全 文 ：收稿日期:2007-06-27
基金项目:国家“ 863”项目(SZ-01-01-03);国家“十五”科技攻关项目(2001BA302B)
作者简介:陈秋芳(1972-),女 ,河南伊川人 , 工程师 ,硕士 , 主要从事离子束生物技术研究。
菘蓝叶片离体培养与试管无性系的建立
陈秋芳 , 黄群策 , 秦广雍
(郑州大学 河南省离子束生物工程重点实验室 , 河南 郑州 450052)
摘要:以菘蓝幼嫩叶片为外植体 ,研究了不同激素及其组合对菘蓝离体叶片的分化方向及不定芽
诱导效率的影响 ,建立了菘蓝叶片高效不定芽发生 、植株再生体系。结果表明 ,在 MS 基本培养基
中单纯添加 2 ,4-D ,不能诱导离体叶片发生不定芽 ,只诱导愈伤组织发生 。如果在 MS 基本培养
基中加入 2 , 4-D和 6-BA ,也无不定芽发生 ,而添加 NAA 和 6-BA ,可以诱导其发生不定芽。
在激素组合为 NAA 1.0mg/L +6-BA 0.5mg/ L时 ,不定芽的诱导率达到 95%,在单纯加入 NAA
1.0mg/L的 MS 基本培养基上 ,菘蓝叶片也可以发生不定芽 ,不定芽诱导率为 93%,且不定芽生长
健壮 ,不易老化 ,经过一段时间的培养可以直接生根并移栽成活 。
关键词:菘蓝;离体叶片培养;不定芽;再生
中图分类号:S567.9　　文献标识码:A　　文章编号:1004-3268(2007)12-0098-03
Regeneration Sy stem and in Vi tro Culture of Leaves f rom
I sat is indigotica Fo rt.
CHEN Qiu-fang , HUANG Qun-ce , QIN Guang-yong
(Henan P rovincial Key Labo rator y o f Ion Beam Bio-engineering , Zhengzhou Univer sity , Zheng zhou 450052 , China)
Abstract:High frequent advent itio us shoo t fo rmation and plant-le t regeneration sy stem w as es-
tablished through in v it ro cul ture o f I sat is indigot ica Fort.leaves.The resul ts show ed that leaf
adventitious shoots could not be induced on basal M S medium only supplemented w ith 2 ,4-D or
2 ,4-D and 6-BA , but calli w ere induced.However , the adventi tious shoo ts could be induced
on basal M S medium w ith the addit ion of NAA and 6-BA.When the po rtions of hormones w ere
NAA 1.0mg/L+6-BA 0.5mg/L , the induction rate of adventi tious shoots at tained 95%.The
adventitious shoots could also be induced on basal MS medium only supplemented wi th NAA 1.0
mg/L , w ith an induction rate of 93%.Meanwhile , the adventi tious shoo ts induced by this kind
of hormone w ere vigo rous , no t easy senescence , and could generate sturdy root and form inte-
g rated plants after a period of cul ture.This plants could be transplanted easily and successful ly .
