全 文 ：生态科学2006年12月第25卷第6期 ECOLOGlCSCIENCEDec．，2006，25(6)：512～516
利用PCR方法研究广州市景观湖产毒微囊藻的季节
分布特点
李慕婵，袁嘉恩，雷腊梅，谢数涛，韩博平+(暨南大学水生生物研究中心，广州510632)
【摘要】 为研究景观水体中产毒微囊藻的季节性分布特点，利用针对蓝藻和微囊藻的16srcINA、微囊藻毒素合成酶
坍咖基因的部分核苷酸序列设计和筛选的特异性引物，对广州市内8个景观湖108份水样进行了冬季、夏季和秋季的
二重及套式PcR的检测。结果显示，在冬季能被检测出的产毒微囊藻的阳性水样为42份，夏季为102份，而秋季为
100份；阳性率分别为38．9％、94．4％、92．5％，产毒微囊藻在夏季和秋季阳性率高。结果表明在冬季、夏季和秋季均
有产毒微囊藻分布；夏、秋季是广州市景观水体微囊藻污染的高峰季节，值得引起水文部门足够的重视。
关健词：产毒微囊藻，二重PCR，套式PCR，景观水体
中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：1008．8873(2006)06-512．05
Usin2PCRforstudyin2seasonaldistributionof oxicmicmcystisf而msceniesitesinGuan昭hou
LIMu·ch锄，YUANJia-en，LEILa-mei，XIEShu-ta0，HANBo—ping(ResearchCenterofHydmbiolog)，，JinaIlUniVers咄
Guangzhou5l0632，China)
Abstract：Baseonmeconserved16SrDNAgeneofmicrocystis，cyanobacteriaandmicrocystinsynthetasegenB(mcyB)．A
duplexPCRandnestedPCRwa-eusedtDdetecttoxicspecjesat ightscenics tes，including(熔watersamplesinGuangzhou
ofGuangdongpmvinceinthrees asons．Resultsshowt lattotalpositiveratiooftoxicMicmcystiswas38．9％inwinteI；94．4％
insummeraIld92．5％iIlautum．Thisstudyemonstratedth toxicMicrocystisdis廿ibutedinwinters岫meraJldautumnarld
MicrocvstinspollutionsinGuangzhouscenicsiteswasmainlyinsummerandautu砌．
Keywords：noxiousMicrocvstis，du脚exPCR，nestedPCILbeautyspots
富营养化水体中蓝藻大量繁殖，形成水华，不仅使
水体可观赏性下降，影响生态景观和旅游业，而且微囊
藻(^以c加c炉f括)产生的微囊藻毒素(^以crDc)，sf砌s，简
称MC)是一种环状七肽肝毒素，是强烈的肝肿瘤促进
剂【lqJ。曾有文献报道人饮用了含有产毒藻及藻毒素的
水后，引起中毒甚至死亡的事件【l~31。此外，微囊藻毒
素通过水生生物的富集和存留，并通过生物链而对人类
健康有潜在的危害【蝴】。公园的景观水与人类的生活密
切相关，在冬、夏季和秋季，其作为观赏水体、灌溉水
体、游泳场、钓鱼场和水上娱乐的场所吸引大量人群。
然而，据报道有人在接触了发生水华的水体后产生了皮
肤炎症、口腔炎症等急性炎症p10】。因此，为了进一步
探索微囊藻产毒规律，预防和控制景观水体中微囊藻毒
素对人类健康的危害，研究景观水体中的产毒微囊藻的
季节性分布具有重要的意义。
目前，分析产毒微囊藻毒素的常规方法有高效液相
色谱法(HightPerfo珊anceLiquidChromato蓼aphy，
HPLC)、酶联免疫吸附法(En巧meLinked
lmmunosorbentAssay，ELISA)等，这些方法各具有不同
程度的局限性。在微囊藻毒素合成酶基因被克隆的基础
上，国内外有学者采用套式全细胞PcR对湖泊、水库
进行检测【12】。但是，关于景观水体产毒微囊藻季节性
的分布这方面的报道较少。本文通过采用二重和套式全
细胞PCR方法分别对蓝藻、微囊藻和产毒微囊藻三季
数值的对比、验证，研究景观水体产毒微囊藻季节性分
