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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(4):175-183
铁、锰是地壳的主要构成成分，广泛分布于自
然界中。地下水在径流地下的过程中，由于化学作用、
物理作用及生物作用溶解了不同浓度的铁、锰离子
以及其他物质，地下水的优良品质受到了破坏［1］。
我国北方地区地下水铁、锰超标相对于南方较严重，
铁、锰超标的地区主要分布在松花江流域［2］。地下
水中铁、锰含量过高会带来诸多危害，主要包括以
下几个方面 ：易使衣物染色，水有铁腥异味，Fe2O3
等铁质沉淀物会滋长铁细菌，阻塞管道，严重时会
出现红水现象 ；作为造纸、纺织、印染、化工、食
品等生产用水会降低产品质量，腐蚀生产设备及用
具 ；长期饮用含铁、锰量过高的水还会严重影响身
体健康，造成胰腺、肝脏、神经系统、呼吸系统疾
病，甚至导致人体慢性中毒［3-6］。因此，含有过量铁、
收稿日期 ：2015-09-29
基金项目 ：“十二五”国家科技支撑计划项目（2013BAJ12B01），东北农业大学大学生 SIPT 计划创新训练项目（201510224257）
作者简介 ：樊星，男，研究方向 ：环境微生物 ；E-mail ：good150030@sina.com
通讯作者 ：李春艳，女，博士，研究方向 ：环境微生物 ；E-mail ：chunyanli@neau.edu.cn
一株高效铁锰氧化细菌 P1 的分离鉴定及氧化条件优化
樊星  王淑婷  李春艳
（东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨 150030）
摘 要 ： 利用富集培养技术从富含铁锰的地下水井淤泥中分离得到 1 株能够氧化铁锰的细菌，命名为 P1。经形态特征、生
理生化特征和 16S rDNA 序列分析，将菌株 P1 鉴定为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）。利用单因素实验探讨菌株 P1 的生长及氧化特性；
采用响应面分析方法考察接种量、温度、pH 值 3 个因素对菌株 P1 氧化特性的影响，进一步优化菌株的氧化条件。结果表明，菌
株 P1 的最佳氧化条件 ：温度 28.54℃，pH7.23，接种量 4.35%。在此条件下，菌株 P1 在锰含量为 200 mg/L、铁含量为 800 mg/L 的
选择性培养液中培养 3 d 后，锰氧化率达 93% 以上，铁氧化率达 100%。
关键词 ： 铁锰氧化 ；Bacillus cereus ；分离鉴定 ；氧化条件 ；响应面分析法
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.023
The Isolation and Identification of an Efficient Fe/Mn-oxidizing
Bacterial Strain P1，and the Optimization of Its Oxidizing Conditions
FAN Xing WANG Shu-ting LI Chun-yan
（College of Resource and Environment，Northeast Agricultural University，Harbin 150030）
Abstract: By enrichment culture，a Fe/Mn-oxidizing bacterial strain P1 was isolated from the sludge samples of groundwater well that
was rich in Fe/Mn. According to morphologic and physiological-biochemical characteristics as well as 16S rDNA sequence analysis，strain P1
was identified as Bacillus cereus. Concurrently，single factor test was used to study the growth of strain P1 and its oxidation characteristics ；
and the response surface methodology（RSM）was employed to explore the effects of inoculation size，temperature and pH on the oxidation
characteristics of strain P1 and further optimize the oxidation conditions. The results showed that the optimal oxidation conditions were
temperature 28.54℃，pH 7.23，and inoculation size 4.35 %. At the optimal conditions，the removal ratios of Mn and Fe were 93 % and 100 %
respectively in the selective medium containing 200 mg/L Fe and 800 mg/L Mn after strain P1 was cultured for 3 d.
