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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(4):217-221
魏斯氏菌（Weissella）属于乳酸菌（Lactic acid
bacteria），近年来，魏斯氏菌在微生物学、医药学
及发酵、工业、食品加工等方面的应用开始受到研
究者的关注。魏斯氏菌作为益生菌的一员，对胃肠
道健康有一定的促进作用［1］。魏斯氏菌具有 β-葡糖
苷酶活性［2］，较好的抗真菌性［3］，能促进乳杆菌
（Lactobacillus）的生长［4］。魏斯氏菌产生的乳酸和
各种胞外多糖，对食品的风味感官有一定的影响［5］。
同时，相关魏斯氏菌新种的发现，证实其在食品的
防腐方面也有着较大的应用潜能［6］。魏斯氏菌益生
性质的广泛应用有待于其分子与基因水平更深层次
的研究。
寻找新的质粒，构建转化率高的表达载体是促
进魏斯氏菌基因工程发展的方法之一，也是魏斯氏
菌走向实践应用的有效途径。2007 年 Park 等［7］首
次从韩国泡菜分离的食窦魏斯氏菌（W. cibaria）中
鉴定出 3 个质粒，pKLCA、pKLCB 和 pKLCC。国内
学者在对发酵辣白菜的研究中，从食窦魏斯氏菌中
收稿日期 ： 2015-08-13
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31170007），四川省教育厅科技基金重点项目（14ZA0219），成都医学院病原生物学学科建设项目
（CYXK2012005）
作者简介 ：王海娟，女，研究方向 ：病原生物与感染性疾病研究 ；E-mail ：934147264@qq.com
通讯作者 ：潘渠，男，博士，副教授，硕士生导师，研究方向 ：病原生物与感染性疾病研究，E-mail ：ppqlove@126.com ；王英，
E-mail ：renshicu123456@163.com
一个融合魏斯氏菌隐蔽质粒的序列分析
王海娟1 戴雨珂2 苏森森1 王英3 潘渠1
（1. 成都医学院病原生物学教研室，成都 610500 ；2. 成都医学院公共卫生系，成都 610500 ；3. 成都军区总医院肾内科，成都 610500）
摘 要 ： 从融合魏斯氏菌（Weissella confusa QJ012）中发现一个隐蔽质粒（pQJ012），测序结果显示该质粒大小为 1 489 bp，
碱基 G+C 含量为 42.8%。BLAST 结果显示该质粒的核苷酸序列同 pJY33 和 pKLCA 的同源性分别为 93%、92%。ORF1 编码一个
282 个氨基酸残基的复制蛋白（Rep），其氨基酸序列与质粒 pJY33 和 pKLCA 的同源性分别为 91%、85%。根据复制蛋白、dso 和
sso 的序列特征，推定 pQJ012 的复制方式为滚环复制，是滚环复制 pT181 家族成员。质粒 pQJ012 可能构建为良好的表达载体。
关键词 ： 融合魏斯氏菌 ；隐蔽质粒 ；序列分析 ；复制蛋白
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.001
Complete DNA Sequence Analysis of a Cryptic Plasmid Isolated from
Weissella confusa
WANG Hai-juan1 DAI Yu-ke2 SU Sen-sen1 WANG Ying3 PAN Qu1
（1. Department of Pathogenic Biology，Chengdu Medical College，Chengdu 610500 ；2. School of Public Health，Chengdu Medical College，
Chengdu 610500 ；3. Department of Kidney Disease，General Hospital of Chengdu Military Region，Chengdu 610500）
Abstract: A cryptic plasmid isolated from Weissella confusa QJ012，designated as pQJ012，was sequenced and characterized，and it
was a 1489 bp circular molecule with a 42.8% G+C content. The result of BLAST showed that nucleotide sequence of pQJ012 was in homology
with pJY33（93%）and pKLCA（92%）. ORF1 encoded a 282 amino acid residue Rep protein that was 91% identical to pJY33 and 85%
identical to pKLCA in homology. Sequence analysis indicated that plasmid pQJ012 belonged to pT181 family of rolling-circle replication（RCR）.
The pQJ012 may be constructed as a promising expression vector.