布特点，为进一步研究蓝藻污染的防治提供重要补充。
l材料和方法
1．1材料来源
产毒微囊藻阳性藻株由暨南大学水生生物研究中
心分离、保存。水样采自广州市内主要风景区：流花
湖公园、越秀公园、东山公园、晓港公园、天河公园、
荔湾公园、白云山风景区内景观湖以及暨南大学明湖。
风景区景观湖的采样点设置按不同湖区划分，水
样为表层水，采集后低温(约1℃)保存运回实验室，
收璃日期：2006’08．05，2006_10．20接受
基金项目：广东省科技攻关(2KM06103s)和珠海重大科技项目
(PC20052040)资助；
作者简介：李慕婵(1982一)，女。硕士研究生。研究方向：动物资源与
分子生物技术。
·通讯作者：E哪ail：tbph锄@jnu．硪1．cn
万方数据
6期 李慕婵，等：利用PCR方法研究广州市景观湖产毒微囊藻的季节分布特点 513
．20℃保存备用。采样时间从2005年11月至2006年
11月。
1．2 风景区景观湖水样藻细胞和实验室阳性藻株的
处理
将水样(阳性藻株)解冻后，充分混匀；取2mL于
离心管中，12000g离心10min，弃上清，藻细胞沉
淀用30皿无菌双蒸水重悬备用。
1．3 PCR反应
PCR反应所用引物序列参见参考文献[11．12】
(1)二重PCR扩增条件参见参考文献[11】
总体积为50此的反应液中包含引物27F1、209
F、409R分别为20pmoL、30pmoL、50pmoL，10
mmol·L～一ldNTP10pmoL，BSA(59·L一，广州宝龙公
司)l“L，Taq酶2U(上海申能博彩公司)，10×PCR
buffer，5此处理后的阳性藻液和10此处理后的
水样。
(2)套式PCR扩增条件参见参考文献[12】
第一步PCR扩增的反应体积为50此，引物各20
pmoL，10nunol·L～一1dNTPlOpmoL，BSA(5g·L～，
广州宝龙公司)1止，10xPCRbu虢r，1’aq酶2u(上海
申能博彩公司)，模板为10“L处理后的阳性藻液和
15此处理后的水样。取其PCR扩增产物l灿作为第
二次扩增的模板，其他参数相同进行第二次PCR
扩增。
PCR反应扩增结束后，取PCR产物6“L，1．0％
琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外灯下观察和拍照。
2结果
2．1产毒微囊藻的检测
产毒微囊藻得到特异的扩增条带，如图1所示。
其第一步扩增产物电泳后位于750bp和500bpDNA
分子量标记之间，与目标基因片段大小(689bp)相符。
第二步PCR扩增产物电泳后位于250bp和500bp
DNA分子量标记之间，与目标基因片段大小(337bp)
相符。
2．≥风景区水样的检测
2．2．1风景区水样二重PCR检测结果对广州市内8
个风景区在不同季节和位点采集的108份水样，进行
二重PCR的扩增。扩增产物分别经琼脂糖凝胶电泳、
EB染色后，紫外灯下观察。根据紫外灯下有无预期
大小的特异性扩增条带，判断检测结果为阳性或阴性。
水样检测结果分别见表l和表2。
M：marker，l~7：N啪berof姗ples
图l 产毒微囊藻经一步PCR和套式PcR的扩增结果
Fig．1Ther明ultsof行rsttepPCRandnestedPCRofnoxious^“d∞q堪f纽
表1 风景区水样二重PcR检测结果1
1ab．1ThePCRampIincationresultsfbeaut!IrspotssampIes
暨南大学Jin蛳Universitv6 6 2 6 6 6 6
天河公园TiaIlllePark 24 12 6 2l 2l 18 16
东山公园Dongsh锄Park15 9 3 12 12 10 8
晓港公园Xiaog柚gPark 12 9 4 9 9 8 7
自云山BaivunMolllltaill21 2l 18 21 2l 18 18
越秀公园YuesiuPark12 12 3 12 12 12 12
流花公圃LiuhuaPark6 6 3 6 6 6 6
荔湾公园LiwanPark 12 12 5 12 12 12 12
万方数据
万方数据
6期 李慕婵，等：利用PCR方法研究广州市景观湖产毒微囊藻的季节分布特点 515
表5风景区水样一步PCR与二步PCR检测结果对比
。!垒堕：苎 !：垒!!壁坐巳璺!堕i竺堕Q!Q坠!!!竺P!￡￡垦璺望坚望竖!!堕￡￡墨垒堡巳!!!!!璺!!壁坠堡!望!垒旦!垒!璺坚垒!P壁兰璺!璺婴巳!!!
