全 文 ：第 32卷 第 6期 生 态 科 学 32(6): 763-768
2013年 11月 Ecological Science Nov. 2013
收稿日期：2013-09-16收稿，2013-10-02接受
基金项目：NSFC-云南联合基金《抚仙湖浮游甲壳动物的碳源及其演变》（U1033602）、广东省高校高层次人才项目《东南亚季风千年演化对湖光岩玛珥
湖生态环境的影响》（50524004）
作者简介：刘娟（1986—），女，硕士研究生； Email: xyelj@163.com
*通讯作者：姜仕军，E-mail: sjiang@jnu.edu.cn

刘娟，段昌兵，唐红渠，姜仕军. 沉积物硅藻提纯方法的优化[J]. 生态科学, 2013, 32(6): 763-768.
LIU Juan, DUAN Chang-bing, TANG Hong-qu, JIANG Shi-jun. An improved method for extraction and concentration of sediment
diatoms[J]. Ecological Science, 2013, 32(6): 763-768.

沉积物硅藻提纯方法的优化
刘娟，段昌兵，唐红渠，姜仕军
*
暨南大学水生生物研究所/水体富营养化与赤潮防治广东普通高校重点实验室，广州 510632
【摘要】传统的湖泊沉积物硅藻提纯方法存在周期较长、过筛会损失某些特定硅藻种类等问题，从而造成硅藻群落分析出
现偏差。基于硅藻提纯的实验原理和传统沉积物硅藻提纯技术，选取广东三个典型水库的沉积物的五个不同样品，设置了
三组优化实验，建立了一套适合水库沉积物硅藻的提纯方法。实验表明，该方法能有效地提纯和富集水库沉积物中的硅藻，
在简化实验操作的同时，明显缩短了提纯时间，并且更有利于其后硅藻壳体种属的鉴定，在水库沉积物硅藻群落分析具有较
好的应用价值。
关键词：硅藻提纯；水库沉积物；古生态分析
doi:10.3969/j.issn. 1008-8873.2013.06.014 中图分类号：Q913.5 文献标识码：A 文章编号：1008-8873(2013)06-763-06
An improved method for extraction and concentration of sediment diatoms
LIU Juan, DUAN Chang-bing, TANG Hong-qu, JIANG Shi-jun*
Department of Ecology / Key Laboratory of Eutrophication and Red Tide Prevention of Guangdong Higher Education Institutes, Jinan
University, Guangzhou 510632, China
Abstract: Traditional methods for extraction and concentration of diatoms from lake sediments have been more and more criticized for
being time consuming and losing particular species during sieving, and therefore resulting in biased diatom assemblages. Based on the
principles and procedures of traditional concentration methods, an improved method was developed through three sets of
optimization test on 5 samples from three different reservoirs of Guangdong Province. The experiment results showed that this improved
method can efficiently extract and concentrate diatoms from sediments, and meanwhile has the advantages such as simplifying
experiment procedure, shortening experiment time, and facilitating diatom identification. Thus, this method has great potential in
studying diatom paleoecology with reservoir sediments.
Key words: diatom concentration; reservoir sediments; paleoecology
生 态 科 学 Ecological Science 32卷

764
1 引言(Introduction)

在古湖沼学研究中，沉积硅藻组合分析是重建过
去环境演变的重要手段之一[1]。水库作为人工筑坝蓄
水的半自然水体，由于流域面积大，沉积速率快，是
开展十-百年时间尺度上高分辨率环境重建的理想研
究对象。尽管多数水库建于上世纪中叶，历史相对较
短，但由于缺乏长期的监测数据，无法获得水库及其
流域生态环境演变历史，给研究半世纪以来全球变化
和经济发展对我国淡水生态系统的影响带来困难。而
以古湖沼学为基础的古生态学研究正好是解决这一
问题的利器，以水库为代表的近半个世纪以来的环境
重建研究正逐步开展。水库沉积物中硅藻是探究水体
环境变迁的重要生物指标，借助于其种属分布的生态
特征可以推断水库及其流域在高速社会经济建设发
展过程中产生的环境变化。
研究沉积物硅藻涉及到的重要实验环节是提纯。
国内外多数报道主要针对硅藻同位素方面而采用的
提纯方法，其提纯过程中的过筛环节往往导致部分硅
藻属种的损失[2,3]，使得最终通过计数获得的硅藻组
合出现一定的人为偏差，影响环境重建的精确性和客
观性。本文以 Battarbee提供的方法为蓝本[4]，结合前
人的研究成果[2,5,6,]，根据样品处理和镜下鉴定中遇到
的具体问题，通过设置优化实验，建立起一套适合水
库沉积物硅藻提纯的实验方法，以期为水库古生态学
研究提供更科学的实验基础。

