全 文 ：中国农学通报 2013,29(01):24-28
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
彩叶植物[1]因其色彩鲜艳、易于形成大色块景观
等特点，可以弥补城市淡花季节色彩单调的缺憾，已越
来越受到园林设计者的青睐，特别是随着人们生活水
平的提高及城市园林建设步伐的加快，彩叶植物在现
代城市园林规划设计中发挥着越来越重要的作用。红
花檵木[2] (Loropetalurn chinense var. rubrum)叶红花艳，
色彩绚丽，以其突出的观赏特性，较强的适应性、抗逆
性成为长江中下游及以南地区具有丰富园林用途的主
要彩叶植物之一。其叶片花色素合成相关基因的表达
特性、叶片呈色分子机理及叶色的遗传改良一直是相
关研究者非常关注的问题[3-4]，但因为相关的基础研究
基金项目：国家自然基金面上项目“DREB和XET基因聚合表达的分子基础“(31071826)；湖南省高等学校科学研究项目重点项目“红花檵木叶色高
温返青的分子机理研究“(10A057)。
第一作者简介：许威，男，1988年出生，湖南汨罗人，硕士，研究方向为观赏植物生物技术。通信地址：410018湖南长沙芙蓉区湖南农业大学研究生
楼湖南农大园艺园林学院观赏园艺系，Tel：0731-4618744，E-mail：327427448@qq.com。
通讯作者：于晓英，女，1968年出生，湖南绥宁人，教授，博导，博士，研究方向为观赏植物种质资源与生物技术。通信地址：410018湖南长沙芙蓉区湖
南农业大学园艺园林学院观赏园艺系，Tel：0731-4618744，E-mail：yuxiaoying1578@hunau.net。
收稿日期：2012-08-22，修回日期：2012-10-22。
红花檵木CHS基因的克隆与序列分析
许 威，于晓英，陈己任，符红艳，胡博文，陈彦斌，李 达
（湖南农业大学园艺园林学院观赏园艺系，长沙 410128）
摘 要：查尔酮合酶(chalcone synthase, CHS)是进入类黄酮和花色素苷次生代谢的第 1个关键酶。根据
植物查尔酮合成酶保守区序列设计引物，以红花檵木(Loropetalurn chinense var. rubrum)大叶红的嫩叶为
材料，用RT-PCR方法，分离得到了一个查尔酮合成酶基因的cDNA（GenBank登录号为 JQ609678），将该
基因命名为LcvrCHS1。该序列长927 bp，编码232个氨基酸残基。其核苷酸序列与GenBank已登录的
同样来源的核桃、山茶属植物CHS序列同源性达83%，与其他科植物（绣球花、葡萄、桃、马铃薯、甘草、
领春木属）CHS序列同源性也达到80%以上；其编码的氨基酸序列与山茶属、葡萄、鳄梨、洋梨、沙梨、映
山红CHS基因编码的氨基酸序列同样具有高度同源性，同源性高达98%。
关键词：红花檵木；查尔酮合成酶基因；克隆；序列分析
中图分类号：S687.2 文献标志码：A 论文编号：2012-2903
Cloning and Sequence Analyzing of Chalcone Synthase Gene in Loropetalum chinense var. rubrum
Xu Wei, Yu Xiaoying, Chen Jiren, Fu Hongyan, Hu Bowen, Chen Yanbin, Li Da
(College of Horticulture and Landscape, Hunan Agricultural University, Changsha 410128)
Abstract: Chalcone synthase (chalcone synthase, CHS) is the key enzyme that catalyzes the first step in
flavonoids biosynthesis and anthocyanins secondary metabolites. A full-length cDNA encoding CHS was
cloned from the young leaves of Loropetalurn chinense var. rubrum by RT-PCR using specific primers based
on the highly conserved sequences of plant CHS that had already known. Blast search revealed that it was a
new gene, and was named as LcvrCHS1 (GenBank accession: JQ609678). The sequence was 927 bp, encoding
232 amino acid residues. It had 83% sequence homology with walnut and camellia that had been logged in
GenBank; with other genus plants (hydrangea, grapes, peaches, potatoes, licorice, Euptelea genus), CHS
sequence homology was also more than 80%; with other plants (camellia, grapes, avocados, bartlett pear, sand
pear, azalea), CHS sequence also had high homology, up to 98% homology.
