全 文 ：第 29 卷　第 1 期　 经 济 林 研 究　 　 Vol.29　No.1
　2011 年 3 月 Nonwood　Forest　Research 　Mar.2011
红花檵木花叶芽变的表型分析与 RSAP 分析鉴定
李炎林1 , 2 ,熊兴耀3 ,于晓英1 ,刘明月1 , 2 ,朱杰辉1 ,黄　睿1 ,李　达1
(1.湖南省马铃薯工程技术研究中心 ,湖南 长沙 410128;2.湖南农业大学 园艺园林学院 ,湖南 长沙 410128;
3.湖南省作物种质创新与资源利用重点实验室 ,湖南 长沙 410128)
摘　要:　为从表型和分子水平上区分红花檵木芽变类型与普通类型 , 以“密枝玫红”及其 3 份花叶芽变为材料 ,
在分析其表型特征和观察物候期的基础上 ,结合限制性位点扩增多态性技术 , 对其遗传稳定性进行了初步研究。
结果表明:“密枝玫红”花叶芽变与母株的主要表型差异表现在叶片长度和枝梢长度方面 ,其它表型特征差异不显
著 , 3 份花叶芽变的主要物候期均早于母株红花檵木;4份材料的组织浸提液经黄豆 、黄瓜 、辣椒 、番茄和红花檵木
生物接种试验检测无病毒感染症状 ,其扦插苗后代表型稳定;从 45 对引物组合中筛选了 13 对引物进行 PCR扩
增 ,共产生了 1 174 条带 ,在芽变单株及其母株之间产生了 146条差异条带 , 条带主要集中在 100～ 2 000 bp 之间;
“密枝玫红”花叶芽变是一类不同于母株的芽变新种质。
关键词:　红花檵木;花叶芽变;遗传;限制性位点扩增多态性;鉴定
中图分类号:　S722.3 文献标志码:　A 文章编号:　1003-8981(2011)01-0008-07
Phenotypic and RSAP analysis on flower leaf sports in
Loropetalum Chinense var.rubrum
LI Yan-lin1 ,2 , XIONG Xing-yao3 , YU Xiao-ying1 , LIU Ming-yue1 ,2 , ZH U Jie-hui1 , HUANG Rui1 , LI Da1
(1.H unan Provincia l Eng ineering Research Center fo r Potatoe s , Chang sha 410128 , H unan , China;
2.Provincial Key Lab.of Crop Germplasm Innovation and U tilization , Chang sha 410128 , H unan , China;
3.Colleg e of H or ticulture and Landscape , Hunan Ag ricultural Univ ersity , Chang sha 410128 , Hunan , China)
Abstract:In order to distinguish leaf spor t and common plants in Loropetalum Chinense var.rubrum , taking three
flow er leaf spo rts and its mo ther plant “Mizhi Meihong” as materials , through analyzing pheno typic traits and ob-
serv ing phenophases , genetic stability w as studied by re st riction site amplifica tion po lymorphism.The results indi-
cated tha t the re was no significant difference among four ma te rials on the observed pheno typic traits e xcept fo r
leaves and branch leng ths , and the main phenophases of three leaf spo rts were ear lie r than its mother plant.It had
no virus affected symptom on Glycine max , Cucumis sativus L., Capsicum annuum L , Solanum lycopersicum ,
and L.Chinense va r.rubrum which inoculated with the crude sap from tissues in L.chinense var.rubrum , and
phenotype in off spring of the four ma te rials w as stable.Thir teen pairs o f primers w ere adopted f rom 45 pair s of
primer s in RSAP analysis , and 1 174 clear bands we re detected.There w ere 146 obviously different bands betw een
leaf spo r ts and its mother plant , and the molecula r mass range o f the polymo rphic fragments w ere mainly 100～ 2
000 bp.The flower leaf spo r ts o f “Mizhi Meihong” w ere some new germpla sms different from its mo ther plant.
