全 文 ：［收稿日期］ 20120903(001)
［基金项目］ 教育部高等学校博士学科点专项科研基金课题
(20114220120003，20114220120005) ;湖北省自然
科学基金(2012FFB00104) ;湖北省教育厅科研项
目(Q20111307)
［第一作者］ 杨飞，博士，讲师，从事分子遗传学研究，Tel:
0716-8488255，E-mail:yfwhu @ 163. com
［通讯作者］ * 徐延浩，博士，讲师，从事植物遗传学研究，Tel:
0716-8066652，E-mail:xyh09@ yangtzeu． edu． cn
温度对菘蓝基因组 DNA甲基化的影响
杨飞1，徐延浩2*
( 1. 长江大学医学院分子生物学部，湖北 荆州 434023;
2. 长江大学农学院长江中游湿地农业教育部工程研究中心，湖北 荆州 434025)
［摘要］ 目的:分析高温对菘蓝基因组 DNA甲基化模式的影响。方法:采用甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive
amplification polymorphism，MSAP)方法，筛选 36 对选择性引物进行扩增。结果:扩增共得到 1 612 条清晰的带纹，共检测到 82
(5. 1%)个 CCGG位点在高温胁迫后发生了甲基化状态的改变，其中 58(3. 6%)个位点发生了超甲基化，24(1. 5%)个位点发
生了去甲基化。结论:温度是调节菘蓝基因组 DNA甲基化模式的一个重要环境因子。
［关键词］ 菘蓝;DNA甲基化;高温;甲基化敏感扩增多态性
［中图分类号］ R282 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2013)06-0113-04
Rapid Genome DNA Methylation Changes in Isatis indigotica
after Exposure to Elevated Temperature
YANG Fei1，XU Yan-hao2*
(1. Department of Molecular Biology，College of Medicine，Yangtze University，Jingzhou 434023，China;
2. Engineering Research Center of the MOE for Wetland Agriculture in the Middle Reaches
of the Yangtze River，College of Agriculture，Yangtze University，Jingzhou 434025，China)
［Abstract］ Objective:To investigate the effect of elevated temperature in genome cytosine methylation
changes in Isatis indigotica． Method:Methylation sensitive amplification polymorphism (MSAP) approach and
36 pairs of selective primers combinations were used in this study． Result:A total of 1 612 bands were obtained．
In all，82 (5. 1%)CCGG sites displayed cytosine methylation changes after exposure to elevated temperature．
Among these sites，58 (3. 6%)CCGG sites had undergone hypermethylation changes and 24 (1. 5%)CCGG
sites undergone demethylation changes． Conclusion: This result provided evidence for genome-wide DNA
methylation remodeling occurring immediately after exposure to elevated temperature in I． indigotica．
［Key words］ Isatis indigotica;DNA methylation;high temperature;methylation sensitive amplification
polymorphism (MSAP)
道地药材是指经过中医临床长期优选出来的，
在特定地域，通过特定生产过程所产的，较其他地区
所产的同种药材品质佳、疗效好，具有较高知名度的
药材［1］。药材道地性的科学本质是中药现代化发
展的关键课题之一，也一直是中药研究的热点［2］。
从生物学角度看，道地药材的表型是由自身基因型
与所处的环境相互作用(生境饰变)的产物［3］。
已有很多研究表明如土壤理化状态、无机元素、
温度、光照等环境生态因子对道地药材的形成起到
了重要的作用［4-9］。郭兰萍等研究发现，道地药材
苍术的形成中受到缺钾及高温胁迫［10］。黄璐琦等
提出了道地药材形成的逆境效应理论［11］。但究竟
不同的环境生态因子是如何影响中药材药效成分生
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中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 19，No． 6