Key words: Fe/Mn-oxidizing ；Bacillus cereus ；isolation and identification ；oxidation conditions ；response surface methodology
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.4176
锰的地下水，需要处理后才能满足工业生产和人民
生活的要求。
地下水除铁、锰技术经历了从自然氧化法、接
触氧化法向生物氧化法的过渡阶段。由于自然氧化
法和接触氧化法在实施过程中存在许多问题，如操
作流程复杂、处理成本高、运行难度大，出水水质
不稳定和易造成二次污染等弊端［7］，而生物氧化法
由于具有效果好，运行效果稳定，无有毒副产物之
患，投资少等优点［8］更为人们所接受。目前，国
内对于生物氧化法的研究主要集中在铁氧化菌、锰
氧化菌的筛选上，而对于铁锰氧化菌的筛选研究较
少，且筛选出的菌株对于锰离子的去除效果不理
想［9，10］。因此，有针对性地筛选具有高效铁锰氧化
能力的菌株，将其应用于地下水处理过程具有重要
意义。
本研究通过富集培养，采用特异性培养基从地
下水井淤泥中筛选出具有高效铁锰氧化能力的细菌，
结合形态学、生理生化特性和 16S rDNA 序列分析等
对其进行鉴定，利用单因素实验探讨菌株的生长及
氧化特性，采用响应面分析法对该菌株的氧化条件
进行优化。
1 材料与方法
1.1 材料
选用黑龙江省红旗农场富含高铁高锰污染物的
地下水井淤泥作为微生物富集培养来源。
LB 培养基 ：蛋白胨 10.0 g，酵母膏 5.0 g，NaCl
10.0 g，加去离子水至 1 L，pH 调至 7.0。
PYCM 改良培养基［11］：蛋白胨 0.5 g，葡萄糖
0.3 g，酵母浸膏 0.2 g，MnSO4·H2O 0.2 g，K2HPO4
0.1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaNO3 0.2 g，CaCl2 0.1 g，
（NH4）2CO3 0.1 g，柠檬酸铁铵 0.8 g，去离子水 1 000
mL，pH6.8-7.2，灭菌 20 min。固体培养基添加 2%
琼脂，湿热灭菌后使用。
1.2 方法
1.2.1 高效铁锰氧化菌的富集与分离 无菌水稀释
泥样，搅拌 10 min，取 0.2 mL 稀释液加入到 100 mL
的 LB 培养基中，28℃、150 r/min 条件下培养 24 h ；
取上述培养液 5 mL 加入到 100 mL 的铁离子浓度为
80 mg/L，锰离子浓度为 20 mg/L 的 PYCM 改良培养
基中，于 28℃、150 r/min 的恒温摇床中振荡培养 ；
然后每隔 1 周以 10%（体积分数）的接种量接入到
新鲜的 PYCM 改良培养液中，并逐渐提高铁锰离子
浓度，至培养液中铁离子浓度达到 800 mg/L，锰离
子浓度达到 200 mg/L，如此驯化约 2 个月。
取 0.1 mL 混合样涂布于 PYCM 改良培养基固体
平板上，28℃培养至有明显单菌落。针对生长良好
的单菌落，于铁离子浓度为 800 mg/L，锰离子浓度
为 200 mg/L 的 PYCM 改良培养基固体平板上进一步
划线培养，分离纯化 3-4 次，获得纯化后的多株铁
锰氧化菌株。将菌株回接于 PYCM 改良培养液中，
验证是否对铁、锰离子有氧化能力［12］。通过测定培
养液中铁锰离子含量、比较所得功能菌株的氧化能
力，筛选出 1 株高效铁锰氧化菌，命名为 P1，并将
其接种于 PYCM 改良斜面培养基上，培养 48 h 后，
待长出明显菌落后，置于 4℃冰箱保存备用。
铁 / 锰氧化率的计算公式如下 ：
氧化率总铁 / 总锰 = ［d（Fe
2+ / Mn2+）初始 - d（Fe
2+ /
Mn2+）剩余］/d（Fe
2+ / Mn2+）初始 ×100%
氧 化 率 对 照 组 = ［d（Fe
2+/ Mn2+） 初 始 - d（Fe
2+/