Key words:Loropetalum Chinense var.rubrum;flower leaf spo rt;genetic;re st riction site amplification po lymor-
phism (RSAP);identifica tion
　　收稿日期:2010-11-12
　　基金项目:国家自然科学基金项目(31071826);湖南省自然基金项目(04JJ3024);湖南省教育厅省高等学校产业化培育项目(07CY001)。
　　作者简介:李炎林(1984-),男 ,湖南常德人。研究实习员 ,研究方向为植物资源与利用。 E-mail:ly l843@163.com。
　　通讯作者:于晓英(1968-),女 ,湖南绥宁人。教授,博士研究生导师 ,研究方向:观赏植物种质资源与生物技术。
E-mail:yuxiaoying1578@hunau.net 。
DOI :10.14067/j.cnki .1003-8981.2011.01.024
　　红花檵木 Loropetalum chinense va r.rubrum
又称红桎木 、红檵木 ,系金缕梅科 Hamam-elidaceae
檵木属常绿灌木或小乔木[ 1] 。红花檵木是湖南野
生乡土资源 ,零星分布于湖南浏阳 、平江 、醴陵和江
西萍乡上栗区湘赣交界处罗霄山脉海拔 100 ～
400 m的常绿阔叶林地带[ 1-2] 。从发现红花檵木至
今 ,其引种繁殖已经发展到 90多个县市 ,栽培面积
达到 3 000 hm 2[ 3] 。红花檵木源自檵木的芽变 ,繁
殖方式主要以扦插繁殖为主[ 4] ;侯伯鑫等将其划分
为 3大类 15个类型 41个品种 ,其花红 、叶红 ,色彩
绚丽 ,1 a 花期 3 ～ 4次 ,生态适应性强 ,耐修剪 ,繁
殖速度快 ,栽培管理容易 ,可广泛用于色篱 、色雕 、
模纹花坛 、灌木球 、盆景 、桩景等的制作[ 3] 。
芽变是体细胞突变的一种 ,通常发生在遗传背
景复杂的多年生植物中。花叶芽变属于芽变的一
个类型 ,是观赏植物中的一个重要观赏类型 ,它可
由形态解剖结构 、生理生化特性 、基因表达差异 、病
毒以及环境因子等影响所形成。由于饰变因素的
存在 ,需要对芽变材料进行鉴定 。目前 ,对植物的
芽变鉴定已由传统经典的形态学鉴定发展到分子
水平 , 用于芽变鉴定的分子标记方法主要有
RAPD 、 SSR 、 ISSR 、 A FLP 、 SRAP 、 AFLPTM
等[ 5-10] 。与其它分子标记技术相比 ,限制性位点扩
增多态性(Restriction Site Amplif ication Po lymor-
phism , RSAP)技术重复性好 ,适用性广泛 ,是一种
操作简便 、产率中等 、稳定可靠的 DNA 标记技术 ,
其已在水稻 Oryza sat iva L.、苦瓜 Momordica
charantia Linn.、 辣 椒 Capsicum annuum
L.[ 11-12] 、紫菜 Porphy ra haitanensis[ 13] 和大白菜
Brassica rapa pekinensis[ 14] 中得到验证。
本研究中以“密枝玫红”及其 3份花叶芽变材
料为试验材料 ,在对其第 2代短枝扦插繁殖后代表
型观察的基础上 ,以发育成熟的叶片为材料提取
DNA ,建立基于 RSAP 分子标记的技术体系 ,结合
RSAP 标记图谱分析红花檵木“密枝玫红”花叶芽
变的遗传稳定性 ,旨在从表型分析和分子水平上将
其芽变类型与普通类型区分开来。
1　材料与方法
1.1　试验材料
2006年 9月笔者在湖南农业大学蔬菜基地和
湖南省肿瘤医院的道路绿化材料中发现了 2株红
花檵木“密枝玫红”的花叶变异枝条 ,结合扦插繁殖
分离得到其 3种花叶变异类型 ,其中“密枝玫红”花
叶芽变 1号和 2 号来自湖南农业大学蔬菜基地的
同一母株 。“密枝玫红”花叶变异 1 号:幼叶浅红色
间淡黄褐色 ,成熟叶片墨绿色 ,花朵浅粉红色;“密
枝玫红”花叶芽变 2 号:幼叶草绿色间红色斑块
(点),成熟叶片墨绿色间红色斑块 ,花朵乳白色嵌
粉红色;“密枝玫红”花叶变异 3号:幼叶紫红色间
草绿色斑块 ,成熟叶片墨绿色间紫黑色斑点 ,花朵
紫红色。材料的编号如下:I“密枝玫红”花叶变异 1
号第 2 代扦插苗;II“密枝玫红”花叶变异 2号第 2
代扦插苗;III“密枝玫红”花叶芽变 3 号第 2代扦插
苗。对照样品是母株上的普通枝条(CK)。2008年
5月从室外采集成熟叶片立即提取 DNA 。
供引物筛选的试验材料还有檵木 1号[ 15] 及红
