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不同产地及不同采季鲜品垂盆草的HPLC指纹图谱



全 文 :· · 中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2014, 45(9)830
垂 盆 草 为 景 天 科 植 物 垂 盆 草 Sedum
sarmentosum Bunge的干燥全草,味甘、淡,性凉,
分布于全国各地。主要采收于夏、秋二季,含蛋白
质、氨基酸、糖类、黄酮及其苷类、三萜类、甾醇、
不同产地及不同采季鲜品垂盆草的 HPLC指纹图谱
杨 洋,任卫高,葛少波,裴燕芳,潘金火*
(南京中医药大学药学院,江苏南京 210023)
摘要:建立了不同产地及不同采季鲜品垂盆草的高效液相色谱指纹图谱,并通过小鼠肝损伤试验验证成分差异对药效学
的影响。采用 Hedera ODS-2柱,以乙腈∶ 0.1%磷酸为流动相,梯度洗脱,检测波长 310 nm,测定不同产地及不同采季
鲜品垂盆草的 HPLC指纹图谱。不同产地垂盆草共确定 6个共有峰,不同采季垂盆草共确定 15个共有峰。10批样品中,
丹阳批次化学成分较多。鲜品垂盆草受产地及采收季节影响较大,且成分差异会影响其药效作用。
关键词:垂盆草;高效液相色谱;指纹图谱;保肝作用
中图分类号:R93;O657.7+2 文献标志码:A 文章编号:1001-8255(2014)09-0830-06
收稿日期:2013-11-25;修回日期:2014-07-04
基金项目:江苏省科技厅社会发展项目(BE2009682)
作者简介:杨 洋(1989-),女,硕士研究生,专业方向:药物新剂
型新技术。
Tel:015895897237
E-mail:Gelesy@163.com
通信联系人:潘金火(1963-),男,硕士生导师,从事中药药剂学
研究。
Tel:025-85811517
E-mail:panjinhuo@163.com
HPLC Fingerprints of Fresh Sedum sarmentosum Bunge in
Different Origins and Harvesting Seasons
YANG Yang, REN Weigao, GE Shaobo, PEI Yanfang, PAN Jinhuo*
(College of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023)
ABSTRACT: The HPLC fi ngerprint of fresh Sedum sarmentosum Bunge was established. The chemical compo-
sitions in fresh Sedum sarmentosum Bunge from different origins and different harvesting seasons were compared, and the
impacts on pharmacodynamics were verifi ed through the liver injury model in mice. A Hedera ODS-2 column was used,
with the mobile phase of acetonitrile∶0.1% phosphoric acid by gradient elution, at the detection wavelength of 310 nm.
Six common peaks were determined in fresh Sedum sarmentosum Bunge from different origins, and fi fteen common peaks
were given in different harvesting seasons. The chemical compositions of the samples from Danyang had more chemical
ingredients than the others. The chemical compositions of fresh Sedum sarmentosum Bunge were affected by origins and
harvesting seasons, and it would also affect the pharmacodynamics.
