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红花檵木RSAP-PCR反应体系的建立与优化



全 文 :
第 35卷第 1期 湖南农业大学学报(自然科学版) Vol.35 No.1
2009 年 2月 Journal of Hunan Agricultural University (Natural Sciences) Oct.2009
文章编号:1007-1032(2009)01-0065-04
红花檵木 RSAP-PCR 反应体系的建立与优化
李炎林,熊兴耀,于晓英*,陈海霞,李艳香,李 达
(湖南农业大学 园艺园林学院,湖南 长沙 410128)
摘 要:分别采用单因子试验和正交设计试验对影响红花檵木 RSAP-PCR 反应体系的 5 个因素(DNA 模板量、
Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq酶量)在 4个水平上进行优化.结果表明,2种方法得到的影响因素的最
优水平存在差异,通过综合比较与分析,选取红花檵木 RSAP-PCR最优反应体系为:在 25 µL的反应体系中,模
板量 70 ng, Mg2+浓度 1.50 mmol/L,dNTPs浓度 0.25 mmol/L,引物浓度 0.20 mmol/L,Taq酶量 2.50 U.
关 键 词:红花檵木;RSAP-PCR;正交设计;单因子试验;梯度 PCR
中图分类号:S678 文献标识码:A

Establishment and optimization of RSAP-PCR reaction for Loropetalum chinese var. rubrum
LI Yan-lin, XIONG Xing-yao, YU Xiao-ying*, CHEN Hai-xia, LI Yan-xiang, LI Da
(College of Horticulture and Landscape,HNAU,Changsha 410128, China)
Abstract:Both a single-factor test and orthogonal-design test were conducted to optimize RSAP-PCR amplification
system on Loropetalum chinese var. rubrum, at four levels of five factors (concentration of DNA, Mg2+, dNTPs, and
primer, and contents of Taq DNA polymerase) respectively. The results showed that there were differences between the
two methods at suitable levels of factors, and a suitable RSAP-PCR reaction system was established, namely, 25 µL
reaction system containing 70 ng DNA template, 1.50 mmol/L Mg2+, 0.25 mmol/L dNTPs, 0.20 mmol/L primer, 2.50 U
Taq DNA polymerase, through comprehensive comparison and analysis.
Key words:Loropetalum chinese var. rubrum;RSAP-PCR;orthogonal design;single factor design;gradient PCR

红花檵木(Loropetalum chinese var. rubrum)因自
然突变产生了许多的突变类型,前人通过形态学[1-3]、
生理生化[4-7]、分子遗传学[8-11]等方面的研究,得出
红花檵木为檵木变种,并探讨了其叶色变化的生理
生化机制,对其部分种类的亲缘关系进行了划分,
但因资源收集有限,限制了对红花檵木种质资源的
全面有效鉴定.目前,红花檵木新品种选育主要靠
传统的育种手段.这样的育种周期长,劳力费时,
信息量少.分子标记辅助育种克服了传统育种的缺
点,成为植物良种选育的重要手段之一.限制性位
点扩增多态性(restriction site amplifi-cation polymor-
phism,RSAP)技术具有多态性高、稳定性好、不需
预先知道基因序列、仅需 1个简单的 PCR反应即可
实现对 DNA 限制性位点多态性进行检测的优点,
检测快速,产物特异性强,是对 RFLP技术的一种
简化,且其技术要求低,成本低[12-14],已被用于对
辣椒、水稻、苦瓜[9]和紫菜[10]等的研究.
DNA 模板量、Mg2+浓度、dNTPs 浓度、引物
浓度、Taq酶量等因素影响 PCR的扩增,因此在应
用 RSAP技术进行种质资源鉴定时,为保证结果的
准确,必须对反应体系进行优化.笔者在单因子试
验的基础上,通过正交设计试验对影响红花檵木
RSAP-PCR反应体系的 5个因素在 4个水平上进行
优化试验,建立 RSAP-PCR最佳反应体系,旨在为
红花檵木种质资源鉴定及种群遗传多样性研究等
提供分子水平上的借鉴与参考.
1 材料与方法
1.1 材 料
以湖南农业大学红花檵木资源圃的长叶玫红
收稿日期:2008-10-07
基金项目:湖南省自然科学基金项目(04JJ3024 );湖南
省教育厅项目(07CY001)
作者简介:李炎林(1984-),男,湖南常德人,硕士研究
生,主要从事观赏植物遗传育种研究;*通讯作者,(电
话)0731-4618744,(电子信箱)yuxiaoying1578@hunau.net.
DOI:10.13331/j.cnki.jhau.2009.01.019