Mn2+）对照剩余］/d（Fe
2+/ Mn2+）初始 ×100%
氧化率铁 / 锰 = 氧化率总铁 / 总锰 - 氧化率对照组
式中，氧化率总铁 / 总锰 ：培养基接种培养后 Fe
2+/ Mn2+
的总氧化率 ；氧化率对照组 ：未接种菌株培养基中 Fe
2+/
Mn2+ 氧 化 率 ；d（Fe2+/ Mn2+） 初 始 ：培 养 基 中 初 始
的 Fe2+/ Mn2+ 质量浓度（mg/L）；d（Fe2+/ Mn2+）剩余 ：
接 种 培 养 基 中 剩 余 Fe2+/ Mn2+ 质 量 浓 度（mg/L）；
d（Fe2+/ Mn2+）对 照 剩 余 ：对 照 组 培 养 基 中 剩 余 Fe
2+/
Mn2+ 质量浓度（mg/L）；氧化率铁 / 锰 ：培养基中菌株
生物氧化作用的 Fe2+/ Mn2+ 氧化率。
1.2.2 高效铁锰氧化菌的鉴定［13］
1.2.2.1 高效铁锰氧化菌的形态观察 将高效铁锰
氧化菌 P1 采用平板涂布法接种于 PYCM 改良固体培
养基上，28℃恒温培养 24 h 后观察菌落形态。用光
学显微镜和透射电子显微镜观察菌体形态，参照《常
见细菌系统鉴定手册》对其进行生理生化鉴定［14］。
1.2.2.2 高效铁锰氧化菌的 16S rDNA 序列测定 提
取细菌总 DNA［15］，采用细菌的 16S rDNA 通用引
物［12］，上游引物：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，
下 游 引 物 ：5-GGTTACCTTCTTACGACTT-3， 引 物
2016,32(4) 177樊星等：一株高效铁锰氧化细菌 P1 的分离鉴定及氧化条件优化
由大连宝生物有限公司合成。以提取的总 DNA 作为
模板，对该菌株的 16S rDNA 进行 PCR 扩增。反应
体 系 ：dNTPs 4 μL（2.5 mmol/L）、10×buffer 5 μL、
上游引物及下游引物各 2 μL（50 μmol/L）、Ex Taq 酶
0.5 μL、模板 DNA 2 μL，加去离子水至 50 μL。PCR
反应条件 ：94℃预变性 5 min ；94℃变性 50 s，60℃
退火 90 s，72℃延伸 2 min，35 个循环 ；72℃延伸
10 min［12］。PCR 产 物 在 质 量 分 数 为 1% 的 琼 脂 糖
凝胶中电泳，并于紫外光下观察，然后将纯化后
的 PCR 扩增产物送上海生工测序［16］。测序结果用
BLAST 软件在 GenBank 中进行同源性比较，采用
MEGA4.0 软件构建系统发育树［17］。
1.2.3 高效铁锰氧化菌株生长及氧化条件的优化
1.2.3.1 单 因 素 实 验 分 别 以 20℃、24℃、28℃、
32℃和 36℃作为温度实验组；以 5.5、6.0、6.5、7.0、
7.5 和 8.0 作 为 pH 实 验 组 ；以 1.0%、2.0%、3.0%、
4.0%、5.0%、6.0% 和 7.0% 作为菌体接种量实验组；
以 12、24、36、48、60、72 和 84 h 作 为 培 养 时 间
实验组。以上各实验组的 PYCM 改良培养液均为 50
mL，接种用菌悬液 OD600 值均调至 1.0，恒温摇床
振荡培养，以不加菌作为阴性对照，以蒸馏水作为
空白对照，在培养第 3 天测定铁锰氧化率及生长量
OD600，分别采用过硫酸铵分光光度法和二氮杂菲分
光光度法测定铁、锰浓度［18］。每个处理设 3 个平行
重复。
1.2.3.2 铁锰氧化菌响应面分析实验 根据单因素
实验结果，以温度（A）、pH（B）、接种量（C）为
自变量，以培养液中铁离子的氧化率（Y1）和锰离
子的氧化率（Y2）为响应值，利用 Design-Expert 8.0.6
软件中的 Box-Behnken design（BBD）模型，设计三
因素三水平的二次回归方程拟合自变量和铁锰氧化
率之间的函数关系，优化铁锰氧化的最佳环境条件。
其中实验设计因素水平见表 1。二次回归方程用以
拟合自变量和响应值之间的函数关系［19］，公式如下：