花檵木“长叶紫红” ,试验处理同前 。
1.2 　试验方法
1.2 .1　表型分析
(1)植物学性状的观察　在春季生长时期观察
红花檵木 、红花檵木花叶芽变的植物学性状 ,性状
描述参照文献[ 16] 。观察调查指标包括:叶片长 、
叶片宽 、春梢长度和春梢节间长。
(2)生物学物候期特性的观察　红花檵木年内
1 ～ 4次萌芽 、开花 ,因类型或者品种不同而异 。因
此 ,本试验中选取春季时期对红花檵木 、红花檵木
花叶芽变和檵木的生物学物候期特性进行观察 ,描
述标准参照文献[ 17] ,主要观测指标:萌芽期(顶芽
鳞片松动为标准);现蕾期;始花期(5%的花蕾开
放);盛花期(70%的花蕾开放)。
(3)气孔形态的观察　在晴天上午 10:00左右
选取成熟叶片 3 ～ 4片 ,用薄膜包好放进干燥箱中
带回实验室。选取干净的玻片 ,在中央滴 1滴蒸馏
水 ,用镊子撕取下表皮 ,在 Motic Images Advanced
3.2数码成像显微镜(目镜 10×20 ,物镜 40×0.17)
下观察 ,并拍照保存 。
气孔直径 、大小 、面积等参数的观测用上述显
微镜自带图像软件测量 ,每个数据测量 3次 ,用 Ex-
cel 2003软件整理数据和SPSS 13.0软件进行数据
方差分析等。
1.2 .2　表型遗传稳定性的初步分析
(1)取红花檵木“密枝玫红”及其 3 份花叶芽变
材料的幼嫩组织 10 g ,用灭过菌的研钵加 10 倍的
9第 29 卷　　　　 　经 济 林 研 究
接种用 0.01 mol ·L -1磷酸缓冲液(pH 7.0)充分
研磨后 ,再用台式冷冻离心机于 4 ℃, 5 000 g 条件
下离心 2 m in ,并取上清液采用注射器茎尖注射接
种黄豆 Glycine max 、黄瓜 Cucumis sativus L.、辣
椒 C.annuum L.、番茄 Solanum lycopersicum 和
红花檵木上 ,试验 15 d 后观察叶片有无病发症状;
同时 ,以马铃薯 PVA病毒为阳性对照 ,用上述组织
浸提液进行透射电镜观察 。
(2)取红花檵木及其花叶芽变的具有典型形状
的春梢半木质化的枝条 ,修剪成 5 ～ 10 cm 的枝条
在新鲜的黄心土上进行扦插 ,并用薄膜覆盖。成苗
后移栽 ,扦插条件和栽培条件均一致。修剪第 1代
扦插苗的半木质化的秋梢 ,扦插第 2 代扦插苗 ,方
法同前。扦插移栽成活后统计 2代扦插苗的保持
稳定遗传的红花檵木花叶芽变的植株数目。
稳定遗传比率 =(稳定遗传的花叶植物总数/
花叶植物扦插苗总数)×100%。
1.2.3　RSA P 分子标记技术的鉴定
(1)DNA提取　DNA 提取步骤参照文献[ 18]
稍做改进 ,采用改良的 CTAB 法 ,将第 1 次的抽提
液“氯仿+异戊醇(24︰ 1)”改为“氯仿+氯仿+异
戊醇(25︰ 24 ︰ 1)” 。0.8%的琼脂糖(含溴化乙
锭)电泳检测后 ,取 2 mL 样液与 98 mL 无菌水混
合成 100 mL 体系 ,在 eppendorf Biophoto-me ter上
测定 DNA 的 OD260/OD 280的值与质量浓度 ,调节质
量浓度至 50 ng ·μL-1 , -20 ℃保存备用 。
(2)RSA P引物筛选　RSAP-PCR扩增程序以
及聚丙烯酰胺凝胶电泳的检测方法参照文献[ 19] 。
以檵木 1 号 、红花檵木“长叶紫红”和红花檵木“密
枝紫红”为模板来进行引物组合的筛选 。
(3)RSAP 引物序列 　引物序列参考杜晓华
等[ 2 , 11] RSA P技术体系 ,由上海英俊公司合成 ,其具
体序列情况如表 1所示。
(4)数据分析　聚丙烯酰胺凝胶电泳显影观察
方法同(2), 图片结果扫描保存结果 , 用 Cro ss
Checker 从凝胶照片中提取数据 ,再用 Exel 2003
转换成 0 、1 数据 。用 Ntsy s 2.10软件采用戴尔相
似系数(Dice SimplLarity M easure)算法得到红花
檵木“密枝玫红”及其 3份变异材料的相似系数和
遗传距离 。
多态性百分率 P=(特征谱带/总谱带数)×100%。
2　结果与分析
2.1 　红花檵木及花叶芽变表型特征与物候期差异
观赏植物的枝梢和叶片特性是其重要的观赏
特征 。“密枝玫红”及其 3 份花叶芽变材料的枝条
特征和叶片特征差异见表 2 ,其中叶片宽度和枝梢
节间长度之间 4份材料间无显著差异;“密枝玫红”
花叶芽变 2号叶片长度最小 ,与其它 3 者之间差异
显著 ,是花叶芽变 3号叶片长度的 0.77 倍;花叶芽
变 1号与 2号之间春梢长度二者之间差异不显著 ,