Key words: Weissella confuse ；cryptic plasmid ；sequence analysis ；replication protein
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.4218
分离出 2 个质粒，其大小分别为 3 000 bp 和 8 000
bp［8］。Kim 等［9］从韩国泡菜分离得到的食窦魏斯氏
菌（W. cibaria KLC140）中发现 6 种不同的质粒，其
中最小的质粒长度为 2 126 bp，命名为 pKW2124，
该质粒的复制方式为 θ 复制。将 pKW2124 与 slpA
和 gfp 的融合基因连接，导入载体 pUC19，形成一
个 8.6 kb 的表面展示载体 pKWCSLGFP。随后，相
关学者把 pKW2124 的复制起始点（ori）、核糖体结
合位点（RBS）、复制蛋白（rep）基因插入克隆载体
pUC19，形成载体 pKUCm1。实验发现，pKUCm1 宿
主范围广泛，包括魏斯氏菌属（Weissella），乳球菌
属（Lactococcus），明串珠菌属（Leuconostoc），乳杆
菌属（Lactobacillus），同时，含有启动子的 β-半乳
糖苷酶基因被成功插入载体 pKUCm1，形成可应用
于蓝白斑筛选的质粒 pKUGal［7］。目前，已发现的魏
斯氏菌质粒还非常有限，而以上已被发现质粒中除
pKW2124 的复制方式被证实为 θ 复制外，其余质粒
复制方式都不明确。新质粒的发现对魏斯氏菌分子
生物学及遗传学的研究具有重要意义。
本研究从融合魏斯氏菌 QJ012 菌株中分离出一
个隐蔽性质粒，并对该质粒进行测序和分析，旨在
构建为良好的表达载体。
1 材料与方法
1.1 材料
质粒 pUC57 为广州艾基有限生物公司提供，T
载体试剂盒、革兰阳性菌基因组提取试剂盒和 PCR
（Ex Taq）购自大连宝生物公司（TaKaRa）。质粒提
取试剂盒购自北京索来宝科技有限公司，胶回收试
剂盒购自 Omega 公司（Bio-Tek USA），限制性内切
酶 购 自 Thermo 公 司。 培 养 条 件 ：MRS 培 养 基［10］
37℃静置培养 18-48 h。
1.2 方法
1.2.1 魏斯氏菌的分离鉴定 菌株 QJ012 样本来自
湖南泡菜。将泡菜样品在 MRS 培养基上划线培养，
挑取生长的单菌落进行革兰染色观察。魏斯氏菌应
该为紫红色的短杆状细菌。培养筛选出的革兰阳性
菌，用革兰阳性菌基因组提取试剂盒提取基因组。
根据细菌 16S rDNA 基因的高度保守，利用细菌 16S
rDNA 通 用 引 物 对（ 正 义 ：5-AGAGTTTGATCCTG-
GCTCAG-3 ；反义 ：5-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA
-3），扩增 QJ012 菌株的 16S rDNA 基因。PCR 扩增
片段通过胶回收纯化，然后进行 A-T 克隆，最后送
到成都擎科梓熙生物技术有限公司测序。
1.2.2 生化鉴定 过氧化氢酶试验采用传统方法进
行。葡萄糖、L-阿拉伯糖、纤维二糖、半乳糖、麦
芽糖的发酵产酸试验使用细菌微量生化管进行，培
养方式为 37℃静置培养［11］。
1.2.3 质粒提取与测序 离心收集融合魏斯氏菌
QJ012 菌体，用质粒提取试剂盒提取质粒 pQJ012，
胶回收试剂盒分离纯化质粒条带。将分离纯化得到
的质粒委托广州艾基生物有限公司进行测序，方法
为物理破碎后导入载体 pUC57，然后测序。
1.2.4 酶切鉴定 测序后通过分析 pQJ012 具有的酶
切位点，使用 Hind Ⅲ和 Nhe I 对质粒提取液进行双
酶切，通过分析酶切前后条带大小，鉴定其能否被
相应限制性内切酶切开。
1.2.5 质粒相似性鉴定及序列注释 利用序列比对
工具 BLAST，在 GenBank 数据库中比对融合魏斯氏
菌质粒 pQJ012 的测序结果，检索该质粒与已知魏斯
氏菌质粒的同源性。利用 NCBI 网站上的 ORF Finder
（Open reading frame finder）寻找该质粒可能存在的
开放阅读框（ORF）。利用 DNAMAN（V6）软件标
注该质粒的重要酶切位点。
1.2.6 复制方式推定 通过分析质粒 pQJ012 的 Rep
以及 dso 和 sso 保守序列，推导 pQJ012 复制方式所
属家族及其可能的复制方式。
2 结果
2.1 魏斯氏菌的分离鉴定
从样本中分离出一株魏斯氏菌，在 MRS 平板
培养基上，魏斯氏菌形成透明的小菌落，呈微隆起
圆状轮廓 ；革兰氏染色后镜检发现该菌呈革兰氏阳
性，短杆状，将其命名为 QJ012。QJ012 菌株的 16S