2
1 1 2
k k k
j j jj ij i jj
j j i j
Y A AX A X A XX
= = < =
= + + +∑ ∑ ∑∑
式中，Y ：预期响应值 ；A ：常数 ；Aj ：单因素直线
系数 ；Ajj ：单因素平方系数 ；Aij ：两个因素的交互
系数。
表 1 菌株 P1 的响应面实验因子及水平列表
因素编
码值
因素名称 低水平（-1） 中水平（0） 高水平（1）
A 温度 /℃ 24 28 32
B pH 6.5 7.0 7.5
C 接种量 /% 3 4 5
1.2.4 最佳培养及氧化条件验证实验 将菌株 P1 接
种于 PYCM 改良培养液中，在最佳条件下培养 3 d 后，
每 12 h 取样检测菌株的生长量 OD600，同时，测定
培养液中铁锰离子的剩余浓度，计算氧化率，设置
3 组平行验证实验。
2 结果
2.1 高效铁锰氧化菌的分离纯化
经分离与纯化获得 1 株高效铁锰氧化细菌，命
名为 P1。菌株 P1 菌落培养特征、革兰氏染色照片
和透射电镜照片如图 1 所示。菌株 P1 菌落和菌体形
态特征分别见表 2，生理生化指标见表 3。
Dircct Mag: 30000X Dircct Mag: 40000X
A
C
B
A ：菌落特征 ；B ：光学显微镜照片（1 000×）；C ：透射电镜照片
图 1 菌株 P1 菌落及菌体形态
2.2 基于16S rDNA基因序列的系统发育分析
菌株 P1 序列已在 GenBank 中注册，登录号为
KP241859。菌株 P1 与数据库中 8 个同源性较高的
细菌模式株进行比较，菌株 P1 的 16S rDNA 序列与
蜡状芽孢杆菌 Bacillus cereus 有较高的序列同源性，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.4178
相似性高达 99.0%。其系统发育关系见图 2。目前，
细菌分类学家的共识是当某两个细菌的 16S rDNA 的
相似性大于 95% 时，可将其归为同一属。从系统发
育树分析可知，菌株 P1 属于 Bacillus cereus。
70.7%（图 3-A）。菌株 P1 生长量及铁、锰氧化率
均随 pH 增加先增大后减小，当 pH7.0 时，菌株铁、
锰氧化率达最大值，分别为 79.7% 和 68.5%。当 pH
为 6.5-7.5 时，菌株 P1 生长及氧化能力最佳（图 3-B）。
接种量为 4% 时，菌株 P1 生长量和铁、锰氧化率均
达到最大值，分别为 1.801、81.7% 和 70.5%，可知
4% 为最佳接种量（图 3-C）。菌株 P1 生长量及铁、
锰氧化率随培养时间延长呈现出先升高后下降趋势，
当培养时间为 72 h，菌株 P1 铁锰氧化率达到最大值，
分别 84.9% 和 68.2%（图 3-D）。综上所述，影响菌
株 P1 生长量和铁、锰氧化能力的最适条件为温度
28℃、pH7.0、接种量 4%、培养时间 72 h。
2.4 响应面优化结果
菌株 P1 的响应面实验设计方案及结果如表 4 所
示，每个响应值实验总共 17 组，其中包括 5 组零点
实验，以估计实验误差。利用 Design-Expert 8.0.6 软
件，对 BBD 模型实验数据进行多项回归分析后，得
到二次拟合模型为 ：
Y1 = 89.60+4.62A1-4.99B1-1.66C1-2.87A1B1+
0.20A1C1-2.53B1C1-10.51A1
2-12.56B1
2-6.84C1
2
Y2 = 82.51+2.79A2-4.78B2-0.23C2-0.41A2B2-
3.84A2C2-3.62B2C2-7.56A2
2-8.58B2
2-4.18C2
式中，Y1 为菌株 P1 对铁的氧化率，Y2 为菌株 P1 对
锰的氧化率 ；A1、B1、C1 和 A2、B2、C2 分别为温度、
pH、接种量的编码值。表 5 是利用 Design-Expert 8.0.6
软件分析得出的菌株 P1 铁、锰氧化率响应分析实验