而二者与其它 2份材料之间差异显著 。
表 1　RSAP 引物及对应的限制性位点
Table 1　RSAP primers and correspondence restriction sites
引物
P rime r
引物序列 P rime r sequence
限制性位点
Rest riction
site
限制性内切酶
Rest riction
enzymes
R1 5′-ATTACAACGAG TGGA TCC-3′ GGATCC BamH I
R2 5′-CACAGCACCCACTTTAAA-3′ TTTAAA D raⅠ
R3 5′-GACTGCGTACATGAATTC-3′ GAATTC EcoRⅠ
R4 5′-TATCTGGTGAGGGATATC-3′ GA TA TC EcoRⅤ
R5 5′-TTGGGA TA TCGGAAGCTT-3′ AAGCTT H indIII
R6 5′-ATTTCAGCACCCACGA TC-3′ GA TC MboⅠ
R7 5′-ATAGTCCTGAGCGG TTAA-3′ TTAA MseⅠ
R8 5′-A TAA CTGTG TACCTGCAG-3′ TGCAG PstⅠ
R9 5′-GTACATG CA TTACTGCGA-3′ TGCGA T aqⅠ
R10 5′-A TTGGACTGG TCTCTAGA-3′ TCTAGA XbaⅠ
表 2　红花檵木花叶芽变与母株枝 、叶形态比较
Table 2　Comparison of characteristics of branch and leaf between the flower leaf sports and mother plants in L.
chinense var.rubrum
材料
Materials
叶片长
Leaf length /(cm)
叶片宽
Length width /(cm)
春梢长
Sprin g shoot length / (cm)
节间长
Internode length /(cm)
CK 3.43±0.38 b 2.40±0.38 a 8.40±0.38 b 1.12±0.38 a
I 3.43±0.15 b 2.38±0.15 a 6.76±0.15 a 0.41±0.15 a
II 2.80±0.38 a 1.97±0.38 a 6.38±0.38 a 0.68±0.38 a
III 3.60±0.28 b 2.25±0.28 a 8.14±0.28 b 1.08±0.28 a
10 李炎林 , 等:红花檵木花叶芽变的表型分析与 RSAP分析鉴定　 　第 1 期
　　2008年 2月 10日 ～ 2009年 3月 31日观察统
计 4份材料的主要物候期 。4 份材料的萌芽期 、现
蕾期 、始花期和盛花期时间均存在差异(见表 3),不
同的年份各个主要物候期时间不一致 ,但总体上来
说 3份芽变材料的各个观察物候期均早于母株 ,其
中花叶芽变 2号和 3号材料物候期相当 ,且二者略
微早于花叶芽变 1号。“密枝玫红”及其 3 份花叶
芽变 4者之间气孔纵径 、气孔横径 、气孔面积和气
孔周长之间存在差异 ,但差异均不显著(见表 4)。
表 3　红花檵木花叶芽变与其母株主要物候期
Table 3　Main phenophases of the flower leaf sports and mother plants in L.chinense var.rubrum
材料
Materials
萌芽期
Germinating s tage
现蕾期
Squaring stage
始花期
Ini tial fl owering stage
盛花期
Full f lowering stage
CK 09/ 2～ 19/ 2 26/ 2～ 08/ 3 02/ 3～ 12/ 3 20/3～ 02/ 4
I 08/ 2～ 17/ 2 26/ 2～ 08/ 3 01/ 3～ 10/ 3 18/3～ 31/ 3
II 06/ 2～ 16/ 2 24/ 2～ 15/ 3 28/ 2～ 09/ 3 17/3～ 30/ 3
III 07/ 2～ 14/ 2 24/ 2～ 13/ 3 27/ 2～ 07/ 3 17/3～ 31/ 3
表 4　红花檵木花叶芽变单株与其母株叶片气孔差异比较
Table 4　Comparison of stomas variance between the flower leaf sports and mother plants in L.chinense var.rubrum
材料
Materials
气孔纵径