66 湖南农业大学学报(自然科学版) 2009年 2月
(Loropetalum chinese var. rubrum ‘changyemeihong’)
一年生枝条上的成熟叶片为试材.
1.2 主要试剂及仪器
用于 RSAP-PCR 反应的 dNTP、Taq 酶、标准
分子质量(Marker)100 bp plus DNA Ladder均购自北
京鼎国生物技术有限责任公司.引物合成参照杜晓
华[9]的 RSAP引物序列,由北京英俊公司合成.PCR
反应在德国生产的 Biometa梯度 PCR仪上进行.
1.3 方 法
1.3.1 基因组 DNA 提取
试验于 2008 年 3 月在湖南农业大学天然产物
中心进行.采用改良的 Tris-HCl洗涤法[8]提取红花
檵木基因组 DNA,1%琼脂糖凝胶电泳检测, 用
Eppendorf 公司生产的 Bio Photometer 核酸检测
DNA浓度与纯度,并将其稀释至 50 ng/µL.
1.3.2 PCR 基本体系与扩增程序
基本体系 25 µL:模板量 20 ng,Mg2+浓度 2.50
mmol/L,dNTPs浓度 0.20 mmol/L,引物浓度 0.60
mmol/L,Taq酶量 1.50 U.扩增程序参考文献[9]的
RSAP-PCR扩增程序.引物为 R4:5′-TATCTGGTG-
AGGGATATC-3′;R5:5′-TTGG-GATATCGGAAGC-
TT -3′.
1.3.3 单因子试验
根据表 1中各影响因素的水平分别研究 5个因
素对 RSAP-PCR反应体系的影响.PCR产物用 2%
琼脂糖凝胶电泳检测,EB染色,Gene Genius公司
表 1 红花檵木 RSAP-PCR 反应中的影响因素水平
Table 1 Factors and levels of PCR reaction
水平 模板量
/ng
MgCl2浓度
/(mmol·L-1)
dNTPs浓度
/(mmol·L-1)
引物浓度
/(mmol·L-1)
Taq酶量
/U
1 0 0.00 0.00 0.00 0.00
2 10 0.50 0.05 0.10 0.50
3 20 1.00 0.10 0.20 1.00
4 30 1.50 0.15 0.30 1.50
5 40 2.00 0.20 0.40 2.00
6 50 2.50 0.25 0.50 2.50
7 60 3.00 0.30 0.60 3.00
8 70 3.50 0.35 0.70 3.50
9 80 4.00 0.40 0.80 4.00
10 90 4.50 0.45 0.90 4.50
11 100 5.00 0.50 1.00 5.00
的 Bio Imaging System成像.对结果进行直观分析
与评价.
1.3.4 RSAP-PCR 正交设计
根据单因子试验确定的可扩增范围,选用
L16(45)正交表(表 2)在 4个水平上试验,将表 2的 16
个试验处理重复 2次,进行扩增反应.扩增程序同
单因子试验.PCR扩增产物用 6%的变性聚丙烯酰
胺垂直电泳检测,染色显影程序参照文献[9].染
色显影后将胶片晾干,在 EPSON V2000 Photo彩
色图像扫描仪上扫描照片.对结果进行直观分析,
得到红花檵木 RSAP-PCR 反应各影响因素的最佳
水平.
表 2 RSAP-PCR 正交设计表
Table 2 Orthogonal design for RSAP-PCR system
水平 模板量
/ng
MgCl2浓度
/(mmol·L-1)
dNTPs浓度
/(mmol·L-1)
引物浓度
/(mmol·L-1)
Taq酶量
/U
1 40 1.00 0.15 0.20 1.00
2 40 1.50 0.20 0.30 1.50
3 40 2.00 0.25 0.40 2.00
4 40 2.50 0.30 0.50 2.50
5 50 1.00 0.20 0.40 2.50
6 50 1.50 0.15 0.50 2.00
7 50 2.00 0.30 0.20 1.50
8 50 2.50 0.25 0.30 1.00
9 60 1.00 0.25 0.50 1.50
10 60 1.50 0.30 0.40 1.00
11 60 2.00 0.15 0.30 2.50
12 60 2.50 0.20 0.20 2.00
13 70 1.00 0.30 0.30 2.00
14 70 1.50 0.25 0.20 2.50
15 70 2.00 0.20 0.50 1.00
16 70 2.50 0.15 0.40 1.50

2 结果与分析
2.1 单因子试验结果分析
2.1.1 模板量对 RSAP-PCR 结果的影响
适宜的模板量是高保真扩增的重要前提条件,
模板量不足会导致 PCR 扩增产物含量低或者扩增
不出条带;模板量过高会导致非特异性扩增的概率
增加,浪费DNA模板.如图1所示,模板量在10~100
ng 均能扩增出条带,考虑到节约模板用量、条带
的清晰度和稳定性,选择 50 ng为最佳模板量.