Key Words: Sedum sarmentosum Bunge; HPLC; fi ngerprint; hepatoprotective effect
生物碱及氰苷类,具清热解毒、利尿消肿、排脓生
肌之效,主治丹毒溃疡、小便不利、急慢性肝炎 [1-3]。
垂盆草临床多以干品入药,关于其鲜品的研究报道
较少。本试验借助指纹图谱的方法研究了不同产地、
不同采季鲜品垂盆草的化学成分差异,并通过保肝
作用验证成分差异对其药效的影响,对现有垂盆草
的研究予以补充。
1 仪器与试药
e2695型高效液相色谱仪,含 2998型二极管阵列检测器、
Empower色谱工作站 (美国Waters公司 );高速组织捣碎
机 (上海标本模型厂,功率 200 W,转速 1.0×104~ 1.2×
中药与天然药物
中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2014, 45(9) · ·831
104 r/min) ;XL-04A型粉碎机 (广州旭朗机械设备有限公
司 )。Synergy HT型紫外荧光酶标仪 (美国伯腾仪器有限公
司 )。
不同产地垂盆草分别来源于江苏丹阳、江苏沐阳湖东
镇、江苏宜兴、江苏南京中医药大学、江苏南京大学、江苏
南京、江苏沐阳七雄镇、江苏宜兴太华镇茂花村、江苏句
容市马埂村和江苏丹阳,记为 S1~ S10,均采收于 2013年
9月。不同采季垂盆草分别采收于 2013-06-15、2013-06-30、
2013-07-15、2013-07-30、2013-08-15、2013-08-30、
2013-09-15、2013-09-30、2013-10-15和 2013-10-30,记为
N1~ N10,均采收于本校。上述垂盆草均经本校邹立思实
验师鉴定为景天科植物垂盆草 Sedum sarmentosum Bunge。
昆明种小鼠,雄性,18~ 22 g,扬州大学比较医学中
心提供,合格证号:SCXK( 苏 )2012-0004,饲养环境:本
校实验动物中心,分笼饲养,保持 12 h昼夜节律,室温
(22±1)℃,自由饮水摄食。
槲皮素对照品 (批号 100081-200907) 和木犀草苷对照
品 (批号 11720-201106) 均购自中国食品药品检定研究院;
四氯化碳 (上海凌峰化学试剂有限公司,批号 20130517) ;
联苯双酯滴丸 ( 北京协和药厂生产,批号 国药准字
H1102098)。谷草转氨酶谷草转氨酶 (AST) 试剂盒 (批号
20130604)、谷丙转氨酶 (ALT) 试剂盒 (批号 20130604)、
苏木素伊红 (HE) 染色试剂盒 (批号 20130528) 均购自南京
建成生物技术研究所。乙腈、甲醇为色谱纯;水为纯净水,
经 0.45 m微孔滤膜过滤;其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱 Hedera ODS-2柱 (4.6 mm×200 mm,
5 m) ;流动相 乙腈 (A) ∶ 0.1%磷酸溶液 (B),梯
度洗脱 (表 1) ;检测波长 310 nm;流速 0.8 ml/min;
柱温 35 ℃;进样量 10 l。
表 1 梯度洗脱表
Tab.1 Gradient Elution Procedure
t/min A∶B
0→10 10∶90
10→30 10∶90→15∶85
30→50 15∶85→25∶75
50→60 25∶75→40∶60
60→75 40∶60→70∶30
75→80 70∶30→10∶90
2.2 溶液配制
对照品溶液:精密称取槲皮素和木犀草苷对
照品 1.51和 1.02 mg,各置 100 ml和 10 ml量瓶
中,用甲醇溶解并定容,即得槲皮素对照品溶液
(15.1 g/ml) 和木犀草苷对照品溶液 (0.102 mg/ml)。
供试品溶液:准确称取垂盆草 50 g,加入 95%
乙醇 100 ml匀浆 (12 000 r/min)2 min,取匀浆液,
经 0.45 m滤膜过滤,取续滤液作为供试品溶液。
2.3 精密度、重复性和稳定性试验
取同批供试品溶液,按“2.1”项下条件连续进
样 6次,计算得各共有峰相对保留时间 (RRT) 的
RSD<0.5%,相对峰面积 (RPA) 的 RSD<3%。
精密称取同批样品,共 6份,分别按“2.2”项
下方法制备供试品溶液,共 6份,按“2.1”项下
色谱条件分别进样测定,计算得各共有峰 RRT的
RSD<0.8%,RPA的 RSD<3%。
取同批供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件,
10- 木犀草苷;14- 槲皮素
图 1 鲜品垂盆草的 HPLC指纹图谱
Fig.1 HPLC Fingerprint Chromatogram of Fresh Sedum sarmentosum Bunge