S tom a vert ical diam eter
/μm
气孔横径
Stoma t ransverse diameter
/μm
气孔面积
S tom a area /μm2
气孔周长
Stoma circum feren ce
/μm
CK 0.35±0.10 a 0.26±0.14 a 0.12±0.03 a 1.32±0.11 a
I 0.41±0.11 a 0.27±0.14 a 0.14±0.04 a 1.39±0.10 a
II 0.39±0.10 a 0.31±0.17 a 0.19±0.05 a 1.53±0.13 a
III 0.34±0.11 a 0.23±0.12 a 0.12±0.00 a 1.28±0.08 a
2.2　红花檵木及花叶芽变表型遗传稳定性
“密枝玫红”及其 3 份花叶芽变材料经过指示
植物黄豆 、黄瓜 、辣椒 、番茄和红花檵木茎尖注射接
种 ,无病毒感染症状发生;红花檵木和其花叶芽变
所有制备样品经电镜观察没有看到任何形状的病
毒颗粒 ,而马铃薯含 PVX病毒的阳性对照制备样
品能够看到明显的形态为长杆状的颗粒 , 长
515 nm ,宽 13.6 nm[ 20] ;其短枝扦插繁殖结果如表
5所示 ,在第 1 代扦插苗中 , “密枝玫红”花叶芽变
2号材料中有 8.33 %的后代出现了表型性状的分
离 ,出现叶片完全变绿的现象;在第 2代扦插苗中
红花檵木及其 3份花叶芽变材料的扦插苗后代均
无表型分离现象 。至于其第 3 代 、第 4代等不同代
数的扦插苗是否稳定遗传 ,还有待进一步观察 。
2.3　红花檵木 DNA提取及引物筛选
经过改良的 CTAB 法提取的红花檵木及其花
叶芽变和檵木成熟叶片 DNA 电泳图谱点样孔清
晰 、无蛋白质和多糖 、主带清晰 、无降解 、无拖尾和
无 RNA 污染(见图 1), OD 值范围在 1.70 ～ 1.88
之间 ,适合于 RSAP 体系的后续操作。
10条 RSAP 引物两两组合成 45 对引物 ,以红
花檵木“密枝玫红” 、“长叶紫红”和檵木 1 号为模
板 ,通过 3次重复试验 ,共筛选出 13 对多态性高的
引物组合 ,能很明显的将 3份供试材料从分子水平
上区分开 。
表 5　红花檵木及其花叶芽变扦插繁殖遗传稳定性
Table 5　Stable inheritance of L.chinense var.rubrum
and its flower leaf sports in cutting propagation
材料
Materials
稳定遗传比率 Ratio of s table in heri tance / %
第 1代扦插苗
T he f irst cut t ing
seedlings
第 2代扦插苗
The secon d cu t ting
seedlings
CK 100.00 100.00
I 100.00 100.00
II 91.67 100.00
III 100.00 100.00
2.4 　红花檵木及其花叶芽变 RSAP 分析
利用上述 13对引物组合对红花檵木“密枝玫
红”及其 3份花叶芽变材料进行 RSAP 扩增 ,共扩
增出条带数 1 174条 ,片段长度在 100 ～ 2 000 bp ,
其中母株与 3份芽变材料之间多态性条带数为 146
条 ,平均多态性比率为 11.06%,扩增出总位点数为
330个(见表 6)。母株与芽变单株以及芽变单株之
间的差异见图 2 。每对引物扩增出来的差异条带不
一致 ,其中 R1R6 扩增出来的多态性条带最多 ,母株
与 3份芽变材料之间的差异条带有 30条 ,多态性
比率为 17.86%;而 R6R10最少 ,仅 4 条多态性条
带 ,多态性比率为 4.76%。
11第 29 卷　　　　 　经 济 林 研 究
　　M :Mark;1和 2:“密枝玫红” ;3和 4:“密枝玫红”花叶芽变 1号;5和 6:“密枝玫红”花叶芽变 2号;7和 8:“密枝玫
红”花叶芽变 3号;9和 10:“长叶紫红” ;11和 12:檵木 1号。
M :Mark;1 and 2:“Mizhi Meih on g”;3 and 4:Flow er leaf sport No.1 of “ Mizhi Meihong” ;5 and 6:Flow er leaf
sport No.2 of “Mizhi M eih ong”;7 and 8:Flow er leaf sport No.3 of “Mizhi Meihong” ;9 and 10:“C han gy e Zihong” ;11
and 12:Lorop etalum Ch inense No.1.