的回归分析结果。
由菌株 P1 的回归分析结果可知，菌株铁氧化率、
锰氧化率的失拟 P 值均> 0.05，而铁氧化率、锰氧
化率的模型 P 值均< 0.000 1，表明方程与实际情况
拟合良好。由模型预测拟合度 Pred R2 和模型拟合系
数 R2 可知，铁、锰氧化率的实验值与预测值之间具
有良好拟合度 ；其校正后的拟合系数 R1
2
Adj =0.996 4、
R2
2
Adj=0.986 8 表明方程模型具有很高的可信度。信
噪比大于 4 时表明模型合理，模型的信噪比 Adeq
Precisior1=38.930、Adeq Precisior2=32.568， 表 明 模
型合理［20］。由表 5 可知，在菌株 P1 的响应分析实
验中温度、pH 的 P 值均 <0.000 1，说明它们对菌株
P1 铁、锰氧化率具有极显著影响，同时，在以铁氧
表 2 菌株 P1 形态特征
菌落形态 特征 菌体形态 特征
形状 圆形、边缘不整齐 形状 杆状
颜色 白色 革兰氏染色 ＋
透明度 不透明 芽孢 ＋
表面状况 稍有光泽 大小 /μm （0.8-1.2）×
（2.0-4.0）
隆起度 略有隆起 鞭毛 ＋
注 ：“+”表示阳性反应 ；“-”表示阴性反应
表 3 菌株 P1 生理生化特征
生理生化特征 结果 生理生化特征 结果
葡萄糖产酸 + 柠檬酸盐利用实验 +
阿拉伯糖产酸 - 酪氨酸水解 +
木糖产酸 - 苯丙氨酸脱氨酶 -
甘露醇产酸 - 需要 KCl 和 NaCl -
葡萄糖产气 - 生长温度 5℃ -
明胶水解实验 + 30℃ +
淀粉水解实验 + 50℃ -
注 ：“+”表示阳性反应 ；“-”表示阴性反应
Pantoea agglomerans strainAY335552.1
Bacillus cereusDQ423486
Lactobacillus gasseriAY730721
Clostridium butyricumX77834
Neisseria bacilliformisDQ117531
Marinobacter alkaliphilusAB125941
Escherichia coliDQ360844
Citrobacter diversusAF025372
P1KP241859
0.05
图 2 菌株 P1 的系统发育树
2.3 单因素实验结果
不同因素对菌株 P1 生长量及铁、锰氧化能力
的影响情况，结果（图 3）显示，当温度为 28℃时，
菌株 P1 生长量和铁、锰氧化率均达到最高点，生
长量为 1.812，铁、锰氧化率最大值分别为 79.8% 和
2016,32(4) 179樊星等：一株高效铁锰氧化细菌 P1 的分离鉴定及氧化条件优化
2.0
1.5
1.0
0.5
0
O
D
.G
ro
w
th
/6
00
nm
Re
m
ov
al
ra
te
/%
20
A B
C D
24
Temperature/ć28 32 36
100
80
60
40
20
0
Removal rate of Mn/%
Removal rate of Fe/%
OD. Growth/600nm
2.0
1.5
1.0
0.5
0
O
D
.G
ro
w
th
/6
00
nm
Re
m
ov
al
ra
te
/%
5.5 6.0
pH
6.5 7.0 7.5 8.0
100
80
60
40
20
0
2.0
1.5
1.0
0.5
0
O
D
.G
ro
w
th
/6
00
nm
Re
m
ov
al
ra
te
/%
12 24
Incubation time/h
36 48 60 72 84
100
80
60
40
20
0
2.0
1.5
1.0
0.5
0
O
D
.G
ro
w
th
/6
00
nm
Re
m
ov
al
ra
te
/%
1 2
Inoculum size/%
3 4 5 6 7
100
80
60
40
20
0
Removal rate of Mn/%
Removal rate of Fe/%
OD. Growth/600nm