· · 中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2014, 45(9)832
分别于 0、3、6、9、12和 24 h进样测定,计算得
各共有峰 RRT的 RSD<1%,RPA的 RSD<3%,表
明供试品溶液在 24 h内稳定。
2.4 指纹图谱的建立及相似度分析
2.4.1 不同产地鲜品垂盆草化学成分比较
取 10批不同产地垂盆草,分别制备供试品溶
液,按“2.1”项下条件进样分析 (图 2)。以色谱
峰 4为参照峰,共标定 6个共有峰。共有峰 RRT
的 RSD<0.8% (表 2),表明各产地药材共有峰保留
时间基本一致;共有峰 RPA的 RSD>3% ( 表 3),
表明各产地垂盆草成分含量有一定差异。由图 2及
表 2可知,S1批垂盆草所含成分较多,推测其药效
学意义可能更大。
表 2 不同产地鲜品垂盆草共有峰的 RRT
Tab.2 Relative Retention Time of Fresh Sedum sarmentosum Bunge from Different Origins
峰号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 RSD/%
1 0.295 0.297 0.296 0.295 0.295 0.296 0.297 0.297 0.297 0.297 0.29
2 0.312 0.309 0.313 0.315 0.313 0.312 0.314 0.315 0.316 0.316 0.72
3 0.473 0.476 0.475 0.475 0.475 0.475 0.478 0.477 0.479 0.479 0.39
4 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.00
5 1.320 1.322 1.325 1.329 1.328 1.326 1.329 1.329 1.330 1.331 0.27
6 1.602 1.602 1.605 1.611 1.609 1.608 1.608 1.610 1.611 1.615 0.25
表 3 不同产地鲜品垂盆草共有峰的 RPA
Tab.3 Relative Peak Areas of Fresh Sedum sarmentosum Bunge from Different Origins
峰号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 RSD/%
1 0.188 0.237 0.119 0.086 0.613 0.081 0.200 0.366 0.200 0.254 69.47
2 1.301 0.668 0.259 0.539 1.377 0.409 0.654 0.412 0.659 1.268 56.56
3 1.114 0.427 0.266 0.304 1.955 0.298 0.250 0.364 0.250 0.918 91.83
4 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.00
5 0.235 0.255 0.157 0.141 0.253 0.095 0.189 0.385 0.189 0.179 40.91
6 0.035 0.039 0.068 0.042 0.278 0.019 0.106 0.141 0.106 0.035 90.89
4- 木犀草苷
图 2 不同产地鲜品垂盆草 HPLC指纹图谱
Fig.2 HPLC Fingerprint Chromatograms of Fresh Sedum sarmentosum Bunge from Different Origins
2.4.2 不同采季鲜品垂盆草化学成分比较
取 10批不同采季垂盆草,分别制备供试品溶
液,进样分析 (图 3)。以色谱峰 10为参照峰,共
标定 15个共有峰。共有峰 RRT的 RSD<0.7% (表
4),表明不同采季各共有峰保留时间基本一致;共
有峰 RPA的 RSD>3% (表 5),表明不同采季垂盆
草成分含量有一定差异。其中,10号及 15号峰峰
面积变化极大,N7批垂盆草峰面积较大。
2.4.3 指纹图谱的相似度评价
采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件
(2004A版)对 S1~ S10批垂盆草进行相似度评价。
设置 S1为参照峰进行图谱匹配,整体相似度结果
见表 6。结果显示,S1与 S10,S4与 S5、S6较相似,
中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2014, 45(9) · ·833