2 材料和方法(Materials and methods)

2.1 沉积物样品
为了确保该提纯方法具有广泛性和代表性，能适用
于不同营养梯度的水体，本实验共选择三个水库的五个
沉积物样品。流溪河水库（23°45′N，113°46′E），位于
广州从化流溪河国家森林公园内，是一座典型的热带-
亚热带过渡区大型水库[7]，水质综合评价结果为Ⅱ~Ⅲ
类，营养等级为贫营养或中营养 [8]。大沙河水库
（22°32′N，112°30′E），位于广东江门开平市，2011年
水质综合评价为Ⅳ类[9]，处于富营养状态[10]。茜坑水库
（22.70N, 114.02E）位于深圳市宝安区，为中型水库，
处于富营养水平[11,12]（表 1）。上述三个水库同处亚热
带，但营养水平以及沉积物特征各有不同，其硅藻优势
种及其个体大小、丰度差异较大，可代表亚热带地区的
不同类型的水体。利用这些样品探索建立硅藻提纯方
法，对华南地区的水库沉积物研究有普适意义。

表 1 提纯实验中使用 5个样品的基本背景
Table 1 Background information of the 5 samples used in this study
样品号
Sample No.
采样点
Site
样品
深度
Age
营养等级
Trophic level
硅藻与杂质碎屑比值
Percentage of diatoms:
clastic grains
平均粒径
Mean silt
size(Φ)
优势种
Dominant diatom species
1 流溪河水库 表层
10cm
贫-中营养 <1:99
（硅藻少）
5.715 Cyclotella stelligera
2 大沙河水库
S1
表层
9cm
富营养 16:75（多） 6.573 Aulacoseira granulate,
Aulacoseira ambigua
3 大沙河水库
S1
下层
41cm
富营养 <1:99(极少) 6.088 Aulacoseira ambigua
4 大沙河水库
S3
表层
1-3cm
富营养 37:63(较多) 5.876 Cyclotella stelligera,
Aulacoseira ambigua
5 茜坑水库 表层
1-3cm
富营养 8:92（中等） 8.079 Aulacoseira distans,
Cyclotella meneghiniana
所计数的碎屑为长度或直径大于 5 μm的杂质。Note: The length or diameter of all clastic grains counted was greater than 5 μm.


6期 刘娟，等. 沉积物硅藻提纯方法的优化

765
2.2 实验流程

未经处理的沉积物样品中，含有各种不同的杂
质，给后续硅藻的鉴定带来一定的困难，故需进行相
关的预处理，以达到制片要求。本文提供的实验流程
如图 1所示，对于硅藻含量特别丰富的样品，部分处
理步骤可略去。


图 1水库沉积物硅藻富集和提纯流程
Fig. 1 Flow diagram for concentration and purification of
diatoms from reservoir sediments

