全 文 ：中国农学通报 2013,29(10):11-17
Chinese Agricultural Science Bulletin
基金项目：国家自然基金面上项目“DREB和XET基因聚合表达的分子基础”(31071826)；湖南省高等学校科学研究项目重点项目“红花檵木叶色高
温返青的分子机理研究”(10A057)。
第一作者简介：张力，女，1988年出生，湖南永州人，硕士，研究方向为观赏植物生物技术。通信地址：410128湖南长沙市芙蓉区湖南农业大学园艺园
林学院观赏园艺系，E-mail：327427448@qq.com。
通讯作者：于晓英，女，1968年出生，湖南绥宁人，教授，博导，博士，研究方向观赏植物种质资源与生物技术。通信地址：410128湖南长沙市芙蓉区湖
南农业大学园艺园林学院观赏园艺系，Tel：0731-4618744，E-mail：yuxiaoying1578@hunau.net。
收稿日期：2012-11-28，修回日期：2013-02-16。
红花檵木实时荧光定量PCR分析内参基因的选择
张 力，于晓英，符红艳，陈己任，李 达，陈海霞
（湖南农业大学园艺园林学院，长沙 410128）
摘 要：实时荧光定量PCR(qRT-PCR)是目前基因定量表达分析的重要方法，而适宜内参基因的选择对
目的基因表达特征的准确分析至关重要，研究目的是筛选适宜于红花檵木目的基因qRT-PCR分析的校
正内参基因。以红花檵木‘大叶红’(Lorpetalum chinense var. rubrum‘Dayehong’)的芽、嫩茎、叶、花瓣、
种子和愈伤组织为材料，采用qRT-PCR技术比较了4个常用看家基因微管蛋白基因(α-tubulin)、肌动蛋
白基因(β-actin)、18S核糖体RNA(18S rRNA)与甘油醛-3-磷酸-脱氢酶基因(GAPDH)的表达情况。4个
看家基因均能特异扩增并显示较高的扩增效率；经 geNorm和 NormFinder程序综合分析，当采用
qRT-PCR分析红花檵木不同器官和组织中的基因表达差异时，以GAPDH表达最为稳定；在比较不同发
育阶段的叶片及明暗处理的愈伤组织中的基因表达差异时，β-actin表达最为稳定。当采用qRT-PCR分
析红花檵木不同器官和组织及不同发育阶段的叶片与明暗处理的愈伤组织基因表达差异时，可以分别
选择GAPDH和β-actin作为校正内参基因。
关键词：红花檵木；实时荧光定量PCR；内参基因；选择
中图分类号：S687.2 文献标志码：A 论文编号：2012-3872
Reference Genes Selection for Real-time Fluorescence Quantitative PCR in
Lorpetalum chinense var. rubrum
Zhang Li, Yu Xiaoying, Fu Hongyan, Chen Jiren, Li Da, Chen haixia
(College of Horticulture and Landscape, Hunan Agriculture University, Changsha 410128)
Abstract: Real-time fluorescence quantitative PCR(qRT-PCR) has been widely used in gene expression
analysis to date, and selection of suitable reference genes for qRT-PCR according to specific experimental
materials or conditions is very important for accurate normalization of target gene expression. The goal of this
study was to selection the suitable reference genes for qRT-PCR in L. chinense var. rubrum. In this study,
expression of four commonly used housekeeping genes such as α-tubulin, β-actin, 18S ribsomal RNA (18S
rRNA) and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) were assessed by qRT-PCR in various
tissues (buds, young stems, leaves, petals, seeds and callus). All the candidate reference genes could amplify
specifically with high efficiency in qRT-PCR reaction. To determine the expression stability of these genes, the
data were determined by two commonly used applets (geNorm and NormFinder), which produced highly
comparable results depending on the experimental parameters. GeNorm and NormFinder algorithms revealed
that β-actin and GAPDH were both in the highest stability. GAPDH could be used as a reference gene for
qRT-PCR in various organs and tissues of L. chinense var. rubrum, and β-actin could be used as a reference
gene for qRT-PCR in leaves at different stages and callus among diverse treatments of L. chinense var. rubrum.