图 1　改良的 CT AB 法提取的 6 份材料 DNA 电泳结果
Fig.1　Electrophoresis result of the six DNA materials extracted by modified CTAB method
表 6　13 对引物组合出现的 RSAP 条带数及其多态性分析
Table 6　Number of RSAP bands amplified by 13 pairs of primer combinations and polymorphic analysis
引物组合
Primer
com bination
扩增条带数 Am plifi ed bands
CK I II III
总条带数
T otal ban ds
总位点数
Total loci
多态性条总带数
Total polym orphic
bands
多态性比率
Rat io of
polymorphism / %
R1R3 23 24 21 17 85 24 11 11.46
R1R5 20 20 22 21 83 23 9 9.78
R1R6 41 35 37 25 138 42 30 17.86
R1R7 22 25 26 19 92 26 12 11.54
R3R4 30 31 31 29 121 32 7 5.47
R4R6 23 32 27 28 110 33 22 16.67
R4R10 17 13 16 17 63 17 5 7.35
R5R7 16 14 16 14 60 17 8 11.76
R5R10 25 21 23 23 92 26 12 11.54
R6R7 30 25 29 26 110 30 10 8.33
R6R9 21 20 21 21 83 22 5 5.68
R6R10 21 21 19 19 80 21 4 4.76
R8R9 13 15 17 12 57 17 11 16.18
M :Mark;1:“密枝玫红” ;2:“密枝玫红”花叶芽变 1号;3:“密枝玫红”花叶芽变 2号;4:“密枝玫红”花叶芽变 3号。
M :Mark;1:“Mizhi Meih on g” ;2:Flower leaf sport No.1 of “ Mizhi Meihong” ;3:Flow er leaf sport No.2 of “Mizhi
Meihong” ;4:Flow er leaf sport No.3 of “Mizhi Meih ong” .
图 2　部分引物对对 4 份材料扩增的电泳结果
Fig.2　Electrophoresis result of the four DNA materials amplified by some primer combinations
12 李炎林 , 等:红花檵木花叶芽变的表型分析与 RSAP分析鉴定　 　第 1 期
　　根据 Nei和 Li (1979)的遗传相似系数的计算
方法 ,红花檵木“密枝玫红”与红花檵木“密枝玫红”
花叶芽变 1 号相似系数为 0.919 7 ,遗传距离为
0.161 7;其与“密枝玫红”花叶芽变 2号相似系数为
0.919 3 ,遗传距离为 0.165 5;与“密枝玫红”花叶芽
变 3号相似系数为 0.876 1 ,遗传距离为 0.253 6 。
不同的芽变单株之间 1号与 2号 、1号与 3号 、2号
与 3号之间遗传相似系数分别为 0.925 1 、0.874 8
和 0.878 5(见表 7)。
表 7　供试材料 RSAP 分析的 Dice相似系数
Table 7 　Dice similarity coefficients between the
materials on RSAP analysis
C1 C2 C3 C4
C1 1.000 0
C2 0.919 7 1.000 0
C3 0.919 3 0.925 1 1.000 0
C4 0.876 1 0.874 8 0.878 5 1.000 0
　　 　C1:“密枝玫红”;C2:“密枝玫红”花叶芽变 1号;C3:“密枝玫红”花叶
芽变 2号;C4:“密枝玫红”花叶芽变 3号。
C1:“Mizhi Meihong” , C2:Flower leaf spo rt N o.1of “Mizhi Meihong”;
C3:F lower leaf spo rt No.2 o f “M izhi Meihong”;C4:F lower leaf sport N o.3
of “Mizhi Meihong”.
