全 文 ：斌 r廿t ’+
微 生 物 学 报3 2( 2) : 145 一 l今 , , 1 9 9 2
4 . 加 M i e or b i o l o ` 咬. 5 1川 ` 。
芜青花叶病毒外壳蛋白墓因的克隆和表达
邱并生 王晋芳 王小凤 沈学军 田 波
(中国科学院微生物研究所 , 北京 10 0 0 8 0 、
芜青花叶病毒 ( T u r n i p M o s : i ` v i r u s , T u -
M v ) 属于马铃薯 Y 病毒组 , 其基 因 组 为 单 链
且 N A , 寄主范围广 , 能侵染 20 个科的双 子 叶植
物川。 在我国 lT , M v 的分布遍及各地 , 是危害
油菜、 白菜 、萝 卜等十字花科作物的主要病毒 。 目
前尚无有效的防治手段 。 转基因植物的研究为植
物抗病毒育种提供了一条有利途径 。 本实验成功
地合成了 T u M v 一 R N A 的 c D N A , 以 p u c l , 为
载体进行了外壳蛋白基因的克隆。 w e , ` , r n BI “ ,
分析结果表明 ,第 30 号重组克隆在大肠杆菌中有
T u M v 外壳蛋白产物的表达 。
飞
材 料 和 方 法
( 一 ) T u M v 一 。 D N A 合成和克隆
1
. 病毒的提纯 : 将 T u M v (北京郊区大白菜
分离物 )繁殖在芥菜上作为提取材料 ,参照 C h io 「 ’ 1
的方法 ,经差速离心和 cs s o . 梯度离心得到提纯
的病毒样品 。
2
.
T u M v 一 R N A 的提取 : 主要 依据 T o r i , a ·
二 at,
, “ 方法进行 。 提纯的 T o M v 经蛋白酶 K 和
s D s 一酚处理 ,提取 R N A 。
3
. ` D N A 合成 : 根据 T u M v 一 R N A 3 ’ 末端
具有 p o l , ( A ) 的特点 , 以 0 1 19 0 ( d T ) 作引物 , 用
BR L 公司的 ` D N A 合成试剂盒分别合成 。 D N A
的第一条链和第二条链 ,加入 E D T A 到 20 o m o l/
L 终止反应 ,琼脂塘凝胶电泳分析产物大小 。
呜 . c D N A 克隆 : 用 E . co “ 的 D N A 聚合酶
一大片段酶将 c D N A 两端补齐 , 用 s m a l 将 p U c l g
切成平端 ,在 T ; 一 D N A 连接酶作用下室温反应 4
小时 。 重组质粒转化 E . c o l i D H 5 a 。 具体方法
详见文献〔, ]。
(二 ) , 组克隆的筛选及鉴定
1
.菌落杂交 : 以 卜 , , p 一 A T p 标记 T u M v -
RN 人 , ` 末端制备杂交探针 , 杂交方法按 S h o bt ’ 1
方法进行。
2
. 重组质粒的检查 : 采 用 快 提法 ` ” 提取 质
粒 , 用 E co RI 和 aB 二 H l 进行酶切 , 经 1% 琼脂塘
凝胶电泳分离检测插入片段 。
(三 ) T o M V 外亮资白签因的筛选
卜重组克隆的免疫筛选 : 首先用带有 p U C 19
的 E · t o l` D H 5 a 对 T u M v 抗血清进行非特 异
性吸收处理 ; ” 。 将阳性克隆菌点在硝酸纤维紊膜
上 ,在含有 A m p i e i l l i n 的 L B 平板 l : 培养 , 用氛
仿熏滤膜 15 分钟 , 后悬于 裂解 液 ( 1 0 m m o l / L
T r i s
一
H C I p H 7
.
s
, 一, o m m o l / L N a c l , , m m o l / L
M g c l
, , 一 ,% B s A , 一” g / m l 牛咦 D N a , e , 4「,件g /
m l 溶菌酶 ) 中室温 过夜 , 经 T N T ( l o m 。 、 o 一/ L
T r i
, 一
H e l p H s
.