第 35卷第 1期 李炎林等 红花檵木 RSAP-PCR反应体系的建立与优化 67








1~11 对应表 1中的“水平”;M 标准分子质量 100 bp plus.图
2~5同
图 1 模板浓度对 RSAP 的影响
Fig.1 Effects of DNA concentrations on RSAP-PCR
2.1.2 Mg2+浓度对 RSAP-PCR 结果的影响
Mg2+浓度对 PCR 扩增的特异性和产量影响明
显,Mg2+浓度过高会导致非特异性的扩增,相反则
会降低 Taq 酶的活性,使 PCR 产物减少.如图 2
所示,Mg2+浓度小于 1.50 mmol/L 或者大于 3.50
mmol/L时,扩增条带弱或者基本无扩增条带;Mg2+
浓度为 1.50~3.50 mmol/L 时均可扩增出清晰的条
带.考虑到条带稳定性和经济因素,选择 2.00
mmol/L为最佳Mg2+浓度.








图 2 Mg2+浓度对 RSAP 的影响
Fig.2 Effects of Mg2+concentrations on RSAP-PCR
2.1.3 dNTPs 浓度对 RSAP-PCR 结果的影响
dNTPs 浓度和 PCR 扩增效率有密切关系,
dNTPs浓度过低会降低 PCR产物的产量,过高会引
起碱基错位,导致非特异性的扩增.如图 3所示,
不同浓度 dNTPs 扩增结果不同,没有加入 dNTPs
时无 PCR产物;dNTPs浓度为 0.05 mmol/L时,出
现微弱亮度的条带;随着 dNTPs浓度的升高,条带
亮度和数目增加;dNTPs浓度大于 0.35 mmol/L时,
出现非特异性的扩增.按照条带丰富稳定、清晰的
原则,选择 0.25 mmol/L为 dNTPs最佳浓度.







图 3 dNTPs 浓度对 RSAP 的影响
Fig.3 The effects of dNTPs concentrations in the RSAP-PCR
2.1.4 引物浓度对 RSAP-PCR 结果的影响
引物是 PCR特异反应的关键,引物浓度偏高会
引起错配和非特异性扩增,且可增加引物之间二聚
体的机会;引物浓度过低,与模板 DNA 结合的效
率低,产物产量降低.如图 4所示,无引物时,无
PCR 产物出现;随着引物浓度的增加,条带数目和
亮度增加,在引物浓度为 0.30 mmol/L时,条带丰富
清晰;当引物浓度大于 0.30 mmol/L时,随着引物浓
度的增加,条带数目减少,亮度和清晰度降低.这
可能与过多的引物与 TaqDNA聚合酶竞争Mg2+,引
物与模板 DNA结合效率降低有关.经全面衡量,选
择 0.30 mmol/L为最适 RSAP-PCR引物浓度.









图 4 引物浓度对 RSAP 的影响
Fig.4 Effects of primer concentrations on RSAP-PCR
2.1.5 Taq 酶对 RSAP-PCR 结果的影响
Taq酶对 PCR结果影响很大,酶量过高可引起
非特异性扩增,产生大量弥散带,从而使背景色加
深,浓度过低则合成产物的产量减少.由图 5可见,
0.50~5.00 U的 Taq酶均可扩增出条带,在 0.50~2.50
U时,随着 Taq酶量的增加条带亮度增加;2.50~4.50
U时条带亮度和数目差别不大;大于 4.50 U时出现
非特异性的扩增.经综合考虑,选择 2.50 U为最适
Taq酶量.
500 bp
250 bp

50 bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M
500 bp
250 bp

50 bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M
500 bp
250 bp

50 bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M
500 bp
250 bp

50 bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M


68 湖南农业大学学报(自然科学版) 2009年 2月







图 5 Taq 酶对 RSAP 的影响
Fig.5 Effects of Taq enzyme activities on RSAP-PCR
2.2 RSAP─PCR 正交设计直观分析
根据 L16(45)正交设计试验 PCR 产物电泳结果
(图 6),按照种质资源鉴定和遗传多样性分析的要
求,对 PCR结果从高到底依次打分.条带数量丰富、
清晰度高、稳定性和 2次重复性好的最佳产物记为
16 分,与此相反,最差的记为 1 分.1~16 组合的
分数依次为 10,2,8,13,1,5,7,14,3,4,
11,9,6,16,12,15.根据分数求出每个因素同
一水平下的试验值之和 Ki 以及每一因素水平下的
数据平均值 ki,并求出同一因素不同水平间平均值
的极差 R.