Key words: Loropetalurn chinense var. rubrum; chalcone synthase gene; cloning; sequences analysis
许 威等：红花檵木CHS基因的克隆与序列分析
比较薄弱，进展还比较缓慢。
彩叶植物的叶片呈色与类黄酮类色素花色素苷的
含量和分布密切相关。查尔酮合酶 (chalcone
synthase，CHS)是进入类黄酮和花色素苷次生代谢的
第一个关键酶[5]。CHS基因的沉默、超表达或者基因
突变都将直接或间接影响到该过程，从而影响整个类
黄酮和花色素苷的总产量。目前，CHS基因家族部分
成员已在彩叶草[6]、牡丹[7]、观赏海棠[8]等园艺植物中都
有被成功克隆。但在红花檵木中还未见相关报道，本
研究的开展可以很好地为揭示红花檵木叶片呈色的分
子机制提供参考。
1 材料与方法
1.1 植物材料、菌株和试剂
选取红花檵木(Loropetalurn chinense var. rubrum)
‘大叶红’品种（由湖南农业大学园艺园林学院花卉基
地提供）嫩叶为材料。DH-5α为转化受体菌，DNA纯
化回收试剂盒购自 TIANGEN 公司。质粒载体
pGEM-T Vector (50 ng/µL)，购自美国Promega公司。
1.2 总RNA提取
总RNA提取方法为针对红花檵木特异性建立的
专门提取方法，于-70℃保存备用。所得总RNA质量
用琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度计进行检测。
1.3 cDNA第一链的合成
根据从 GenBank上搜录到的 CHS基因的同源
cDNA 全长序列，设计 CHS 基因的简并引物为
CHS52： 5-CCTYCGYATCACMAABAGYGAGCAC-
3；CHS32：5-CAAAYCCRAAWAGSACWCCCCAC-3；
反转录的特异引物为B26 (5-GACTCTAGACGACAT
CGATTTTTTTTTTTTTTTTT-3’)。 所 有 引 物 均 有
Invitrogen公司合成。
cDNA第一链的反转录合成，反转录体系为
25 μL，先将 5 μL RNA与 2.5 μL B26引物(2.5 mmol/L)
加入，再加入 5 × RTM-MLV 缓冲液 5 μL、1 μL
MMLV-RT、 5 μL dNTP (10 mmol/L)、 0.13 μL
RNA-Inhibitor，然后用RNase-Free H2O加至25 μL。在
室温下放置10 min，反应条件为42℃，1 h，于冰上放置
2 min后，于-20℃保存。
1.4 CHS基因的扩增
以前面合成的 cDNA第 1链为模板，建立 PCR反
应体系和循环程序：在 30 μL的反应体系中分别加入
3 μL cDNA第 1链模板、4 μL 10×Buffer (Mg2 +-plus)、
5 μL dNTP、1 μL Taq (2.5 U/μL)、25 pmol的正向引物
和反向引物CHS52、CHS32各1 μL，加15 μL ddH2O使
总体积为 30 μL；PCR循环程序：94℃预变性 4 min；然
后进行一下循环：94℃变性1 min，35℃退火1 min，72℃
延伸 1 min，进行 5个循环；94℃变性 1 min，55℃退火
1 min，72℃延伸 1 min，进行 30个循环；然后 72℃保温
5 min，取出待用。
1.5 PCR产物的回收和克隆
RT-PCR产物在 2%的琼脂糖凝胶电泳后，切取目
标带，用TIANGEN公司的通用型DNA纯化回收试剂
盒回收。然后，用回收的目标产物进行连接、转化、
回收。
1.5.1 连接 在 0.2 mL反应管中加入 pGEM-T 1 µL，纯
化的 PCR产物 2 µL，T4连接酶(2~3 weiss units)1 µL，