Removal rate of Mn/%
Removal rate of Fe/%
OD. Growth/600nm
Removal rate of Mn/%
Removal rate of Fe/%
OD. Growth/600nm
A ：温度 ；B ：pH ；C ：接种量 ；D ：培养时间
图 3 各因素对菌株 P1 生长量及氧化能力的影响
表 4 菌株 P1 响应面实验设计与结果
序号
因素
铁氧化率响应值（Y1）/%
因素
锰氧化率响应值（Y2）/%
A1 B1 C1 A2 B2 C2
1 1 0 -1 78.28 1 0 1 78.19
2 0 -1 -1 74.79 0 0 0 82.47
3 1 0 1 75.98 -1 -1 0 67.96
4 0 -1 1 75.93 0 1 -1 68.27
5 0 0 0 89.67 0 0 0 80.98
6 -1 0 1 65.82 0 0 0 82.78
7 0 0 0 88.98 0 -1 -1 70.92
8 0 0 0 90.61 0 0 0 82.39
9 0 0 0 87.97 0 1 1 61.33
10 0 1 1 60.56 -1 0 -1 64.58
11 0 0 0 90.79 0 0 0 83.94
12 -1 -1 0 64.14 -1 1 0 59.53
13 1 1 0 63.19 1 0 -1 78.19
14 -1 0 -1 68.92 1 1 0 63.95
15 0 1 -1 69.54 -1 0 1 71.02
16 -1 1 0 60.21 0 -1 1 78.46
17 1 -1 0 78.59 1 -1 0 74.02
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.4180
化率为响应值的响应分析实验中，接种量的 P 值为
0.002 2，表明温度和 pH 对菌株铁氧化率的影响较
接种量大，从温度（F=171.14）与 pH（F=200.06）
的 F 值可以看出 pH 对铁氧化率的影响较温度更为
显著。而在以锰氧化率为响应值的响应分析实验中，
接种量 P 值为 0.501 7，表明接种量对菌株锰氧化率
没有显著影响，从温度与 pH 的 F 值可知 F 温度< F pH，
pH 对锰氧化率的影响较温度更为显著。
由上述结果可知，各因素对菌株铁、锰氧化率
的影响作用由大到小依次为 ：pH> 温度 > 接种量。
表 5 菌株 P1 响应分析实验方差分析结果
偏差平方和 自由度 均方差 F 值 P 值
Fe Model 1921.39 9 213.49 214.08 < 0.0001 significant
A1 170.66 1 170.66 171.14 <0.0001
B1 199.50 1 199.50 200.06 <0.0001
C1 21.91 1 21.91 21.97 0.0022
A1B1 32.89 1 32.89 32.98 0.0007
A1C1 0.16 1 0.16 0.16 0.7007
B1C1 25.60 1 25.60 25.67 0.0015
A1
2 465.38 1 465.38 466.68 <0.0001
B1
2 664.04 1 664.04 665.89 <0.0001
C1
2 197.04 1 197.04 197.58 <0.0001
残差 6.98 7 1.00
失拟 1.50 3 0.50 0.36 0.7834 not significant
纯误差 5.48 4 1.37
总和 1928.37 16
Adeq Precisior1 38.930
Pred R1
2 0.9831
R1
2 0.9973
R1
2
Adj 0.9964
Mn Model 1048.79 9 116.53 133.75 < 0.0001 significant
A2 62.44 1 62.44 71.66 < 0.0001
B2 183.17 1 183.17 210.23 <0.0001