10- 木犀草苷
图 3 不同采季鲜品垂盆草 HPLC指纹图谱
Fig.3 HPLC Fingerprint Chromatograms of Fresh Sedum sarmentosum Bunge from Different Harvesting Time
表 4 不同采季鲜品垂盆草共有峰的 RRT
Tab.4 Relative Retention Time of Fresh Sedum sarmentosum Bunge from Different Harvesting Time
峰号 N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 N10 RSD/%
1 0.351 0.351 0.349 0.349 0.348 0.351 0.351 0.352 0.352 0.354 0.49
2 0.411 0.416 0.412 0.416 0.413 0.413 0.411 0.413 0.419 0.415 0.62
3 0.467 0.466 0.463 0.471 0.463 0.464 0.470 0.466 0.470 0.463 0.67
4 0.482 0.488 0.479 0.486 0.485 0.480 0.481 0.481 0.484 0.477 0.69
5 0.499 0.503 0.493 0.500 0.499 0.497 0.499 0.497 0.504 0.498 0.64
6 0.649 0.645 0.646 0.652 0.650 0.642 0.646 0.642 0.652 0.649 0.58
7 0.728 0.730 0.723 0.728 0.735 0.726 0.728 0.726 0.734 0.722 0.57
8 0.806 0.811 0.797 0.812 0.811 0.802 0.808 0.804 0.812 0.799 0.68
9 0.916 0.915 0.904 0.919 0.915 0.908 0.909 0.910 0.921 0.902 0.69
10 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.00
11 1.124 1.134 1.115 1.126 1.130 1.117 1.111 1.121 1.129 1.119 0.65
12 1.243 1.250 1.246 1.256 1.251 1.260 1.243 1.243 1.256 1.232 0.66
13 1.311 1.318 1.306 1.322 1.321 1.305 1.317 1.303 1.322 1.308 0.57
14 1.422 1.424 1.412 1.434 1.433 1.417 1.422 1.410 1.432 1.417 0.61
15 2.028 2.043 2.011 2.048 2.037 2.020 2.027 2.026 2.043 2.011 0.64
表 5 不同采季鲜品垂盆草共有峰的 RPA
Tab.5 Relative Peak Areas of Fresh Sedum sarmentosum Bunge from Different Harvesting Time
峰号 N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 N10 RSD/%
1 0.388 0.384 0.377 0.353 0.303 0.292 0.353 0.307 0.329 0.344 10.95
2 0.350 0.387 0.226 0.296 0.195 0.190 0.254 0.234 0.234 0.200 28.12
3 0.360 0.372 0.286 0.335 0.276 0.232 0.333 0.304 0.240 0.164 23.99
4 0.362 0.384 0.315 0.327 0.297 0.225 0.236 0.263 0.204 0.134 29.97
5 0.330 0.340 0.295 0.379 0.263 0.229 0.210 0.265 0.233 0.163 26.17
6 0.061 0.070 0.070 0.094 0.065 0.095 0.164 0.069 0.070 0.193 50.69
7 0.351 0.362 0.290 0.326 0.282 0.272 0.165 0.223 0.166 0.290 27.23
8 0.121 0.123 0.069 0.082 0.110 0.101 0.067 0.104 0.079 0.145 27.54