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DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.2013.06.050
成和积累，即不同的环境因子如何影响中药材的基
因表达和网络调控，对于弄清中药材道地性形成的
机制非常必要。
表观遗传(epigenetics)是指在 DNA序列不改变
的情况下，通过 DNA 甲基化、组蛋白共价修饰等机
制调控基因表达。表观遗传的一个特点就是其调控
具有可逆性，赋予了基因组一定的“可塑性”，是生
物体对环境应答的基础，特别是在植物逆境胁迫适
应性机制中，表观遗传调控机制具有重要意
义［12-13］。表观遗传是否参与了“道地药材形成的逆
境效应”是一个值得探讨的问题。
板蓝根是一味广为人知的清热解毒类中药，其
主要来源为十字花科植物菘蓝 Isatis indigotica
Fort．，每年药材消耗量在全国范围内一直居于前几
位［14-15］。环境生态因子是否引起菘蓝基因组表观
遗传的变化是一个值得探索的问题。本研究利用
MSAP技术，研究温度变化引起的菘蓝基因组 DNA
甲基化的应答，为环境生态因子参与中药材品质形
成的分子基础研究提供资料和新视角。
1 材料与方法
1. 1 材料培养与处理 菘蓝(2n = 14)种子由第二
军医大学张汉明教授惠赠。用自来水将种子冲洗干
净，70%乙醇消毒 30 s，0. 1% HgCl2 处理 3 min，
然后用蒸馏水洗 4 次;在蒸馏水中浸泡5 h后，置
于 24 ℃ 的恒温培养箱中黑暗条件下萌发 5 d 后选
取整齐的小苗移栽至花盆。材料在 25 ℃ /20 ℃(白
天 /晚上) ，光照时间 12 h 的条件下培养30 d后，部
分材料进行高温处理，其余材料接着培养。高温处
理温度为 35 ℃ /24 ℃(白天 /晚上) ，其他培养条件
不变，高温处理持续 14 d。
1. 2 方法
1. 2. 1 基因组 DNA 的提取 用 CTAB 法(2%
CTAB mol·L －1，100 mmol·L －1 Tris-HCl pH 8. 0，20
mmol·L －1 EDTA pH 8. 0，2. 8 mol·L －1 NaCl)提取基
因组总 DNA。粗提的 DNA 加入 RNAase A 消化过
夜，用酚-氯仿-异戊醇(25 ∶ 24 ∶ 1)抽提后用氯仿-异
戊醇(24 ∶ 1)抽提 1 ～ 2 次，用无水乙醇沉淀 DNA。
DNA干燥后溶于 TE溶液。
1. 2. 2 MSAP 的酶切与连接 双酶切反应体系总
体积 20 μL，其中 DNA 400 ng，NEB 10x buffer 2 μL，
HpaⅡ 20 U 或 MspI 10 U，EcoRI 10 U，100 × BSA
(10 g·L －1)0. 2 μL。37 ℃温浴 5 h，75 ℃ 10 min中
止反应。双酶切反应体系中加入 EcoRI 接头
5 pmol，Hpa Ⅱ /MspI 接头 50 pmol(表 1) ，T4 DNA
连接酶 1 μL(NEB) ，ATP 1 mmol·L －1。14 ℃ 水浴
12 h，75 ℃ 10 min中止反应。
表 1 MSAP分析所用接头、引物序列及选择性引物组合
接头 /引物 序列(5-3)/选择性引物组合
EcoRI 接头 I CTCGTAGACTGCGTACC
EcoRI接头 II AATTGGTACGCATAC
Hpa Ⅱ /MspI接头 I GATCATGAGTCCTGCT
Hpa Ⅱ /MspI接头 II CGAGCAGGACTCATGA
预扩引物(EcoRI + 0，HpaII /MspI + 0)
EcoRI预扩引物 GACTGCGTACCAATTC
Hpa Ⅱ /MspI预扩引物 ATCATGAGTCCTGCTCGG
选择性引物组合(EcoRI + 3，HpaII /MspI + 3)
Hpa Ⅱ /MspI + ATC EcoRI + TAC，EcoRI + TAG，EcoRI + TCA，EcoRI + TCT，EcoRI + TGT，EcoRI + TGA
Hpa Ⅱ /MspI + ACT EcoRI + TAC，EcoRI + TAG，EcoRI + TCA，EcoRI + TCT，EcoRI + TGT，EcoRI + TGA
Hpa Ⅱ /MspI + CTT EcoRI + TAC，EcoRI + TAG，EcoRI + TCA，EcoRI + TCT，EcoRI + TGT，EcoRI + TGA
Hpa Ⅱ /MspI + TTC EcoRI + AAC，EcoRI + AAG，EcoRI + ACT，EcoRI + ACA，EcoRI + AGT，EcoRI + ATT
Hpa Ⅱ /MspI + TAA EcoRI + AAC，EcoRI + AAG，EcoRI + ACT，EcoRI + ACA，EcoRI + AGT，EcoRI + ATT
Hpa Ⅱ /MspI + TAG EcoRI + AAC，EcoRI + AAG，EcoRI + ACT，EcoRI + ACA，EcoRI + AGT，EcoRI + ATT
1. 2. 3 MSAP 的预扩增、选择性扩增和电泳 预扩
增使用 50 ng(3 μL)酶切连接产物作为模板，25 μL
PCR反应体系含有 0. 2 μmol·L －1 EcoRI 和 Hpa Ⅱ /
MspI预扩增引物(EcoRI + 0，HpaII /MspI + 0) (表