2.2.1 用盐酸去除碳酸盐
称取样品适量（具体质量根据镜检中硅藻丰度决
定，本文称取经冷冻干燥后的样品 0.5 g），一般采用
湿样或经冷冻干燥的样品，样品直接烘干可能会造成
硅藻破损。
将称取的沉积物样品移入离心管中，置于在通风
橱内，缓慢加入过量的 10% HCl，摇匀并置于 60℃
水浴中直至不再冒气泡。
2.2.2 去除有机质
有机质可以通过加入过氧化氢、强酸或焚烧等方
法去除[1]。鉴于强酸的高腐蚀性及焚烧对硅藻壳体的
破坏，本文中采用过氧化氢（H2O2）消解：在经盐
酸处理后的样品滴加少量的 30% H2O2，置于 80-90
℃水浴中，注意观察反应，防止溢出，待反应平静后，
反复多次加入适量的 H2O2，直至所有的有机质被去
除，样品不再产生气泡。如果反应过于剧烈，应转移
到更大的烧杯或容器中进行。
如仍有相对较大的有机或其它颗粒，可过 200
µm的水筛加以去除。然后用纯水离心（1 500 rpm，
5 min），清洗反应后的残余样品至少 3次，直至洗液
呈中性。
2.2.3 分散、悬浮小颗粒
加入 1%的六偏磷酸钠(NaPO4)6 溶液，摇匀后静
置反应 3-5 h，超声震荡 1 min，离心，去除上层悬浮
液（乳白色，无硅藻颗粒），重复加纯水离心（1 500
rpm，5 min），清洗 3次以上，可去除部分粘土及分
散大颗粒。
2.2.4 去除细小矿物
如果样品中细小杂质过多，会加大硅藻鉴定的难
度，而过筛往往会导致一部分小个体硅藻的流失，故
重液浮选是一个很好的提纯硅藻壳体的方法[6]。多钨
酸钠具有无毒无味、稳定性好、易配置、易回收等传
统重液无法比拟的优点[13,14]，故本实验使用比重为
2.3 g/cm³的多钨酸钠重液。
以上处理过的样品经离心后，尽量吸去上清液
（水分太多会稀释重液，影响浮选效果），加入两倍
于样品体积的多钨酸钠重液，充分摇匀，离心（2 000
rpm，10 min），出现分层后，用移液枪吸取上层液体
（含硅藻）置于另一 15 mL离心管中。重复加入 1 mL
多钨酸钠重液于含沉淀物的离心管中，充分摇匀，离
心（2 000 rpm，10 min），再次吸取上清液置于 15 mL
离心管中。
加 1-2滴冰乙酸于上述 15 mL离心管中，加纯水
至满，充分摇匀，离心（2 000 rpm，10 min），去除
上清液，再次加纯水进离心管至满，离心（1 500 rpm，
5 min），重复清洗重液 5次以上。
2.2.5 制片
根据研究要求，可加入适量玻璃微球（直径 10
µm）为参照物，充分摇匀。用移液枪取 500 µL混合
液置于 2 cm×2 cm 的盖玻片上，自然风干或置于
称样
10%盐酸，60℃水浴
分批次加入 30%双氧水
过 200 µm筛
1%六偏磷酸钠、超声处理
1-2滴冰醋酸
多钨酸钠重液浮选
玻璃微球
制片
生 态 科 学 Ecological Science 32卷

766
30-40℃电热板上烘干后将其盖于滴有 UV 胶的洁净
载玻片上，紫外灯照射 10-15 min即成。

2.3 优化实验
实验一：盐酸与双氧水添加的先后顺序
国内外公开发表的硅藻处理方法对盐酸与双氧
水添加的顺序鲜有提及[2,3,4,5,6]，如有涉及，通常是先
加双氧水去除有机质。为探究盐酸与双氧水对实验效
果的影响，本文设计如下实验：
称取等量沉积物样品，分两组实验，每组三个平
行样。对照组：先分批多次加入 30%双氧水，水浴加
热至不再有灰黑色沉淀，完全去除有机质，再加入过
量 10%盐酸至反应平静；实验组：先加入过量 10%
盐酸至反应平静，再分批多次加入 30%双氧水。分别
观察各组实验反应的剧烈程度，记录反应耗费的总时
间。
实验二：离心速度和时间的选择
条件允许，尽量选择静置的方法清洗沉淀。在硅
藻提纯步骤中，由于一次性处理的样品数目过多，清
洗沉淀的次数至少十次，因此一般采用离心清洗的方
法以节约时间。离心的速度与时间选择是多样的，速
度过大、时间过长会损伤硅藻壳体，而速度过小又达
不到完全沉淀硅藻的效果。取已消解的样品，设计不
同的离心速度与时间，用移液管吸取各上清液，观察
10个视域中出现的硅藻数目。
实验三：分散剂在沉积硅藻提纯中的作用
为观察分散剂在该实验中的作用，设计如下实
验：对照组，不添加任何分散剂；实验组，加入 1%
六偏磷酸钠并超声处理，观察溶液的状态，并镜检预
制玻片中硅藻壳体的分离情况。