3　讨　论
芽变与传统的杂交育种相比有不可替代的优
势 ,具有育种周期短 ,育种进程快 ,工作量小 ,节省
人力 、物力 、财力等特性[ 21] 。芽变遗传鉴定可以从
多个层次进行:一是 ,多年观察变异性状在不同环
境中的表型遗传稳定性;二是 ,进行生理生化鉴定
或者同工酶谱鉴定;三是 ,染色体倍性 、数量及结构
变异;四是 ,利用各种分子标记手段直接分析其遗
传差异[ 6] 。红花檵木为檵木的变种 ,其主要繁殖方
式为扦插繁殖[ 4] ,在现有红花檵木已登录或登记品
种中 ,大多数均为芽变品种[ 3] ,因此红花檵木的繁
育特性决定了芽变选种在其新品种选育中占有十
分重要的地位。本研究中发现 4份材料之间叶片
宽度 、春梢节间长度 、气孔纵径 、气孔横径 、气孔面
积 、气孔周长无显著差异 ,而叶片长度差异显著;4
份材料之间主要物候期存在差异 ,且 3份芽变材料
的萌芽期 、现蕾期 、始花期和盛花期均早于母株 ,这
说明“密枝玫红”花叶芽变是一类观赏期提前的观
花观叶变异类型;3份花叶芽变材料及母株的组织
浸提液通过指示植物接种没有观察到病毒侵染症
状 ,通过透射电镜没有观察到形态清晰的病毒颗
粒[ 20] ;结合对其叶片叶绿素类物质及其花色素苷含
量的定量分析 ,发现花色素苷物质的不对称分布和
含量株系差异是导致叶片呈现花叶现象的最直接
原因[ 20] ;通过 2代扦插繁殖试验 ,结果表明 ,红花檵
木的花叶芽变是一类可以通过扦插繁殖保持花叶
特征的变异类型。
分子标记技术是鉴定芽变的重要手段 ,具有快
捷而且可靠的特点 。肖璇等[ 22] 利用 RA PD技术鉴
别了“石硖”龙眼大果型桂花味芽变系 ,10条引物共
扩增出 99条带 ,多态性条带 13 条 ,多态性比率为
13.1%;性状优良的冰糖橙的芽变系与对照多态性
差异达 10.2%[ 23] ;刘广林利用 ISS R技术鉴定了野
生毛葡萄芽变单株 ,16个引物在芽变单株与母本之
间扩增出 243条带 ,多态性条带 43 条 ,多态性比率
占 20.3%,相似系数为 0.798 1[ 17] 。本研究中通过
13对 RSAP 引物组合的 PCR扩增 , 3份花叶芽变
材料与母株之间共扩增出长度在 100 ～ 2 000 bp 的
片段有 1 174条 ,其中多态性条带有 146条 ,多态性
比率平均为 11.06%;芽变单株与母株以及不同的
芽变单株之间的遗传相似系数和遗传距离不同 ,这
说明了花叶芽变不同单株的遗传物质发生了不同
的改变 ,而 146条差异片段可能与红花檵木及其花
叶芽变的叶片特征 、枝梢长度 、主要物候期及花朵
颜色的结构基因有关 , 或者染色体结构发生了变
异 ,也有可能是基因的位置效应[ 24] ,或调控这些结
构基因的转录因子发生了改变 ,要进一步地探明其
变异机制 ,还需要将差异片段回收克隆 ,测序 ,进行
DNA 分析比对后才能推测这些片段的功能 。
本研究中所用的试验材料红花檵木花叶芽变 1
号和花叶芽变 2号来自同一母株 ,而花叶芽变 3号
来自不同地理位置的同一品种的芽变枝条 ,这有可
能是造成花叶 1 号 、2号芽变单株与母株以及二者
之间的遗传相似系数均高于芽变 3号的原因 。这
说明不同环境因素可能导致同一品种不同的芽变
形式的出现 ,同时保持较高的遗传相似性。
“密枝玫红”花叶芽变是一类不同于母株的芽
变新种质 ,是一类有潜在利用价值的红花檵木新种
质资源 ,特别是“密枝玫红”花叶芽变 2 号花朵出现
明显的红色和乳白色的嵌合 ,有可能成为新的可以
推广应用的优良品种资源(现已通过湖南省林业厅
审批)。
13第 29 卷　　　　 　经 济 林 研 究
参考文献:
[ 1] 　祁承经 ,喻勋林.湖南种子植物总览[ M ] .长沙:湖南科学技术
出版社 , 2002:215.
[ 2] 　连芳青 ,雷先高.园林新秀———长红檵木[ J] .植物杂志 , 1996 ,
(5):24.
[ 3] 　侯伯鑫 ,童新旺 ,林　峰 ,等.红花檵木品种资源的研究[ J] .中
国野生植物资源 , 2002 ,(6):15-17.
[ 4] 　唐前瑞.红檵木遗传多样性及其叶色变化的生理生化研究
[ D] .湖南农业大学博士论文.2001.