9 0.098 0.094 0.096 0.090 0.120 0.119 0.078 0.204 0.164 0.125 34.60
10 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.00
11 0.420 0.455 0.347 0.407 0.351 0.374 0.414 0.539 0.474 0.221 23.14
12 0.066 0.068 0.048 0.066 0.114 0.095 0.080 0.120 0.086 0.083 29.14
13 0.159 0.164 0.138 0.134 0.137 0.147 0.157 0.143 0.158 0.202 14.02
14 0.035 0.035 0.021 0.038 0.082 0.065 0.049 0.067 0.031 0.029 46.37
15 0.036 0.033 0.015 0.022 0.014 0.050 0.101 0.019 0.008 0.009 92.17
· · 中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2014, 45(9)834
表明产地越近,样品相似度越高。
2.5 不同产地新鲜垂盆草药效学研究
2.5.1 垂盆草产地选取
由上述 HPLC图谱数据比较可知,各产地垂盆
草化学成分参差不齐,此处仅选择峰数及峰面积都
存在极显著差异的丹阳 (S1) 及沐阳 (S2) 批次进行
考察,确定其研究价值。
2.5.2 动物造模和给药
雄性昆明种小鼠 (20±2) g,随机分为 7组,每
组 10只。分别为正常组、模型组、联苯双酯组
(250 mg/kg)、S1高 /低剂量组和 S2高 /低剂量组。
除正常组以外,每组小鼠均腹腔注射 0.2%四氯化
碳 (0.2 ml/10 g)[4]。各组每日定时灌胃 1次,正常
组和模型组小鼠灌胃 0.5% CMC-Na,各组高、低
剂量分别为 32和 16 g/kg,给药 9 d,第一次给药前
24 h和末次给药后 2 h,小鼠禁食不禁水。
2.5.3 血清中 ALT、AST测定
小鼠腹腔注射四氯化碳 16 h后 [5],静脉丛取血,
离心 (603×g)10 min,血清严格按照试剂盒操作说
明检测 ALT、AST。
2.5.4 苏木精 -伊红 (HE) 染色
小鼠断颈处死,肝脏经 10%甲醛固定 48 h以上,
石蜡包埋,切片,HE染色,镜下观察各组动物肝
脏组织结构和病变特点。
2.5.5 统计学处理
数据采用 x- ± s表示,用 SPSS 13.0软件作统计
学处理,t检验比较组间差异。
2.5.6 血清中 ALT和 AST活性
表 6 10个产地鲜品垂盆草指纹图谱相似度
Tab.6 Similarities between Samples from Ten Different Habitats
批次 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10
S1 1.000 0.160 0.172 0.823 0.851 0.836 0.790 0.185 0.845 0.980
S2 0.160 1.000 0.211 0.239 0.197 0.216 0.362 0.155 0.263 0.172
S3 0.172 0.211 1.000 0.173 0.154 0.159 0.168 0.401 0.165 0.159
S4 0.823 0.239 0.173 1.000 0.872 0.925 0.940 0.212 0.905 0.650
S5 0.851 0.197 0.154 0.872 1.000 0.821 0.657 0.431 0.878 0.763
S6 0.836 0.216 0.159 0.925 0.821 1.000 0.859 0.520 0.875 0.751
S7 0.790 0.362 0.168 0.940 0.657 0.859 1.000 0.741 0.825 0.653
S8 0.185 0.155 0.401 0.212 0.431 0.520 0.741 1.000 0.599 0.274
S9 0.845 0.263 0.165 0.905 0.878 0.875 0.825 0.599 1.000 0.183
S10 0.980 0.172 0.159 0.650 0.763 0.751 0.653 0.274 0.183 1.000
与正常组相比,模型组 ALT、AST均有显著性
差异 (P<0.01或 P<0.05),说明造模成功。与模型
组相比,阳性对照组及各给药组均能明显降低小鼠
血清中 AST、ALT活性 (P<0.01或 P<0.05)。
表 7 不同产地垂盆草对肝损伤小鼠血清中
ALT和 AST活性影响 (x- ± s,n=10)