C2 0.44 1 0.44 0.50 0.5017
A2B2 0.67 1 0.67 0.77 0.4088
A2C2 58.91 1 58.91 67.61 <0.0001
B2C2 52.42 1 52.42 60.16 0.0001
A2
2 240.79 1 240.79 276.36 <0.0001
B2
2 310.31 1 310.31 356.14 <0.0001
C2
2 73.65 1 73.65 84.53 <0.0001
残差 19.38 7 0.87
失拟 1.62 3 0.54 0.48 0.7113 not significant
纯误差 4.47 4 1.12
总和 1054.89 16
Adeq Precisior2 32.568
Pred R2
2 0.9687
R2
2 0.9942
R2
2
Adj 0.9868
2016,32(4) 181樊星等：一株高效铁锰氧化细菌 P1 的分离鉴定及氧化条件优化
图 4 为不同交互组合对菌株 P1 铁锰氧化能力
影响的响应曲面图。结合图中等高线图和响应曲面
图能够很好地分析交互组合对响应值的影响情况。
如图所示，当各因素固定在零水平时，较高氧化率
集中在曲面的中心区域，且在此区域内均存在菌株
氧化率的极值点，经软件分析可以得到曲面的最高
点，即 3 个因子的最优实验点，所得菌株 P1 氧化铁
离子的最优实验条件为 ：温度 28.3℃，pH7.18，接
种量 4.27% ；氧化锰离子的最优实验条件为 ：温度
28.9℃，pH7.27，接种量 4.46 %。
经 Design-Expert 8.0.6 软件分析可得菌株 P1 的
铁锰氧化率最优条件为 ：接种量 4.35%，pH7.23，
32.00
30.00
28.00
26.00
24.006.50
6.70
6.90
pH
A
Temperature/ć7.107.307.505060
70
80
90
100
R
em
ov
al
ra
te
o
f F
e/
%
32.00
30.00
28.00
26.00
24.003.00
3.50
4.00
Inoculum size/%
B
Temperature/ć4.505.005060
70
80
90
100
R
em
ov
al
ra
te
o
f F
e/
%
32.00
30.00
28.00
26.00
24.006.50
6.70
7.10
6.90
pH
C
Temperature/ć7.307.505560
70
75
65
80
85
R
em
ov
al
ra
te
o
f M
n/
%
32.00
30.00
28.00
26.00
24.003.00
3.50
4.50
4.00
Inoculum size/%
D
Temperature/ć5.005560
70
75
65
80
85
R
em
ov
al
ra
te
o
f M
n/
%
A ：氧化铁离子温度 -pH ；B ：氧化铁离子温度 - 接种量 ；C ：氧化锰离子温度 -pH ；D ：氧化锰离子温度 - 接种量
图 4 不同因素对菌株 P1 氧化率产生交互影响的响应曲面图
温度 28.54℃。
2.5 最佳条件验证结果
在最佳条件下进行 3 组平行验证实验，所得菌
株 P1 的生长量及铁锰氧化效果（图 5）显示，通过
对高效铁锰氧化株菌生长及氧化环境的优化，使得
菌株在 3 d 内对铁的氧化率达到 100%，而对锰的氧
化率达到 93% 以上。
3 讨论
随着地下水中高铁锰污染情况的日益突出，近
年来关于微生物应用于处理富含铁锰地下水的研究
逐渐引起重视。国内对于铁锰生物氧化法的研究
主要集中在铁氧化菌、锰氧化菌的筛选、铁锰氧
化去除条件以及应用方面的研究上［22］，已筛选的
具有铁氧化能力和锰氧化能力的细菌主要包括弗
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.4182
氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）［21］，节杆菌属