Key words: L. chinese var. rubrum; real-time quantitative PCR; reference genes; selection
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0 引言
实 时 荧 光 定 量 PCR(real time fluorescence
quantitativePCR, qRT-PCR)反应技术因其重复性好、速
度快、灵敏度高、定量准确等特点，逐渐成为分子生物
学研究过程中进行基因表达分析的重要工具[1-3]，但在
使用qRT-PCR方法进行基因相对表达量的计算时，一
般需引入一个内参基因，即表达较为稳定的看家基
因[4-5]，适宜内参基因的选择对目的基因表达特征的准
确分析至关重要[6-7]，越来越多的研究[8-10]表明qRT-PCR
分析中，针对特定试验材料、试验条件筛选最适内参基
因是提高其准确性的先决条件。牡丹[11]、小麦[12]、茶[13]
等的研究都表明，不是每个内参基因能在各种类型的
组织或细胞以及在各种试验的条件下均能恒定的表
达，对于不同植物，不同试验条件可能有不同的合适内
参基因。红花檵木(L. chinense var. rubrum)是长江中
下游及以南地区具有丰富园林用途的主要彩叶植物之
一，其叶片花色素合成相关基因的表达特性、叶片呈色
分子机理及叶色的遗传改良一直是相关研究者非常关
注的问题，课题组在研究中成功克隆到了一个查尔酮
合 成 酶 基 因 LcvrCHS1（GenBank 登 录 号 为
JQ609678），想进一步了解其在红花檵木中的表达特
性，但其相关的基础研究比较薄弱，对于使用qRT-PCR
方法分析时在红花檵木中表达较为稳定的看家基因有
哪些不是很清楚，本研究的开展可以为红花檵木功能
基因的表达分析奠定基础和提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
以目前在园林绿化中广泛种植的红花檵木品种
‘大叶红’(L.chinense var. rubrum‘Dayehong’)的芽、嫩
茎、叶（老叶和嫩叶）、花瓣、种子和愈伤组织（光照培养
1周和黑暗培养 1周的愈伤组织）为材料进行总RNA
提取和RT-PCR分析。材料取自湖南农业大学园艺园
林学院花卉基地和组培室验室。
1.2 试验仪器与试剂
1.2.1 主要试验仪器设备 Z323K高速冷冻型离心机
（德国Hermle公司）；Kodak Gel Logic 212凝胶成像系
统（美国Carestream Health公司）；制冰机(XB70)（美国
GRANT 公司公司）；7300 system real-time quantity
PCR仪（美国Applied Biosystems公司）；荧光定量PCR
管（TLS-0851，上海英骏生物技术有限公司）。
1.2.2 生化试剂 TaKaRa PCR Master mix（大连宝生物
SYBR Green Realtime PCR Master Mix）；内参基因引
物由上海英骏生物技术有限公司合成；植物总RNA提
取试剂（RNAplant plus Reagent）购自天根生化科技
（北京）有限公司；其他试剂包括β-巯基乙醇；5 mol/L
NaCl；氯仿；异丙醇；75%乙醇；buffer RDD；DNase 储
存液；EDTA (pH 8.0)；RNase-free ddH2O等。
1.3 试验方法
1.3.1 红花檵木总RNA提取和 cDNA合成 总RNA提
取方法为课题组参考茶树[13]、葡萄[14]等植物的方法之
后改进并针对红花檵木特异性建立的专门提取方法。
所得总RNA质量采用琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光
度计进行检测。随后，以各样品中 1 μg总RNA为模
板，利用Quantscript RT Kit（TIANGEN，北京）反转录
成cDNA第一链，于-20℃储藏备用。
1.3.2 红花檵木实时荧光定量PCR应用体系的建立
（1）PCR引物设计。根据 qRT-PCR引物的设计原
则，参考牡丹[11]、小麦[12]等实时荧光定量PCR分析时内
参基因的选择，分别设计 18S rRNA、GAPDH、β-actin