rDNA 基因扩增片段长 1 631 bp，序列比对结果表
明，融合魏斯氏菌（W.confusa Inje LM S-338）的 16S
rDNA 序列（GenBank ：DQ321751.1）是与扩增片段
最相似的序列，相似性为 99.9%，1 569 bp 中有 2 个
碱基不同 ；其次是魏斯氏菌（Weissella sp. MMZ50B，
GenBank ：EU157913.1），相似性为 99.7%，1 546 bp
2016,32(4) 219王海娟等：一个融合魏斯氏菌隐蔽质粒的序列分析
中有 5 个碱基不同。QJ012 菌株的 16S rDNA 基因同
与其最相似的融合魏斯氏菌的 16S rDNA 基因差异仅
为 0.01 %，可判断 QJ012 菌株为融合魏斯氏菌。
2.2 生化试验验证
融合魏斯氏菌 QJ012 的生化试验结果为不产生
过氧化氢酶，不能利用 L-阿拉伯糖，发酵葡萄糖、
纤维二糖、半乳糖和麦芽糖均产酸，符合魏斯氏菌
属和融合魏斯氏菌种的生化特征。生化试验结果符
合分子鉴定的结论。
2.3 质粒提取与序列测定
融合魏斯氏菌 QJ012 质粒提取液电泳结果（图
1）显示该提取液有 2 个条带，分别为 1.5 kb 和 14.5
kb，提示 QJ012 可能携带两个质粒。将较小的条带
代表的质粒命名为 pQJ012，分离纯化该质粒，委托
广州艾基生物有限公司进行测序。测序后发现该质
粒大小为 1 489 bp，测序结果提交 GenBank，登录号
为 ：KR973434。
2.4 酶切鉴定
通过 DNAMAN 软件对 pQJ012 序列的酶切位点
分析显示其能被 Hind Ⅲ和 Nhe I 切开。两个酶切位
点相距 347 个碱基，双酶切后，质粒将被切为 347
bp 和 1 142 bp 两个线性片段。融合魏斯氏菌质粒提
取液经双酶切后电泳结果（图 1）显示有 0.3 kb、1.1
kb、1.2 kb、2 kb 和 13 kb 共 5 条条带，其中 0.3 kb
与 1.1 kb 条带应为 pQJ012 被切开后产生的条带，1.2
kb、2 kb 和 13 kb 条带应为 14.5 kb 条带所代表质粒
被切开后产生的条带。
2.5 质粒相似性鉴定及序列注释
质 粒 pQJ012 的 G+C 含 量 为 42.8%，BLAST 比
对结果显示，该质粒的核苷酸序列与食窦魏斯氏
菌 中 已 被 发 现 的 质 粒 pJY33（2 365 bp）、pKLCA
（1 490 bp）最为相似，与 pJY33（GenBank number ：
KF879106.1）的相似性为 93%，1 454 bp 中相似序
列 长 度 为 1 354 bp ；与 pKLCA（GenBank number ：
AY188776.1） 的 相 似 性 为 92%，1 498 bp 中 相
似 序 列 长 度 为 1 364 bp。 目 前，pJY33 与 pKLCA
在 PubMed 尚 无 文 献 可 供 查 阅。 通 过 ORF 搜 索，
pQJ012 有 5 个 ORF，ORF1 编 码 一 个 282 个 氨 基
酸残基的蛋白，从 593 bp 到 1 441 bp，应为该质粒
的复制蛋白（Rep）（图 2）；其余 ORF 在 GenBank
没有与之相匹配的蛋白。该 Rep 的氨基酸序列与
pJY33 和 pKLCA 的 Rep 氨基酸序列同源性分别为
91% 和 85%。 该质粒没有编码影响菌株表型的蛋白，
应归为隐蔽质粒。
kb
15
10
2.5
1
0.25
kb
13
2
1.2
1.1
0.3
M 1 2
M ：DNA Marker ；1 ：融合魏斯氏菌 QJ012 质粒提取液 ；2 ：双酶切体系（Hind
Ⅲ和 Nhe I）
图 1 融合魏斯氏菌质粒 pQJ012 酶切鉴定电泳图
Cla I 1420
EcoR I 183
EcoR I 347
Dra I 404
Nhe I 843 Aat II 1125
Hind III 1190 dso ssoA1
pQJ012
1489 bp
rep
图 2 质粒 pQJ012 的物理图谱
2.6 复制方式推定
滚环复制的质粒必须携带 dso 和 sso 位点，并
编 码 相 关 复 制 蛋 白， 根 据 dso 和 复 制 蛋 白 的 不
同，滚环复制的质粒至少被分为 7 大家族 ：pT181、
pC194/pUB110、pE194/pLS1、pSN2、pGA1、pG13
和 pTX14［12］。pT181 家族的复制蛋白的保守结构域
是 pfam02486，dso 位点有三项特征 ：复制蛋白切开
位点 nic 区的保守序列为 TAATAG［13］；围绕 nic 区
有 3 个反向重复序列［14］；dso 位点位于复制蛋白编
码区的 N 端。pT181 家族的 sso 位点为 ssoA，其保守