（Arthrobacter）［23］ 和 芽 孢 杆 菌 属（Bacillus sp.）［24］
等。目前，对于同时具备铁氧化能力和锰氧化能力
的铁锰氧化菌株的筛选、生理生化研究以及氧化条
件优化等方面研究的较少［9-13］。而已筛选的具有铁
锰氧化能力的细菌主要有假单胞菌属（Pseudomonas
sp.）［11］ 和 金 黄 杆 菌 属（Chryseobacterium sp.）［25］，
其铁氧化率均可达到 90% 以上，但锰氧化率均不理
想，且氧化过程持续时间较长，一般为 6 d 左右。因此，
筛选出在富含铁锰地下水条件下，具有高效铁锰氧
化能力的细菌对高铁锰地下水处理至关重要。
本实验采用特异性的选择培养基从富含铁锰的
地下水井淤泥中分离筛选具有铁锰氧化能力的菌株，
同时，对菌株的铁、锰氧化条件进行优化。常用的
优化方法主要有正交实验法和响应曲面法两种。正
交实验法有一定局限性，它多采用线性模型，只能
对一个个孤立的实验点进行分析，无法精确找出整
个区域内因素最佳组合和最大响应值［26］。而响应曲
面法则采用更为合理的实验设计方案，并同时考虑
实验随机误差的影响，以回归分析方法作为函数估
算工具，将多因素实验的回归因素和实验结果用简
单的二次多项式模型来拟合，计算相对简便，它能
够连续对实验各个水平进行分析，预测模型为一个
曲面，并且能够在整个区域内获得最佳因素组合和
最优响应值［27］。因此本实验采用响应面分析方法对
菌株的铁、锰氧化条件进行优化。研究结果表明，
各因素对菌株铁、锰氧化率的影响作用由大到小依
次为 ：pH> 温度 > 接种量。经响应面优化后铁、锰
氧化率均比优化前明显提高。
在铁锰氧化反应体系中，主要存在两种氧化方
式，分别为化学氧化和生物氧化［23］。在本研究过程
中发现，两种氧化作用中生物氧化占主导地位。其
中化学氧化随着 pH 值升高氧化率表现逐渐上升趋
势。由于 pH 值为生物氧化中菌株氧化的主要影响
因素，随着 pH 值的逐渐升高，生物氧化率表现为
先升高后下降的情况，在菌株最适 pH7.23 时，生物
氧化率最高。因此随着 pH 值的逐步升高，总氧化
率呈现先升高后下降趋势。
另外，后续研究还将进一步考查多株高效铁锰
氧化菌的复配并研究复配菌剂对富含铁锰地下水的
处理效果，为富含铁锰地下水处理新方法的开发提
供技术支持。
4 结论
本实验从富含铁锰的地下水井淤泥中分离获得
1 株能够氧化铁锰的细菌 Bacillus cereus P1，在培养
温度 28℃，pH7，接种量 4% 的条件下，于锰含量
为 200 mg/L、铁含量为 800 mg/L 的选择性培养液中
培养 3 d 后，铁、锰氧化率分别为 82% 和 73%。
采用响应面分析方法对菌株 P1 铁、锰氧化条件
进行优化，优化结果为 ：温度 28.54℃，pH7.23，接
种量 4.35%，铁、锰氧化率最高分别可达 100% 和
93.7%，经响应面优化后铁、锰氧化率比优化前分别
提高 18% 和 19.3%。
参 考 文 献
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2.2
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
B
io
m
as
s/
O
D
60
0n
m
R
em
ov
al
ra
te
/%
12 24 ᰦ䰤h36 48 60 72
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Removal rate of Mn/%
Removal rate of Fe/%
OD. Growth/600nm
图 5 菌株 P1 的生长量及铁锰氧化效果
2016,32(4) 183樊星等：一株高效铁锰氧化细菌 P1 的分离鉴定及氧化条件优化
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（责任编辑 李楠）