和α-tubulin 4个内参基因的定量PCR引物。引物序列
见表1。
（2）目的基因片段的普通PCR扩增。扩增总体系
表1 Real-time RT-PCR检测中所用的4个内参基因的引物序列
为 20 μL：其中 dNTPs (10 mmol/L) 1 μL，10 × PCR
buffer（含Mg2+）2 μL，引物（正向引物与反向引物）各1 μL，
模板 cDNA 1 μL，Taq 酶 (2.5 U) 0.5 μL，DEPC 水
13.5 μL。扩增程序为：预变性95℃ 3 min；随后进行40
个循环（95℃变性 30 s，62℃退火 30 s，72℃延伸 30 s）；
最后72℃延伸7 min。PCR产物采用2%琼脂糖凝胶电
泳，Goldview染色后用凝胶成像系统观察分析。
1.3.3 内参基因的荧光定量 PCR 扩增 将 forward
10 μmol/L、ROX 0.04 μL、reverse引物各 0.4 μL、生物
用水8.16 μL、TaKaRa PCR Master mix10 μL、待测样品
内参基因名称
Ribosomal RNA 18S
Beta actin
Tubulin alpha
Glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase
内参基因代号
18S rRNA
β-actin
α-tubulin
GAPDH
正向引物(5–3)
CGGCTACCACATCCAAGGAA
GCCATCTTTGATTGGAATGG
TCCAAACTAACCTTGTGCCATAC
TTGGCATCGTTGAGGGTCT
反向引物(5–3)
GCTGGAATTACCGCGGCT
GGTGCCACAACCTTGATCTT
ACACCCTTGGGTACTACATCTCC
CAGTGGGAACACGGAAAGC
扩增子大小/bp
191
175
220
206
·· 12
张 力等：红花檵木实时荧光定量PCR分析内参基因的选择
cDNA各1 μL（每个样品重复3次）加入荧光定量PCR
专用反应管（总反应体系为 20 μL）。反应条件设置
为：95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火1 min，
40个循环。之后进行 60~95℃的熔解曲线分析，荧光
波长设为FAM 490 nm。完成上述步骤之后，将加好样
的专用反应管放在 7300 system real-time quantity PCR
仪上反应，仪器自动读取数据。
1.3.4 数据处理和分析 应用REST2009软件，依据公
式Q=E△Ct，计算每个样品的Ct值对应的各特异引物
相对表达量Q值。其中E为特异引物扩增效率（E值
默认为 2），△Ct=Ctmin–Ct样品（Ctmin为全部样品中最
低 Ct 值，Ct 样品为各样品的 Ct 值）[10-13]。利用
NormFinder软件和GeNorm软件，将数据导入geNorm
程序，分别计算不同试验条件下各内参基因的平均表
达稳定值(M)并进行排序（M值越低，基因表达越稳
定），与此同时，将数据导入NormFinder程序，分别计
算不同试验条件下各内参基因的表达稳定值(S)并得
出最稳定的基因（S值越小，基因表达越稳定）[12-13]。综
合二者分析结果，确定不同试验条件下最合适的内参
基因。进而筛选出最优的校正内参特异引物。根据4
个内参特异引物在红花檵木不同器官和组织中计算得
到的相对表达量，对各个内参特异引物的表达稳定性
进行统计学分析。
2 结果与分析
2.1 总RNA质量检测
从琼脂糖凝胶电泳结果可知，红花檵木各样品总
RNA条带清晰，28S rRNA的亮度约为18S rRNA亮度
的 2倍，无明显降解现象。表明红花檵木各器官总
RNA的提取质量高，完整性好，可满足于后续的试验
要求（图1）。
2.2 内参基因目的片段的RT-PCR扩增结果
图 2是以嫩叶总RNA为模板扩增的各内参基因
片段的琼脂糖凝胶电泳图，从图中可以看到在 100~
250 bp之间均有比较亮的特异条带，和设计引物的预
期片段大小一致，说明扩增反应有较好的专一性，可用
于后续的荧光定量PCR分析。
2.3 内参基因的荧光定量PCR分析
以红花檵木不同器官和组织共8份样品的第一链
cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR分析。结果（图
3）表明，α-tubulin引物来源的熔解曲线没有明显的单
500 bp
250 bp
100 bp
1：α-tubulin；2：β-actin；3：18S rRNA；4：GAPDH；M：Marker D2000
图2 红花檵木内参基因RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测
2000 bp1000 bp750 bp
28S18S
1：老叶；2：嫩叶；3：种子；4：嫩茎；5：光处理愈伤组织；
6：暗处理愈伤组织；7：芽；8：花瓣；M：MarkerD2000
图1 红花檵木不同器官和组织总RNA的琼脂糖凝胶电泳检测
A1
M 1 2 3 4 5 6 7 8
M1 2 3 4
1.0×101
1.0×100
1.0×10-1
1.0×10-2
1.0×10-3
1.0×10-4
·· 13
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1.0×10-1
A2
B1
B2
C1
1.0×101
1.0×10-3
1.0×100
1.0×10-1
1.0×10-1
1.0×10-3
1.0×102
1.0×101
1.0×100
1.0×10-2
1.0×10-4
1.0×10-3
1.0×10-1
·· 14
张 力等：红花檵木实时荧光定量PCR分析内参基因的选择
一峰，其他 3个内参基因引物来源的各材料的熔解曲
线都只有明显的单一峰，说明所用引物只能特异性地
扩增β-actin、18S rRNA和GAPDH内参基因的相应产
物，且此 3个内参基因在每个待测样品的PCR扩增曲
线的重复性较好。
2.4 内参基因的表达稳定性分析
图4是GeNorm软件分析计算的结果，从图中可以
看出4个内参基因在红花檵木不同材料中的表达稳定
性有差别，当以不同器官、组织为材料时，GAPDH、
β-actin、18S rRNA和α-tubulin表达稳定度的平均值M
由低到高依次为0.852、0.960、1.084和1.593，表明4个
内参基因的表达稳定度由高到低依次为 GAPDH>
β-actin>18S rRNA>α-tubulin。当以不同生长阶段的叶
片（老叶和嫩叶）为材料时，β-actin、GAPDH、18S rRNA
C2
D1
D2
A：α-tubulin；B：β-actin；C：18S rRNA；D：GAPDH
图3 红花檵木不同组织中4个候选内参基因的real-time PCR扩增曲线的对数曲线(1)和熔解曲线(2)
·· 15
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1.6
Ranking order
A
B
C
1
GAPDH(S=0.462)
β-actin(S=0.357)
β-actin(S=0.217)
2
β-actin(S=0.553)
GAPDH(S=0.449)
GAPDH(S=0.313)
3
18S rRNA(S=0.721）
18S rRNA(S=0.683
18S rRNA(S=0.382)
4
α-tubulin(S=1.430）
α-tubulin(S=1.118)
α-tubulin(S=1.020)
Best gene
GAPDH
β-actin
β-actin
表2 红花檵木不同器官与组织中候选内参基因的表达稳定值(S)排序
注：A：不同器官和组织（芽、老叶、嫩叶、嫩茎、花瓣、种子、愈伤组织）；B：不同生长阶段叶片（老叶、嫩叶）；C：不同愈伤组织（光照培养1周和黑
暗培养1周的愈伤组织）。
M
A
M

B
MM

C
MM
A：不同器官和组织（芽、嫩叶、嫩茎、老叶、花瓣、种子、愈伤组织）；B：不同生长阶段叶片（老叶、嫩叶）；
C：不同愈伤组织（光照培养1周和黑暗培养1周的愈伤组织）
图4 候选内参基因在红花檵木不同器官组织中的表达稳定值(M)（GeNorm软件分析结果）
和α-tubulin表达稳定度的平均值M由低到高依次为
0.364、0.487、0.683和0.879，表明4个内参基因的表达
稳定度由高到低排序为β-actin>GAPDH>18S rRNA>
α-tubulin。当以愈伤组织（光照培养1周和黑暗培养1