Tab.7 Effects of Sedum sarmentosum Bunge from
Various Origins on the Activities of ALT and AST in
Mices Serum with Liver Injury (x- ± s, n=10)
组别 剂量/g·kg-1 ALT/IU·ml-1 AST/IU·ml-1
正常组 - 37.42±12.36 34.22±15.96
模型组 - 299.54±35.172# 264.31±42.134#
联苯双酯组 0.25 143.49±38.324** 121.32±14.345**
S1组 32 176.15±34.437
** 159.35±39.56**
16 166.36±35.357** 147.56±33.95**
S2组 32 234.58±53.321
* 205.73±32.778*
16 225.98±60.336* 190.18±28.272*
注:#P<0.01,与正常组比较;*P<0.05、**P<0.01,与模型组比较
2.5.7 病理学检查
正常组小鼠肝小叶肝细胞索沿中央静脉放射状
排列,结构正常,肝细胞无坏死,汇管区无炎细胞
浸润,无纤维化。模型组小鼠肝细胞变性坏死伴炎
细胞浸润,小叶周边肝细胞坏死严重。S1组小鼠肝
细胞水肿显著,与模型组相比,有较多炎细胞浸润,
坏死不明显。S2组小鼠肝细胞嗜酸性变显著伴部分
水肿,坏死不明显伴少量炎细胞浸润。综上,S1及
S2组垂盆草均有一定肝保护作用,S1组较为明显,
且两者作用机制可能有所不同。结果见图 4。
3 讨论
中国医药工业杂志 Chinese Journal of Pharmaceuticals 2014, 45(9) · ·835
本试验采用 95%、70%、50%乙醇及水匀浆处
理样品,95%乙醇超声提取,结果表明用 95%乙醇
匀浆,得到的峰数较多、峰形较好。分别选择测定
波长 310、330、360 nm,考察柱温分别为 30、35、
40 ℃,结果显示以乙腈∶ 0.1%磷酸为流动相,检
测波长 310 nm,柱温 35 ℃,出峰较多、峰分离度
较好。
本试验通过建立鲜品垂盆草指纹图谱,比较不
同产地及不同采季新鲜垂盆草化学成分差异,可知
垂盆草的新鲜药材受产地和采季影响较大,使用鲜
品入药时应加以选择,仅从化学成分考虑,S1( 产
地江苏丹阳 )及 N7( 采收于 2013-09-15) 共有成分
含量较高。
本试验通过比较 10批不同产地垂盆草,证明
鲜品垂盆草化学成分受产地影响较大,选取其中峰
数及峰面积都有显著差异的 S1、S2批样品,进行
小鼠急性肝损伤的药效学试验,由病理检查结果可
知其病变程度不同,可能是受到化学成分影响。
本试验还比较了垂盆草采收期内其新鲜药材化
学成分的差异,其中某些成分含量变化明显,10号
及 15号峰含量变化尤甚,考虑进一步研究这两种
成分,分析对药效应用的意义。
参考文献:
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A:正常肝组织,B:四氯化碳模型组肝组织,C:S1组肝组织,D:S2组肝组织
图 4 肝脏组织切片 (10×10)
Fig.4 Hepatic Tissue Slices (10×10)

B45-31 代谢综合征大鼠在衰老过程中的血管紧张素 -Ⅱ
和 1-7,以及 AT1、AT2和 Mas受体的表达 Rubio-Ruíz ME
[Peptides, 2014, 56: 101]
肾素 -血管紧张素系统 (RAS) 在代谢综合征 (MS) 的发展
以及衰老过程中发挥重要作用,血管紧张素 1~ 7(Ang 1-7) 与
血管紧张素 -Ⅱ (Ang Ⅱ )的作用相反。本研究测定了对照组及
MS大鼠血清和腹部脂肪组织的 Ang Ⅱ和 Ang 1-7,以及 AT1、
AT2和Mas在白色脂肪组织中的表达。在衰老进程中,观察到
大鼠体重、腹部脂肪和血脂的增长,对MS大鼠尤甚。对照组
和MS组的 6月龄大鼠血清中 Ang Ⅱ浓度相近。在衰老进程中,
对照组的血清 Ang Ⅱ浓度不变,而 MS组下降。两组大鼠白
色脂肪组织中的 Ang Ⅱ水平都有提高。MS大鼠在衰老过程中
血清和脂肪组织的 Ang 1-7也有增加。蛋白质印迹分析结果表
明,对照组在衰老过程中 AT1的表达量增加,AT2和Mas则保
持不变。MS组中,老龄大鼠的 AT1和 AT2表达显著降低。老
龄MS大鼠中高浓度的 Ang 1-7和脂连蛋白可能和 PPAR-表达
量的增加有关。MS大鼠脂肪组织的 PPAR-有所增加,而对照
组大鼠在衰老进程中 PPAR-降低,MS组的 PPAR-在老化过
程中则没有发生变化。Ang 1-7/Mas枢纽是老化MS动物白色脂
肪组织内的主要途径,可以作为治疗衰老过程中的MS的潜在
靶点。
[夏江华摘 ]