2×连接缓冲液 5 µL，补超纯水至总体积 10 µL，在 4℃
冰箱过夜连接。
1.5.2 转化 先配制试验所需的LB固体培养基和液体
培养基，然后在无菌状态下，取-70℃冻存的DH5α感受
态细胞 50 µL于冰浴上解冻，将 5 µL连接产物与感受
态细胞混匀，冰上放置30 min，42℃热激45~50 s，立即
冰浴 3~5 min，加入 400 µL预冷的 LB液体培养基，
37℃，200 r/min，摇床摇培1.5 h。再取200 µL在LB固
体培养基(+Amp/IPTG/X-Gal)铺板，37℃平放直至液体
全部被吸收，然后倒置培养过夜。经12~16 h培养后，
培养皿上生长着许多白色和蓝色菌落，蓝色菌落只含
有载体，而白色菌落为 DNA重组子（载体+插入片
段）。挑选白色菌落进行培养并进行PCR检测。
1.6 克隆的鉴定和测序
用质粒小提中量试剂盒提取质粒：质粒小提中量
试剂盒购自天根生化科技有限公司，其具体操作步骤
按试剂盒的说明书进行。并通过 PCR进一步鉴定阳
性克隆（含有外源目的特异引物的DNA重组子），对白
色菌斑进行PCR检测。菌落PCR验证阳性克隆的反
应体系 20 μL，1 μL dNTPs (10 mmol/L)，2 μL 10×PCR
buffer（含Mg2+），1 μL菌液，0.5 μL Taq酶(2.5 U/mol)，
正向引物和反向引物各1 μL，13.5 μL ddH2O。反应程
序为预变性 94℃ 3 min，30个循环（94℃变性 1 min，
55℃退火1 min，72℃延伸90 s），72℃延伸10 min，反应
完成后 4℃保存。PCR产物琼脂糖电泳后对比条带，
判断白斑是否为假阳性。鉴定完成后，将菌液送往广
州 Invitrogen公司用 3730基因分析仪测序，并对结果
进行分析。
2 结果与分析
2.1 红花檵木CHS基因的克隆
针对红花檵木特异性建立的专门提取方法提取的
总RNA（图 1a），经反转录后合成 cDNA第一链，以此
第一链 cDNA为模板，以上述设计的引物进行CHS基
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因的 PCR扩增，扩增产物经 1%的琼脂糖凝胶电泳检
测，结果如图 1b所示。从图 1b中看出得到了一条约
900 bp的条带，与预期片段大小一致。该片段用DNA
回收试剂盒回收、纯化后（图 1c）连接 pGM-T载体，转
化大肠杆菌DH5α，并进行蓝白斑筛选，挑取白斑摇
菌，抽提质粒，质粒经RNaseA消化后用EcoRⅠ进行酶
切，用特异引物进行PCR扩增检测（图1d、图1e），同样
扩增出约900 bp大小的片段，进一步验证挑取的克隆
包含有目的片段。
2.2 红花檵木CHS序列的测定及分析
将经初步鉴定的阳性克隆送广州 Invitrogen公司测
序，序列长度为927 bp，编码232个氨基酸（见图2），重命
名为LcvrCHS1（GenBank登录号为 JQ609678）。利用
NCBI中的 BLASTn进行序列比对，发现该序列与
(a)红花檵木叶片总RNA；(b)特异引物扩增产物；(c)切胶回收产物；(d)质粒PCR检测；(e)质粒PCR纯化回收产物；
M为DL 2000；1分别为RNA提取物(a)、特异引物扩增PCR产物(b)、PCR纯化回收产物(c)、质粒PCR检测产物(d)、质粒的酶切产物(e)
图1 红花檵木LcvrCHS1基因的克隆
*为终止密码子
图2 红花檵木LcvrCHS1基因序列及推导的氨基酸序列
M 1 M 1 M 1 M 1 M 1
1000 bp
750 bp
1000 bp
750 bp
1000 bp
750 bp
1000 bp
750 bp 1000 bp
750 bp
a b c d e