周的愈伤组织）为材料时，β-actin、GAPDH、18S rRNA
和α-tubulin表达稳定度的平均值 M依次为 0.137、
0.196、0.562和 1.178，表达稳定度由高到低排序为
β-actin>GAPDH>18S rRNA>α-tubulin。
表 2是NormFinder软件分析计算的结果，从表中
可以看出，当以不同器官、组织为材料时，GAPDH表
达稳定值最小，是最好的内参基因。当以不同生长阶
段的叶片（老叶和嫩叶）和不同愈伤组织（光照培养 1
周和黑暗培养1周的愈伤组织）为材料时，β-actin表达
稳定值最小，是最好的内参基因。综合以上分析结果，
当应用荧光定量 PCR分析比较红花檵木的不同器官
与组织基因表达差异时，可选择GAPDH作为校正内
参基因；而分析不同生长阶段的叶片和明暗处理的愈
伤组织时，可以选择β-actin作为校正内参基因。
3 结论与讨论
研究结果表明，4个常用内参基因中没有一个在
红花檵木所选样品中都表达最稳定。通过GeNorm与
NormFinder软件分析可知，当应用荧光定量PCR分析
1.6
1.5
1.4
1.3
1.2
1.1
0.9
0.8
α-tubulin 18S rRNA GAPDH
β-actin
0.9
0.8
α-tubulin 18S rRNA
GAPDH
β-actin
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.8
α-tubulin 18S rRNA GAPDH
β-actin
1.2
1.0
0.6
0.4
0.2
0.0
1.0
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张 力等：红花檵木实时荧光定量PCR分析内参基因的选择
比较红花檵木不同器官及组织中的基因表达差异时，
GAPDH表达最为稳定，在比较不同发育阶段的叶片
及明暗处理的愈伤组织中的基因表达差异时，β-actin
表达最为稳定，可以选择其作为相应条件下的校正内
参基因。为了满足某些基因表达定量分析的高精确度
要求或进行不同试验间交叉对比时，作者认为可以同
时使用在上述条件下表达都较稳定的 β-actin 和
GAPDH作为校正内参基因。
随着对qRT-PCR要求的不断提高，为了得到更可
靠的试验结果，需选择较为合适的 1个或多个内参基
因在试验中进行校正。较为理想的内参基因应能在各
种类型的组织或细胞以及在各种试验的条件下均能恒
定的表达。常用看家基因 α-tubulin、β-actin、18S
rRNA、GAPDH及 ubiquitin广泛存在于所有真核细胞
中，是维持细胞结构或基本代谢必需的基因，因此常被
认为在所有细胞及生理状态下都较稳定表达，然而近
年来的研究结果表明这些基因也受到不同试验条件的
影响，并非绝对稳定表达的内参基因。同时相关研究
结果还表明任何一种内参基因，其所谓的恒定表达都
体现在试验因素的作用下或一定类型的细胞，即“有范
围”的恒定[11-13]。如Czechowski等[15]发现在拟南芥生长
发育过程中，Lovdal等[16]发现番茄遭受缺氮、低温、弱
光胁迫时 ubiquitin都显示很高的表达稳定性，而Reid
等[17]发现在葡萄浆果发育期间，Gu等[18]发现菊花高温
胁迫下GAPDH表达水平总是一致，孙美莲等 [10]研究
则发现利用荧光定量 PCR分析茶树不同器官组织中
的基因表达差异时，β-actin的表达最稳定；而比较不同
成熟度的叶片和愈伤组织时，GAPDH的表达最稳
定。本研究的结果也验证了这种“有范围”的恒定。另
外，一些研究还证实选择2个或2个以上的内参基因作
参照，可以减弱单一内参变化的影响，笔者非常认同这
一观点，王彦杰等[12]通过对牡丹实时定量PCR分析研
究也认为在各试验条件下使用 ubiquitin和GAPDH 2
个表达最稳定的基因组合，可获得更为精确的基因表
达结果。
本试验的结果为红花檵木功能基因表达qRT-PCR
分析时内参基因的选择提供了很好的参考，但也还存
在一些不足，如相关处理和取材虽然有较好的代表性，
但不够全面，候选内参基因数量有限等，还有待在今后
的研究中进一步完善。
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