3 结果与分析(Results and analysis)

3.1 盐酸与双氧水添加次序的优化
由表 2明显看出，先加入盐酸的实验组双氧水的
用量大大减少，实验反应所需的时间也明显缩短。资
料显示，盐酸能使双氧水的氧化性变强，也有可能使
沉积物团聚[6]，本实验处理后证实并没有团聚现象发
生，且无显著的壳体破碎现象。

3.2 离心速度和时间的选择的优化
通过设置不同的转速和离心时间（表 3），观察
离心后上清液中硅藻的数目，在转速大于 1 500 rpm
时，上清液中的硅藻数目极少，又因离心速度越大时
间越久对硅藻壳体损伤越大，故本文后续实验离心均
采用 1 500 rpm，5 min的参数。

表 2 盐酸与双氧水加入顺序对实验的影响
Table 2 Influence of successively adding HCl acid or H2O2
项目
Item
剧烈程度
Reaction degree
各分样双氧水用量
Dosage
耗费时间
Time
对照组 气泡多，较剧烈 220 mL 84 hrs
实验组 气泡更多，特别剧烈 130 mL 55 hrs

表 3 不同转速和时间离心后上清液中残留的硅藻数
Table 3 Number of supernatant diatoms under different centrifugal speeds and times
离心时间
Time(min)
1 000 rpm 1 200 rpm 1 500 rpm 2 500 rpm 4 000 rpm
1 122 90 82 ＼ ＼
3 45 11 11 ＼ ＼
5 13 7 4 5 4
10 11 8 2 ＼ ＼
15 18 ＼ ＼ ＼ ＼


6期 刘娟，等. 沉积物硅藻提纯方法的优化

767

3.3 添加分散剂的效果
通过两组实验对比，添加过分散剂的实验组有大
量的悬浮颗粒存在，通过离心能去除多数细小的碎
屑。预制玻片观察结果显示（图 2），未添加分散剂
的对照组中的硅藻往往粘聚在一起，很多壳体上还会
粘连碎屑，而实验组能有效地将硅藻壳体与碎屑分
离，有利于硅藻种属的镜下鉴定。

4讨论与结论 (Discussion and conclusion )

1）对硅藻进行同位素分析的提纯方法中，通常
要求提纯后硅藻的纯度达到 98%以上[15]，而基于硅
藻壳体种属鉴定的提纯方法要求没那么苛刻，但必须
尽可能保证个体完整、大小齐全。本实验中的水库沉
积硅藻壳体大小一般为 3-200 μm，如样品 1 中某些
布纹藻可达 225 μm × 9.8 μm，而某些曲壳藻只有 7.7
μm × 2 μm。经本文优化的硅藻提纯方法处理，沉积
物中的各种硅藻得到了最大限度的有效富集，避免了
过筛过程中某些硅藻属种的损失，使处理后的硅藻组
合尽可能真实地反映沉积硅藻组合（图 3）。

图 2 分散剂对流溪河水库沉积物硅藻在薄片中分布的影响。未经分散处理（左），经分散处理（右）藻（10×40倍）
Fig. 2 Light microscope images of diatoms in sample 1 (left: without dispersing agent; right: with dispersing agent)

图 3茜坑水库沉积硅藻组合在提纯前后的对比（10×40倍）
Fig. 3 Light microscope image of diatom assemblages in smear slide and concentrated slide for sample 5 from Xikeng Reservoir

生 态 科 学 Ecological Science 32卷

768

图 4显示，样品 1和 3硅藻在沉积物涂片中的初
始含量低于 1%，富集提纯后硅藻含量明显增加，达
到了沉积物硅藻组合分析的计数要求。对于初始硅藻
含量较高的样品（2、4 和 5），经富集后硅藻含量可
达 86%以上，样品 4甚至达到了 98%。
50%
60%
70%
80%
90%
100%
硅
藻
所
占
总
颗
粒
的
比
例
提纯前 提纯后