[ 5] 　李元军 ,唐美玲 ,于　青 ,等.富士苹果 AFLP 体系的优化及其
在鉴定早熟芽变中的应用[ J] .园艺学报 , 2009 , 36(3):
327-332.
[ 6] 　谢吉容 ,梁国鲁 ,李树发 ,等.月季`金银岛 的红花芽变品系的
分析鉴定[ J] .北方园艺 , 2007 , (11):186-189.
[ 7] 　Amanda R , Walker E L , S imon P , et al.Tw o new grape cu l-
tivars , bud sport s of Cab ernet Sauvignon b earing pale-col-
ou red berries , are th e resu lt of deletion of tw o regulatory
genes of the berry colou r locu s[ J] .Plant Mol Biol , 2006 , 62:
623-635.
[ 8] 　Han XY , Wang LS , Liu ZA , et a l.Characterizat ion of se-
quence-related amplif ied polymorphism markers analysi s of
tree peony bud spor ts[ J] .Sci H ortic.2008 , 115:261-267.
[ 9] 　Yamamoto T , M ochida K , Imai T , et al.Parentage Analysi s
in Japan ese Peaches Using S SR Markers[ J] .Breeding S ci ,
2003 , 53:35-40.
[ 10] 　黄玉辉 ,陈　涛, 吴晓伟 ,等.甘蔗突变体 AFLP 分析[ J] .西
南农业学报 , 2007 , 20 (4):727-731.
[ 11] 　杜晓华 ,王得元 ,巩振辉.一种新型 DNA 标记技术-限制性
位点扩增多态性(RSAP)的建立与优化[ J] .西北农林科技大
学学报:自然科学版 , 2006 , 34 (9):45-49 , 53.
[ 12] 　杜晓华 , 王得元 ,巩振辉.基于 RSAP 和 SSR的辣椒优良自
交系间遗传距离的估计与比较[ J] .西北农林科技大学学报:
自然科学版 , 2007 , 35(7):97-102.
[ 13] 　乔利仙 ,翁曼丽 ,孔凡娜 ,等.RSAP 标记技术在紫菜遗传多
样性检测及种质鉴定中的应用 [ J] .中国海洋大学学报 ,
2007 , 37(6):951-95.
[ 14] 　张明科 ,张鲁刚, 巩振辉 ,等.大白菜分子连锁图谱的构建与
分析[ J] .分子植物育种 , 2009 , 7(1):82-88.
[ 15] 　李炎林.红花檵木花叶芽变的遗传和生物学特性研究[ D] .
长沙:湖南农业大学 , 2009.
[ 16] 　黄程前 ,胡果生 ,刘　伟.红花檵木生物学特性周年观测研究
[ J] .湖南林业科技 , 2004 , 31(3):15-17.
[ 17] 　刘广林.野生毛葡萄芽变单株的遗传和细胞生物学基础研究
[ D] .南宁:广西大学 , 2007.
[ 18] 　李　达 ,熊兴耀 ,于晓英 ,等.红花檵木 SRAP 反应体系的建
立及优化 [ J] .中南林业科技大学学报 , 2008 , 25(8) :
22-27.
[ 19] 　李炎林 ,熊兴耀 ,于晓英 , 等.红花檵木 RSAP-PCR反应体系
的建立与优化[ J] .湖南农业大学学报:自然科学版 , 2009 ,
35(1):65-68 , 75.
[ 20] 　李炎林 ,于晓英, 熊兴耀 ,等.红花檵木花叶芽变生物学特性
研究[ J] .林业科学 , 2010 ,46(7):75-81.
[ 21] 　伊　凯 ,闫忠业, 刘　志 ,等.苹果芽变选种鉴定及应用研究
[ J] .果树学报 , 2006 , 23(5):745-749.
[ 22] 　肖　璇 ,孙　敏 ,王心燕 ,等 .`石硖 龙眼大果型桂花味芽变
系的 RAPD 分析鉴定 [ J ] .园艺学报 , 2005 , 32(4):
684-687.
[ 23] 　曾柏全 ,甘　霖 ,熊兴耀 ,等.冰糖橙优良芽变的 AFLP 分析
[ J] .江西农业大学学报 , 2006 , 28(2):222-224.
[ 24] 　Doodem an M , Boersm a E A , Koomen W , et a l.Genetic a-
naly sis of in stabili ty in Petunia hyb rida[ J] .Theor Appl Gen-
et , 1984 , 67:345-355.
[本文编校:闻　丽]
14 李炎林 , 等:红花檵木花叶芽变的表型分析与 RSAP分析鉴定　 　第 1 期