o : 一s o m 二 0 1/ L N a C t , 0 . 0 5% 吐
温 20 )处理后 , 与 T o M v 抗血清进行免疫反应 ,
最后采用碱性磷酸酶系统进行显色 `” 。
2
.
w
, , t e r n Bl o , 分析: 将直接免疫筛选得
到的阳性克隆荣休悬于蛋 白 裂解液 ( 2% s D s ,
5% 硫基乙醉 , 6 2 . 5。 。 0 1 /L T r i s , 10 % 甘油 ,
。 . 05 % 澳酚蓝 )中煮沸 10 分钟 , 离心后的 卜清液
进行 s D s 一 P A G E 分离蛋白 ,将蛋白电转移到硝酸
纤维素膜上 。 转移缓冲液为 l o m m 。 l / L N 泣 }化 。 , ,
3 m m o l / L N a
,
C o
,
( p H g
.
9 )
,
3 5 o m A 转移 3 0 分
钟 ,免疫及显色反应与直接免疫筛选相同。
结 呆 和 讨 论
(一 ) 。 D N ^ 合成和克隆
合成的 。 D N A 经 1 . 4% 碱性琼脂城电 泳 和
放射自显影分析 , 表明第一和第二条链的大小 在
0
.
3 0一 3 k b 。 ;函过载体 p U c 一, 转化后获得白色克
隆 。
以 T u M v 一 R N人 为探针 , 挑选出 3 0 多卜白
色转化菌进行菌落杂交 ,其中有 3 , 个杂交斑点为
强阳性 。 此结果证明这 ” 株克隆菌含有 T o M v -
c D N A o
(二 ) T u M v 外宪蛋白甚因的表达
在硝酸纤维素膜 上进行直接 免疫 筛 选的结
果 , 只有第 30 号重组克隆出现了显色斑点 。 对该
本文于 l , 91 年 咭月 , 日收到。
DOI : 10. 13343 /j . cnki . wsxb. 1992. 02. 010
`一 广
犷
“ 。 橄 生 物 学 报
克隆进行 we s t.r u l s。 , 检侧 ,结果膜上出现了一 , 。
条与 T u M v 外壳蛋白同样大小 ( 2 7 0 0 0 D a l t o n )
的显色带 (见图 岭 , 从而确证了第 30 号克隆含有
T u从 v 外亮蛋白的基因 。
在用 E` 。 IR 和 aB ln H I 对重组质拉 进行酶
切分析时发现第 30 号克隆能产生两个片段 ,这表
明播人到 p U C一9 中的 T u M v 一 ` D N ^ 片段中 含
有此限制性内切酶位点 , 于是我们分别用 cE o R I
和 aB o H I 对第 30 号进一步作酶切分析 , 结果仅
有 “ c o R , 可将 T u M v 一 c D N ^ 切成大小分别为
o
.
6 o k` 和 0 . 3 , k b两个片段 (见图 2 ) o
本实验的结果表明我 们 巳 经 获 得能表 达
T扭 v 外壳蛋白荃因的克隆 , 对植物抗病基因工
程打下了荃础 。 T o M v 外壳蛋白基因的序列分析
正在进行中。
3 2 卷
又 4
厂 图 2 第 扣 号重组质拉酶切电泳图谱
1
.
E c o R I 单酶切 ; 2 . B a口 H l 单醉切 ; 3· E e o -
lR 十 B二 H l 双酶切 ; ` 标准分子 t (枯草芽泡
杆菌噬菌体 S P P I D N 人 的 名e o R I 酶切片段 )
扁 . 考 文 献
电.J,1J ...Jù se,二`,jJō户Oó.Lf.r..r Lr`
·沪`, r`.工
:`叭ǎI洛产犷ó八子亡矛.、
,月盆,J.,产.臼r,十.`
翻 x W e . t e r o B l o 。 分析 T u M v 外亮蛋白羞因
在 E · ` o , 1 D H ,“ 中的表达
l
。
T . M V 外充理白 ; 2 . E . ` 0 11 D H S“ ;
.3 * 有外宪蛋白甚因的宜组克隆 (第 30 弓克陇 )
复旦大学生物系植物病毒研究 室 (译 ) : 植物病
毒志 ,第一集 ,第 lz 一 ” 页 ,上海科学技术出版
社 ,上海 , 19 8 1 年 。
C h o i
.