图 4 提纯前后 5个样品中硅藻含量的变化
Fig. 4 Proportion of diatom before and after concentration in
all 5 samples

2）由于水库的流域-水面面积之比远大于湖泊，
受到强烈陆源碎屑的稀释作用，单位重量的水库沉积
物中的硅藻含量一般低于同一区域内的湖泊。由图 4
可知，沉积物中硅藻初始含量越高，富集和提纯的效
果越好，故本文的方法也可以应用于湖泊沉积物硅藻
的富集和提纯。
3）作为水库沉积物硅藻富集和提纯的基本实验
流程，可根据沉积物组成的不同对本方法在以下方面
进一步改进，增删或适当地改良、调整某些实验步骤。
例如，对于砂级颗粒较少的沉积物可以考虑省略过筛
步骤；浓酸去除有机物效果好、速度较快，可尝试用
浓酸处理有机物含量高的沉积物；如果经过去除粗颗
粒和有机物后，硅藻数目达到了镜下鉴定的需求，可
略去重液浮选步骤，因为任何实验步骤都有可能造成
部分硅藻的损失。

参考文献(reference)

[1] Dixit S S, Smol J P, Kingston J C, Charles, D F. Diatoms:
powerful indicators of environmental change[J].
Environmental science & technology, 1992, 26(1): 22-33.
[2] Morley, D. W., Leng, Mackay M J, Sloane A W, Rioual H
J P, Battarbee R W. Cleaning of lake sediment samples for
diatom oxygen isotope analysis[J]. Journal of
Paleolimnology, 2004, 31(3): 391-401.
[3] 李键, 陈敬安. 湖泊沉积物硅藻提纯方法[J]. 地球与环
境, 2007, 35(1): 91-96.
[4] Battarbee R W, Jones V J, Flower R J, Cameron N G,
Bennion H, Carvalho L and Juggins S. Diatoms. In: Smol
J.P., Birks H.J.B. and Last W.M., Tracking Environmental
Change Using Lake Sediments. Volume 3: Terrestrial, Algal,
and Siliceous Indicators[M]. Netherlands: Kluwer
Academic Publishers, 2001. 155-202.
[5] Snelling A M, Swann G E A, Leng M J, et al. A
micro-manipulation technique for the purification of
diatoms for isotope and geochemical analysis[J]. Silicon,
2013, 5(1): 13-17.
[6] 李东, 汉景泰, 孙会国, 董明, 富永红. 硅藻提纯方法新
进展 : 小个体硅藻纯化的实验技术 [J]. 第四纪研究 ,
2010, 30(3): 623-624.
[7] 林国恩, 望田, 林秋奇. 广东流溪河水库湖沼学变量的
时空动态特征[J]. 湖泊科学, 2009, 21(3): 387-394.
[8] 肖绮虹. 流溪河水库监测和水质安全评价[D]. 广州: 华
南理工大学, 2011.
[9] 冯圣柱. 广东省江门市大沙河水库水质现状及富营养化
评价分析[J]. 科技风, 2012, (11): 224-224.
[10] 张文涛. 大沙河水库富营养化限制性因子分析[J]. 广东
水利水电, 2009, 9: 26-28.
[11] 李良庚, 陈明涛, 刘铁荣, 罗复忠. 茜坑水库生态建设分
析[J]. 人民珠江, 2009, (006): 58-60.
[12] 宗栋良, 吴丽萍. 深圳茜坑水库水质现状分析[J]. 人民
珠江, 2007, 6: 101-103.
[13] Munsterman D, Kerstholt S. Sodium polytungstate, a new
non-toxic alternative to bromoform in heavy liquid
separation[J]. Review of Palaeobotany and Palynology,
1996, 91(1): 417-422.
[14] 段体玉, 王时麒, Faiia A M. 多钨酸钠超声高速离心法-
分离提纯微细矿物的新方法[J]. 地质与勘探, 2001, 37(5):
38-40.
[15] Rings A, Lücke A, Schleser G H. A new method for the
quantitative separation of diatom frustules from lake
sediments[J]. Limnol. Oceanogr.: Methods, 2004, 2: 25-34.