序列是 TAGCGA/T［13］。经过序列分析，pQJ012 的复
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.4220
制蛋白具有保守结构域 pfam02486 ；其 dso 位点具有
pT181 家族的三项特征（图 3-A，图 4）。pQJ012 的
sso 位点吻合 ssoA 的特征（图 3-B）。综上，我们推
定 pQJ012 的复制方式为滚环复制，属于 pT181 家族。
TAGCGATGCAGTAATA
GTATCTTACCGATGCAGCAATA
pQJ012..................................................TTTTGTACCT
pJY33....................................................TTTT
pKLCA .................................................TTTTGTATCTTAGCGATGCAGTAATA
pC221...................................................ATAATTTGGCTAGCGATTTGTCTGTT
pS194....................................................ATAATTTGGCTAGCGATTTGTCTGTT
pT181....................................................GCTAACTTGTTAGCGAGTTGGTTGGA
conserved sequence of ssoAB
nick site
pQJ012
pJY33
pKLCA
pC221
pS194
pT181
A
阴影部分显示保守序列用
图 3 质粒 pQJ012 dso（A）和 pQJ012 ssoA（B）序列比对图
bind
IR-III
nick
IR-I
I
IR-I
rep
黑盒子表示为 rep，水平箭头表示反向重复序列，垂直箭头表示
nick 和 bind 位点
图 4 质粒 pQJ012 复制起始点示意图
3 讨论
魏斯氏菌属于益生菌，能产生 β-葡糖苷酶、胞
外多糖，具有食品防腐性能等优势，在医药与食品
加工方面具有极大的开发潜力和商业价值。魏斯氏
菌质粒的研究是在分子基因水平改造魏斯氏菌的基
础，新质粒的发现，对于微生物的遗传学研究和
构建具有自主知识产权的表达载体都具有重要意
义。目前，魏斯氏菌质粒的研究还非常有限，魏斯
氏菌中已被发现并对其序列进行了分析研究的质粒
有 pKLCA、pKLCB、pKLCC［7］ 和 pKW2124［9］。 以
上被发现的质粒中，只有 pKW2124 的复制方式已被
验证为 θ 复制，同时 pKW2124 已被成功构建为表达
载体［9］，而且以上已被分析的魏斯氏菌中的质粒均
分离自食窦魏斯氏菌。本研究中 pQJ012 为融合魏
斯氏菌中首次被分离报道的质粒，pQJ012 同食窦魏
斯氏菌中已发现的质粒 pJY33（2 365 bp）和 pKLCA
（1 490 bp）最相似。这两个质粒在 GenBank 中有供
查询的序列，但在 PubMed 尚无文献可供直接查阅。
分 析 pQJ012、pJY33 和 pKLCA 的 基 本 元 件，
即复制起点和复制蛋白，发现他们都属于滚环复制
pT181 家族。pQJ012、pJY33 与 pKLCA 的质粒复制
双链启动位点 dso 都符合滚环复制 pT181 家族的特
征，nic 区都含有保守序列 TAATAG，围绕 nic 区都
有 3 个反向重复序列。只是 3 个质粒的反向重复序
列的碱基序列虽然相同，但间距有所不同。3 个质
粒的质粒复制单链启动位点 sso 都是 ssoA。3 个质粒
的推定复制蛋白（Rep）的氨基酸序列同源性很高，
都有滚环复制蛋白保守结构域 pfam02486。
4 结论
本研究首次从融合魏斯氏菌中发现一个隐蔽
质 粒 pQJ012， 其 核 苷 酸 序 列 同 食 窦 魏 斯 氏 菌 中
的 pJY33 和 pKLCA 的 同 源 性 分 别 为 93% 和 92%。
ORF1 编码复制蛋白（Rep），该复制蛋白氨基酸序
列与质粒 pJY33 和 pKLCA 的同源性分别为 91% 和
2016,32(4) 221王海娟等：一个融合魏斯氏菌隐蔽质粒的序列分析
85%。推断 pQJ012 的复制方式为滚环复制，属于滚
环复制 pT181 家族成员，质粒 pQJ012 可能构建为良
好的表达载体。
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（责任编辑 李楠）