Key words:Isatis indigotica Fo rt.;Leaf culture in v i tro;Adventi tious shoo t;Regeneration
　　菘蓝(I sat is indigotica Fo rt.)属于十字花科菘
蓝属植物 ,其干燥根医学上称之为板蓝根 ,具有清热
解毒 、凉血利咽之功效 ,医学上用板蓝根治疗伤风感
冒 、发热 、头痛 、咽喉肿痛 、扁桃体炎 、急性腮腺炎 、咳
嗽痰多等多种上呼吸道感染疾病[ 1] ;其叶片(大青
叶)具有抗菌和清热解毒的功效 。以往对菘蓝的研
究多集中于其根 ———板蓝根化学成分和药理作
用[ 2 ～ 4] 。通过低能离子束生物技术对植物体进行遗
传改良已有一些研究报道[ 5 ～ 7] 。为了将此项技术应
用于菘蓝的遗传改良 ,迫切需要建立菘蓝的无性繁
殖体系 。有关菘蓝的组织培养前人已经做了一些阶
段性研究[ 8 , 9] ,而利用离子束生物技术对其进行遗
传改良的研究则有待于探索 。本试验以菘蓝幼嫩叶
片为外植体进行培养 ,试图建立更加适合于应用离
子束技术进行遗传改良的试管无性系 ,为进一步利用
低能离子束生物技术对菘蓝进行遗传改良奠定基础。
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2007年第 12期
DOI :10.15933/j.cnki.1004-3268.2007.12.008
1　材料和方法
取河南省离子束生物工程重点实验室种植的菘
蓝幼嫩叶片为外植体 。用稀的洗洁精水冲洗后再用
自来水清洗干净 ,之后在超净工作台上用 70%的酒
精消毒 30 s ,无菌水冲洗 3次 ,再用 10%的次氯酸钠
消毒 3min ,无菌水冲洗 5 次 , 将叶片切成 0.5 cm2
的小块 ,接种于不同激素配比的 MS 基本培养基上 ,
每瓶接种 10块叶片 ,每处理 10瓶 , 2次重复 。MS
基本培养基均附加蔗糖 30 g/L , 琼脂 8.0 g/L , pH
5.8 ,常规高压灭菌。培养温度为 25 ℃左右 ,光照
12 h/d ,光照强度 1500 ～ 2000 lx 。
2　结果与分析
2.1　2 ,4-D和 NAA对菘蓝离体叶片分化方向的
影响
菘蓝离体叶片经过两周的培养后 ,在添加不同
的激素组合的培养基上 ,叶片的分化方向不同。在
处理 1和处理 2培养基上 ,单纯添加了 2 , 4-D ,培
养 20 d ,菘蓝离体叶片的叶缘上卷 ,有白色愈伤颗粒
出现(图 1-1),进一步培养 ,这些小的愈伤组织颗
粒逐渐干枯 ,不能形成大块愈伤 ,也无不定芽发生。
处理 3 和处理 4 培养基上 , 添加了不同浓度的
2 , 4-D和6-BA ,情况没有得到改善 ,依然是只能
1.单纯加入 2 , 4-D的培养基 ,培养 20d ,外植体愈伤组织化;2.加入 2 , 4-D和 6-BA , 外植体只能分化出愈伤组织 , 而无不定芽发生;3.加
入 NAA 和 6-BA ,培养培养 20d ,不定芽直接从外植体上再生;4 , 5.加入 NAA 和 6-BA ,外植体不定芽生长情况;6.单纯加入
NAA 1.0mg/ L ,外植体不定芽生长健壮 ,不易老化
图 1　菘蓝离体叶片培养
诱导出少量愈伤 ,而无不定芽形成(图 1-2)。而在
处理 5 ～ 10中 ,只有 NAA 或 NAA 与 6-BA 组合 ,
可以诱导出不定芽(表 1)。
2.2　不同浓度的 NAA 与 6-BA 配比对菘蓝离体
叶片不定芽诱导效率的影响
菘蓝幼嫩叶片在添加了 NAA 和 6-BA的 MS
基本培养基中培养 10 d 左右 ,叶片开始增厚 —肿胀
-鼓起 ,20 d左右有不定芽原基从叶片边缘产生(图
1-3), 30 d不定芽高度可以达到 3 ～ 4 cm 。培养基
中不同种类的激素和激素配比对菘蓝幼嫩叶片的分
化效率有一定的影响。在 NAA 为 1.0mg/L 时 ,改
变 6-BA 浓度可以改变叶片的分化效率 ,当 6-BA
