Baclight染色法在其他环境的细
菌显微计数中也得到了广泛的运用，如梁鹏和黄霞用
Live/Dead Baclight 染色法直接对稀释后的污泥悬浊
液进行测量，测定出了活性污泥中的活菌水平[12]；
Quéric等同样证明，Live/Dead Baclight染色法适用于
海洋沉积物和深海沉积物中底栖细菌数量的测定[5]。
由此可见 , 利用 Live/Dead Baclight Bacterial
Viability Kit染液的荧光显微计数法可广泛应用于海
洋环境样品活细菌数量的检测。
通过对海水细菌、沉积物细菌及大型海藻拟刚毛
藻内生细菌荧光显微计数分析发现，在合理控制样品
稀释倍数的情况下，甲醛固定对 Live/Dead BacLight
Bacterial Viability Kit染色剂计数结果的影响不显著，
鉴于使用该染液荧光显微计数可以直接获得有生态
学意义的活细菌数，而甲醛固定在 2周内对最终计数
结果没有显著影响，这无疑为海上采样和室内实验室
分析提供了便利条件。

表 1 海水样品细菌计数结果*
Table 1 Enumeration of bacteria in seawater samples
样品处理类型
Treatment of sample
计数记录
Record of enumeration
平均值
Mean
样品细菌数量 Density of
bacteria（×106ind./mL）
24 29 27 28 31
16 26 26 34 22
27 25 27 20 27
29 28 23 27 33
21 21 26 32 32
新鲜样品
Fresh sample
28 34 31 16 32
26.7 6.9
19 27 20 34 24
26 17 29 18 37
36 31 27 25 27
28 19 33 23 30
28 28 32 35 27
刚固定样品
Sample just fixed
28 29 27 23 34
27.4 7.1
23 28 30 27 29
26 31 28 29 30
23 32 30 28 25
30 31 29 23 32
30 29 21 26 21
固定 1周样品
Sample fixed for 1
week
23 29 23 25 23
27.1 7.0
29 36 22 21 31
19 27 29 35 25
23 26 21 24 22
25 25 35 19 22
25 31 27 29 29
固定 2周样品
Sample fixed for 2
weeks
30 23 39 24 27
26.7 6.9
注：海水样品稀释 10倍. Note: The seawater was diluted by 10 times.

生 态 科 学 Ecological Science 32卷 640
表 2 沉积物样品细菌计数结果*
Table 2 Enumeration of bacteria in sediment samples
样品处理类型
Treatment of sample
计数记录
Record of enumeration
平均值
Mean
样品细菌数量 Density of
bacteria（×107ind./g）
28 25 29 22 28
23 30 24 28 34
39 32 29 25 31
24 35 26 28 26
33 23 26 35 36
新鲜样品
Fresh sample
33 25 34 25 32
28.9 7.5
33 34 29 27 29
30 25 24 33 44
34 26 30 39 26
31 25 26 21 35
25 30 36 31 29
刚固定样品
Sample just fixed
32 29 36 27 34
30.3 7.9
32 27 39 30 33
44 27 29 30 31
36 35 38 39 41
35 35 31 27 35
24 24 22 23 26
固定 1周样品
Sample fixed for 1 week
23 26 24 26 29
30.7 8.0
23 28 22 33 21
33 32 19 27 31
34 31 21 23 34
30 33 27 23 26
41 36 23 45 36
固定 2周样品
Sample fixed for 2 weeks
38 34 32 36 42
30.5 7.9
注：沉积物样品稀释 100倍. Note: The sediment was diluted by 100 times.

表 3 拟刚毛藻内生细菌计数结果*
Table 3 Enumeration of endophytic bacteria in macroalgal tissue of Cladophoropsis zollingeri
样品处理类型
Treatment of sample
计数记录
Record of enumeration
平均值
Mean
样品细菌数量
Density of bacteria
（×107ind./g）
27 25 33 26 29
26 28 27 31 28
30 34 29 24 31
26 24 28 27 26
29 25 36 28 33
新鲜样品
Fresh sample
28 27 27 30 25
28.2 7.4
37 32 27 29 28
28 21 26 25 31
26 34 29 36 25
33 32 28 19 33
32 27 26 25 23
刚固定样品
Sample just fixed
28 24 19 22 22
27.6 7.2
5期 张瑜斌，等. 甲醛固定对 Live/Dead BacLight Bacterial Viability Kit死活细菌染液荧光显微计数海洋细菌的影响 641
25 33 23 31 28
23 31 26 24 30
27 26 20 28 26
25 32 24 31 28
29 20 29 26 24
固定 1周样品
Sample fixed for 1 week
26 28 27 25 25
26.7 7.0
26 34 23 28 26
28 22 25 21 37
27 23 24 28 23
26 29 28 25 20
25 23 30 26 29
固定 2周样品
Sample fixed for 2 weeks
30 25 27 22 28
26.7 7.0
注：拟刚毛藻样品稀释 100倍. Note: The tissue of Cladophoropsis zollingeri was diluted by 100 times.

5 结论（Conclusions）

甲醛固定后，在 2 周内利用 Live/Dead BacLight
Bacterial Viability Kit死活细菌染色液进行染色，完
成海水、海洋沉积物和大型海藻内生细菌的活菌荧光
显微计数，对最终结果没有显著影响，这为海上采样
和室内实验室分析提供了便利条件。

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