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许 威等：红花檵木CHS基因的克隆与序列分析
GenBank 已登录的同样来源的核桃 CHS 序列
(X94995.1)，山 茶 属 植 物 CHS 序 列 (JQ247184.1、
D26593.1、HQ269804.1、JN944573.1)同源性达 83%，与
其 他 科 植 物 CHS 序 列（ 绣 球 花 AB011467.1、
AF456448.1，葡萄AB066274.1，桃 JN391444.1，马铃薯
HQ659493.1、U47740.1，甘草 HQ840675.1，领春木属
DQ366586.1）CHS序列同源性也达到80%以上，可以初
步说明LcvrCHS1是红花檵木中的查尔酮合成酶基因。
将红花檵木CHS基因编码区核苷酸序列翻译成
氨基酸序列，利用NCBI中的BLASTp进行氨基酸序
列 比 对 ，结 果 见 图 3，从 中 发 现 其 与 山 茶 属
(BAI66465.1、AFE56210.1、AFC37242.1、AAO13091.1)，
葡萄 (AEP17003.1、AEP17004.1)，鳄梨 (ABY58207.1、
ACA65192.1、ACA65227.1)，西洋梨(AAX16494.1)，沙
梨(BAA22045.1)，映山红(CAC88858.1)的CHS基因编
码的氨基酸序列同样具有高度同源性,同源性高达
98%，并且具有CHS家族的全部保守序列。由此，可
以进一步确定该基因为红花檵木CHS基因。
图3 红花檵木LcvrCHS1编码的氨基酸序列在NCBI中的BLASTp比对结果
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3 结论与讨论
CHS 的生物活性最早在欧芹 (Petroselinum
hortense)[9]中发现，之后陆续从苔藓、蕨类、裸子植物和
一些被子植物中克隆出来[6-8,10-12]。这些研究表明CHS
基因是一个多基因家族，一般的植物中有 8~10个成
员，CHS编码区有很高的保守性。本研究从红花檵木
幼叶 cDNA中扩增得到的LcvrCHS1序列包含了活性
位点、催化位点等保守性位点，其编码的氨基酸序列，
在NCBI中的BLASTp氨基酸序列比对中，与山茶属、
梨属、杜鹃花属、葡萄、鳄梨CHS基因编码的氨基酸序
列具有高达98%的高度同源性，再次验证了植物CHS
家族的高度保守性。
查尔酮合酶(chalcone synthase，CHS)是进入类黄
酮和花色素苷次生代谢的第 1个关键酶[5]。CHS基因
的沉默、超表达或者基因突变都将直接或间接影响到
该过程，从而影响整个类黄酮和花色素苷的总产量。
但CHS基因家族中不同成员的表达模式不尽相同，
其表达具有器官特异性,有些在营养器官中表达，有
些则在生殖器官中表达，它们可能与器官形态建成、
功能分化有着一定的联系，还受外界环境因素的影响
[6,13-15]。查尔酮合成酶是生物类黄酮合成的关键限速
酶，很多植物的CHS基因已经被克隆，但是有关该基
因的研究大多是从改变花色方向出发的，而对其在彩
叶植物叶色形成过程中的克隆、表达及其对彩叶植物
叶色调控的研究仍然是一个尚待深入的空白 领域。
本研究利用RT-PCR技术，从红花檵木幼的叶克
隆到一个查尔酮合成酶基因 LcvrCHS1，GenBank
Blast分析发现它是首次在红花檵木中被克隆的。夏
季高温状态下，红花檵木叶色出现返青现象，影响商品
性。LcvrCHS1作为进入类黄酮和花色素苷次生代谢
的第一个关键酶，据此推测LcvrCHS1可能参与红花
檵木夏季叶色返青的形成。至于其基因的表达特性如
何，受哪些调控基因和环境因子调控来影响红花檵木
的叶片呈色，还有待进一步研究。
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