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河南农业科学
　　 表 1　不同激素及其配比对菘蓝离体叶片分化
　　　　　 方向及分化效果的影响
处理
编号
2 ,4-D
(mg/ L)
NAA
(m g/ L)
6-BA
(mg/ L)
不定芽
诱导率
(%)
外植体
形态变化
1 1.0 0 0 0 愈伤组织
2 2.0 0 0 0 愈伤组织
3 1.0 0 0.2 0 愈伤组织
4 1.0 0 0.5 0 愈伤组织
5 0 1.0 0 93 不定芽大 、多 、壮 ,老化慢　
6 0 1.0 0.2 78 不定芽少 、大
7 0 1.0 0.5 95 不定芽多 、大
8 0 1.0 1.0 82 不定芽多 、小
9 0 0.5 1.0 42 不定芽少 、小
10 0 0.2 1.0 59 不定芽少 、小
为0.5mg/ L时 ,不定芽诱导率达到 95%(图 1-4),
6-BA浓度为 0.2mg/ L 和 1.0mg/L 时 ,不定芽诱
导率虽有下降 ,但是不定芽个体较大(图 1-5)。在
单纯添加 NAA 1.0mg/ L 的 MS 基本培养基中 ,不
定芽诱导率也可以达到 93%,且诱导出的不定芽健
壮 ,个体大 , 不易老化(图 1 -6)。在 6 -BA 为
1.0mg/L时 ,随着 NAA 浓度的下降 ,不定芽诱导率
有下降趋势(表 1)。
2.3　不定芽的生根培养与驯化移载
选择生长健壮的不定芽 , 接种于生根培养基
MS+NAA 1.0mg/ L 中 , 20 ～ 30 d可形成完整的根
系 ,生根率达到 100%,将生根的无菌苗炼苗 3 ～
4d ,小心洗去根部琼脂块 ,移栽至花卉营养土上 ,注
意保持温 、湿度 ,加强水肥管理 ,移栽成活率在 90%
以上 。如果处理 5培养基中的不定芽在原来的培养
基上继续培养 , 45 d左右就可以形成完整的根系 ,而
且不定芽产生的根系较大且多 ,移栽成活率可以达
到 95%以上 。
3　讨论
植株再生技术是植物组织培养的重要方面 ,是
植物生物工程技术研究的基础 ,而植株再生是一个
复杂的技术体系 ,与植株本身的激素水平和培养基
中的生长调节剂浓度密切相关。在组织培养中 ,人
们常用生长素和细胞分裂素诱导已分化细胞脱分
化。2 ,4-D一般有利于愈伤组织的形成 ,但对芽的
分化有强烈的抑制作用 ,本试验材料也不例外 ,在加
入 2 ,4-D的培养基上 ,不能诱导出不定芽 ,即使再
加入 6-BA 也不行。NAA 和 2 ,4-D 都是生长素
类物质 ,但是对菘蓝叶片的诱导分化方向不同 ,单纯
的 NAA 或与 6-BA组合 ,都可以诱导不定芽的分
化 。一般认为 ,随着培养基中 6-BA 与 NAA 相对
比例的升高 ,不定芽的分化率会增高 。在本试验中 ,
当 NAA 1.0mg/ L , 6 -BA 0.5mg/ L 时分化率最
高 ,6-BA 为 0.2mg/ L 和 1.0mg/L 时的诱导率均
低于 6-BA为 0.5mg/L 时分化率。而在单纯添加
NAA 的 MS 基本培养基中 ,不定芽的分化率可以达
到 93%,且不定芽生长健壮 ,不易老化 ,可以直接诱
导生根移栽成活。
试验结果表明 ,菘蓝叶片不易通过愈伤组织发
生不定芽 ,可以不经过愈伤组织阶段直接诱导发生
不定芽 ,在诱导不定芽时 ,不但要考虑诱导分化率的
问题 ,同时也应该考虑诱导分化出的不定芽的健壮
程度。在以菘蓝幼嫩叶片为外植体诱导不定芽时 ,
以添加 NAA 1.0mg/L +6 -BA 0.5mg/ L 的 MS
基本培养基为佳 ,也可以用只添加 NAA 1.0mg/L
的 MS基本培养基 ,后者激素配比简单 ,不定芽诱导
效果好 ,生长健壮 ,不易老化 ,而且在一种培养基上
就可以完成不定芽的诱导和生根两个过程 ,减少了
操作程序 ,进而减少了污染几率 ,因此是一个很好的
试管无性体系 ,是进一步利用离子束生物技术进行
菘蓝遗传改良的首选组织培养体系。
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2007年第 12期