采样地点 冬季、Mnter 夏季Summer 秋季Autu眦
Samplings tc A B A B A B
注Note：A代表二步PcR检测结果阳性率％，B代表一步PcR检测结果阳性率％Arepres％tS出epoSitiverateof吐ledupl％PcR，Br印rc辩nts也epositiverateofon
st印PCR
cells／反应。表三数据显示，在全部景观区108份水样
中，冬季和秋季水样经一步PCR扩增检出阳性结果和
阳性率分别0份和0％；而夏季水样经一步PCR扩增检
出阳性结果2份，阳性率为1．9％。
由表4显示，在冬季，二步PCR检测出了42份
阳性样品，阳性率为38．9％；在夏季，二步PCR检测
出了102份阳性样品，阳性率为94．4％；而在秋季，·
二步PcR检测出了100份阳性样品，阳性率为92．5％。
2．2．3风景区水样套式PCR与一步PCR检测结果比较
风景区水样套式PcR与一步PCR检测结果比较结果
见表五。由表5显示，采用普通的PCR方法(一步法)
扩增的阳性率几乎全部为零，但是，通过二步PCR几
乎每一个样品都能扩增出阳性结果。一步PcR与二步
PCR的结果存在较大的差异。
3讨论
本文所采用的二重PCR对景观区108份水样的检
测中，微囊藻在冬季、夏季和秋季均有分布，夏季和
秋季的数量分布较多，而且在两季度的数量变化不明
显。微囊藻是一种喜欢中高温的藻类，最适的生长温
度为25～30℃。当温度下降至15℃时，微囊藻的生
长受到抑制。广东省地处热带亚热带地区，夏、秋季
的水温都保持在20℃以上，适合微囊藻生长。而冬
季水温普遍都低于lO℃以下，因此微囊藻的生长受
到限制。
在冬、夏、秋三个季节经一步PCR扩增的阳性率
几乎全部为零，与二步PCR检测结果存在较大差异，
这说明景观水样中产毒微囊藻的浓度相对较低，未能
达到一步PCR检测的范围104～107cells·mL～。因此
对于景观的产毒微囊藻，采用普通的PCR方法(一步
法)可能因灵敏度不够而不能检测出阳性结果。由于套
式PCR方法检测下限可以达到102～10
7
cells·mL～，
因此套式PCR方法是适用于藻细胞浓度相对较低的
水样的检测。
通过套式PCR，在对景观区108份水样的检测中，
冬季水样经二步PcR仅检测出42份产毒微囊藻的阳
性样品，阳性率为38．9％。表明广东省风景区冬季水
体中，产毒微囊藻的分布相对较少，丰度相对夏季和
秋季较低。这可能是在冬季，微囊藻在种群数量上占
优势，竞争压力较低，所以微囊藻产毒量减少；而夏
季和秋季的水样经过二步PCR后分别检测出102、100
份阳性样品，阳性率分别为94．4％和92．5％，表明在
夏、秋季水体中产毒微囊藻分布较高。其主要原因是
广东夏、秋季的光照、温度、营养盐等物理环境适于
微囊藻生长。而从种群竞争角度研究，夏季淡水藻类
种群丰度大，种间竞争加剧，能产毒的微囊藻藻株种
群竞争能力强，从而获得竞争优势，最后密度增加【l31。
与广东水库的产毒微囊藻的分布相比[141，广州景
观水体的产毒微囊藻具有分布更广，丰度更大的特点。
这可能是因为景观湖多为低地浅水的小型人工水池，
因而对浮游植物的营养盐的供应相对比较充足。广州
是我省工业发达的市区，人口密集并且旅游业发达。
位于市内的8个风景景观湖水容量小，补水量也小，
容易受城市工业废水和生活污水的污染，而导致景观
水体的氮磷浓度相对比水库的浓度要高。氮磷是浮游
植物生长所必需的营养元素，而含有较多的氮磷的水
体更有利于微囊藻的生长。此外，人们对风景湖水体
的关注较少，也没有采取健全的保护措施，致使受污
染的水体没有得到有效的治理。因此，水体产毒微囊
藻的污染更为严重。
水库中的微囊藻主要出现在丰水期【141(6～7月)，
而枯水期(1 ～12月)较少；景观水体的微囊藻主要出
万方数据
516 生态科学 25卷
现在夏季和秋季，而冬季较少。水库和景观水体的微
囊藻夏季的分布时间基本相同。这可能是由于夏季光
照时间的增加和温度的上升，以及营养盐的高浓度都
有利于藻类生长繁殖。水库枯水期和景观水体的微囊
藻冬季的分布时间也基本相同，这可能是由于冬季温
度的下降和光照较少不利于微囊藻的生长。
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万方数据
利用PCR方法研究广州市景观湖产毒微囊藻的季节分布特点
作者： 李慕婵， 袁嘉恩， 雷腊梅， 谢数涛， 韩博平， LI Mu-chan， YUAN Jia-en， LEI La-
mei， XIE Shu-tao， HAN Bo-ping
作者单位： 暨南大学水生生物研究中心,广州,510632
刊名： 生态科学
英文刊名： ECOLOGIC SCIENCE
年，卷(期)： 2006,25(6)
被引用次数： 1次

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