J
. 【 . e l a l . : 才… P无y r o P口 r汤0 S o e .
J a P ` 月 . 枯 : 今4 0一 4 4 8 . 19 7 7 .
T o r i y a m
a . 5
.
e t a l
.
: J
.
G 口月 . V i 尸0 1 . , 67 :
12呜7一 1 25 , , 1 9 8 6 .
T o r i丫a m a , S ` 、 e t 一 1 . : J . G t 二 V i r o l 二 孙:
5 0 5一 5 1 1 , 1 9 89 .
5 t a n t o n
. 母. G . : P l a n t M o l e e u l a r B i o l o g 萝
M一皿 a l . P M A N 一A 7 13 9一几1 . K l u , e r A c: d e -
m i c P u b li ` h e r : L o n d o n , 19 8压.
S五a h . D . M . e l a l . : S c i` . c 口 . 23 3 : 斗7 8 一礴8 1 ,
19 8 6
.
S o r g h i n i
.
M
.
A
.
: N , c l , i e 汉 , i d , R , s 二 l 7( 9 ) :
3` 0 4 . 1, 8 8 .
Sa m b r o o k
.
J
.
e t 一 1. : M o le e 粗 l a r C l o n i n g . A
L a b o r a t o r y M
a n u a l
,
C o ld S P r i n g H a r b o r
L a b o r a t o r y P r . * s
,
N e w Y o r k
.
19 8 9
.
óù丁赵冲翻
包曲 一扩。 卜山加
.户广卯
2期 邱并生等 :芜青花叶病毒外壳蛋白基因的克隆和表达 14,
C L O N I N G A N D E X P R E S S IO N O F C O A T P R O T E IN G E N E
O F T U R N I P M O S A IC V IR U S
Q i u B i n g s h e n g W a n g J i n f a n g W a n g X i a o f e n g Sh e n X u e i u n T i a n P o
( I
o s r i t u t , o j M
, c r o b , o l o g y
.
A c o d 口 , i a 5 1 , i c a , B e `矛10 9 1 0 0 0 8 0 )
. ` .
T u r n i p m o s a i c v i r u s ( T
u M V )
, a : n e -
m b e r o f t h e P o t y v i r u s g r o u P
, a n d e o n s i
-
与e r e d : 。 b 。 : h e m a i 。 v i r u 。 : h a : 。 a u s e
。 e v e r e d i s e a s e o f e r u e i f e r P l a n t s , s u e h
a s B r a s s i c a C a m P君s r r i , , B
.
P 。夜i , e n s i s ,
R a P h a ” u s S a t i夕u s e t e
.
T h e R N A w a s
e X t r a c t e d f r o n z T u M v
,
p盯 i f i e d b y d i f -
f e r e n t x a l e e n t r i f u g a t i o n a n d C
, 5 0 ; d e
-
n s i r y g r a d i e n t c
e n r r i f u g a t i o n
, u s i n g 0 11
-
9 0
一
d T a s a p r im e r t o s y n t h e s i z e e D N A
,
w h i e h w a o t il e n c l o n e d i n t o v e c t
o r P l a
-
s m i d P U C 1 9
.
I t h a s b e e n s h o w n b y
i m m u n o l o g i c a l s c r e e n i n g a n d W e s t e x n
B l
o L a n a l y s i s t h a t t h e N o
.
3 0 e l o n e
e x p r e s s e d t h e e o a t P x o t e i n g e n e P r o d u c t
.
T h e s e q u e n e e a n a l y s i s (
, f c o a t P r o t e i n
g e l l e 1 5 I n P r o g r a s 3
·
K e y w o r d -
落 ` T u r n iP m o s a i c v l r u s ; C o a t P r o t e i n ;
G e n e e x P r e s s i o n
1卜详户`甲
几. 睁
峨目 . `