1~2:1;3~4:2;5~6:3;7~8:4;9~10:5;11~12:6;13~14:7;
15~16:8;17~18:9;19~20:10;21~22:11;23~24:12;25~26:
13;27~28:14;29~30:15;31~32:16
图 6 正交试验 PCR 产物电泳结果
Fig.6 Electrophoreses of orthogonal design of PCR products
极差 R 直接反应影响因素对反应体系的影
响.R值越大,影响越大.由表 3可知,各因素水
平的变化对红花檵木 RSAP-PCR 体系的影响从大
到小依次为 Mg2+浓度、模板量,dNTPS 浓度、引
物浓度和 Taq酶量.
每一因素水平下的数据平均值 ki反映了影响因
素各水平对反应体系的影响情况,ki 值越大,反映
水平越好.由表 3可知 RSAP-PCR反应中 5个因素
的最佳反应水平为:模板量 70.00 ng,Mg2+浓度 2.50
mmol/L, dNTPs 浓度 0.25 mmol/L(或者 0.15
mmol/L),引物浓度 0.20 mmol/L,Taq酶量 2.50 U.5
个因素的最佳水平组合并没有出现在正交设计表
中,但与分值最高的 14号组合最接近,仅有 Mg2+
浓度不同.
表 3 正交设计直观分析
Table 3 Intuitive analysis of orthogonal design
结果 模板量 Mg2+浓度 dNTPs浓度 引物浓度 Taq酶量
K1 33.00 20.00 41.00 42.00 40.00
K2 27.00 27.00 24.00 33.00 27.00
K3 27.00 38.00 41.00 28.00 28.00
K4 49.00 51.00 30.00 33.00 41.00
k1 8.25. 5.00 10.25 10.50 10.00
k2 6.75 6.75 6.00 8.25 6.75
k3 6.75 9.50 10.25 7.00 7.00
k4 12.25 12.75 7.50 8.25 10.25
R 5.50 7.75 4.25 3.50 3.50

3 结论与讨论
笔者用改良的Tris-HCl洗涤法提取红花檵木成
熟叶片的 DNA,能满足 RSAP-PCR扩增的要求.单
因子试验结果表明,RSAP-PCR的最优反应体系为:
模板量 50 ng,Mg2+浓度 2.00 mmol/L,dNTPs浓度
0.25 mmol/L,引物浓度 0.30 mmol/L,Taq酶量 2.50
U;正交设计试验结果表明:模板量 70 ng,Mg2+
浓度 1.50 mmol/L,dNTPs浓度 0.25 mmol/L,引物
浓度 0.20 mmol/L,Taq酶量 2.50 U.
单因子试验结果表明,dNTPS浓度、引物浓度
和 Taq酶量对反应体系具有显著影响,而模板量和
Mg2+浓度对反应体系的影响不大,模板 DNA 用量
在 10~100 ng均可获得清晰的扩增条带.这与杜晓
华等[12]的研究结果一致.但正交设计试验结果表
明,Mg2+浓度对反应体系的影响最大,模板量次之,
而引物浓度和 Taq 酶量影响最小.此外,2 种方法
得到的最优因素水平也不一致,这可能与 PCR反应
(下转第 75 页)

5 000 bp
1 500 bp
1 000 bp

500 bp




100 bp
500 bp
250 bp

50 bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M


第 35卷第 1期 刘建雄等 湘科一号无籽西瓜新品种的选育 75
3.3 整枝授粉
双蔓式整枝,及时固蔓,间栽有籽西瓜,人工
辅助授粉,雨天授粉后戴帽,以提高座果率.
3.4 施肥技术
以施厩肥、土杂肥、菜枯等有机肥为主,施化
肥为辅.基肥应占全期肥料的 70%以上,巧施提苗
肥,倒蔓至座果期严格控制追肥,座果后可大水大
肥,施膨瓜肥,以促进果实膨大,提高产量.
3.5 病虫害防治
搞好田间清洁,实行深沟高畦.以预防为主,
座果后每 7~10 d择晴天喷施 1次杀虫、杀菌剂.
参考文献:
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责任编辑:王赛群
英文编辑:罗文翠

(上接第 68 页)
的不稳定性有关,也与试验因素在某一范围内对
PCR反应的影响基本相同有关.单因子试验结果与
正交设计试验结果不完全相符的现象,前人在结合
2种方法构建 PCR反应体系时也出现过[15-16],因此,
结合单因子试验与正交试验来构建 PCR 扩增体系
能使体系更优化.
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责任编辑:王赛群
英文编辑:罗文翠