1) ，1 × PCR buffer，1. 5 mmol·L －1 MgCl2，0. 2 mmol·
L －1 dNTP，2 U Taq 酶(Fermentas)。PCR 扩增程序
为 94 ℃ 3 min;然后 94 ℃ 30 s，56 ℃ 40 s，72 ℃
60 s共 23 个循环;72 ℃ 延伸 10 min。
预扩产物用 0. 1 × TE 溶液稀 20 倍，取 1 μL
作为选择扩增的模板 DNA。选择性扩增引物对采
用 EcoRI + 3 个选择性碱基和 Hpa Ⅱ /MspI + 3 个选
择性碱基组成(表 1)。选择性扩增 PCR 反应体系
和预扩增 PCR反应体系相同。PCR 扩增程序为 94
℃ 60 s，接下来 94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，每
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个循环退火温度降低 0. 7 ℃，执行 12 个循环;接着
在 94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s扩增 23 个循环;
最后 72 ℃延伸 10 min。
选择性扩增扩增产物加入等体积甲酰胺变性加
样液(98%甲酰胺，10 mmol·L －1 EDTA，0. 025% 溴
酚兰和二甲苯青-FF)95 ℃变性 5 min，迅速至于冰
上。变性的 PCR产物用 6%的变性聚丙烯酰胺凝胶
(含 7. 5 mol·L －1尿素)65 W恒功率电泳 2 h。PAGE
胶的银染按照标准程序。
1. 2. 4 MSAP 数据统计 为保证结果的真实可靠，
每个样本进行 2 次重复实验。重复实验从 DNA 样
品双酶切开始，然后进行预扩增———选择性扩
增———PAGE胶电泳———条带统计。只选取重复实
验一致性强的引物组合所扩增的条带进行统计分
析。每次实验都设置无 DNA模板的阴性对照，避免
样品的污染或引物二聚体扩增而得到的假条带。仅
选择 PAGE胶中部分辨率高的条带统计，对于顶部
和底部分辨率低的条带不进行统计。按照 PAGE 胶
上同一水平位置上条带的有无进行统计，有条带的
记为“1”，无条带的记为“0”，获得原始“0-1”矩阵。
对“0-1”矩阵进行比对，分析高温胁迫前后 DNA 甲
基化状态的差异。
2 结果与分析
2. 1 高温胁迫下菘蓝基因组 DNA甲基模式分析
根据 MSAP带纹模式在高温胁迫前后的对应关系，
MSAP带纹模式可以分为两个大类。第一类是没有
发生 DNA 甲基化的改变(methylation additive) ，这
一类带纹可以进一步分为未甲基化位点、单链外侧
甲基化位点和双链内侧甲基化位点 3 个类型(A1-
A3)。第二类是高温胁迫前后带纹模式发生改变，
即 DNA 甲基化状态发生改变(methylation non-
additive) ，DNA甲基化状态改变的类群又可以进一
步分为发生超甲基化(hypermethlation)的位点(H1-
H4)和发生去甲基化(demethylation)的位点(D1-
D5) ，见表 2。
表 2 高温胁迫前后菘蓝 DNA甲基化模式比较
甲基化状态 类型
MSAP带型*
对照(CK) 高温(HT)
Hpa Ⅱ MspI Hpa Ⅱ MspI
甲基化改变
甲基化无变化
A1 + + + + 1 070
A2 + － + － 75
A3 － + － + 385
甲基化改变
H1 + + － － 39 Hyper-
H2 + + － + 9 Hyper-
H3 － + － － 4 Hyper-
H4 + － － － 6 Hyper-
D1 － + + + 12 De-
D2 + － + + 3 De-
D3 － － + + 4 De-
D4 － － － + 1 De-
D5 － － + － 4 De-
注:+为有带，－为无带;Hpa Ⅱ代表 EcoRI-Hpa Ⅱ酶切;MspI代表 EcoRI-MspI酶切;Hyper-代表超甲基化;De-代表去甲基化。
36 对选择性引物组共扩增得到 1 612 条清晰的
条带(表 2) ，其中 1 070 个 CCGG 位点未发生甲基
化的修饰(A1) ，75 个位点发生了单链外侧甲基化
(A2) ，385 个位点发生了双链内侧甲基化(A3) ，这
些位点在高温胁迫前后 DNA 甲基化状态没有发生
改变。
共检测到 82(5. 1%)个 CCGG位点在高温胁迫
后发生了甲基化状态的改变，其中 58(3. 6%)个位
点发生了超甲基化(H1-H4) ，24(1. 5%)个位点发
生了去甲基化(D1-D5) (表 2)。H1 类群是发生
DNA超甲基化改变的主要类群，占到了超甲基化改
变的 67. 2%。去甲基化改变的主要类群是 D1，占
到了去甲基化改变的 50%。此外，共检测到 21 个
CCGG位点发生双链内侧甲基化(H2 和 D1)的改
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杨飞，等:温度对菘蓝基因组 DNA甲基化的影响
变，3 个 CCGG位点发生单链外侧甲基化(D2)变化
的位点。由此可见，高温胁迫能引发菘蓝基因组
DNA甲基化模式的改变，且存在着主要的 DNA 甲
基化模式的改变类型，双链内侧甲基化位点发生改
变的数目要比单链外侧甲基化位点数目多。
3 讨论
目前，对道地药材遗传多样性［16］、分子鉴定、居
群遗传分化及进化遗传学的研究表明道地药材与种
内其他非道地药材遗传本质区别主要表现为居群内
基因型频率的改变，在个体水平表现为微效多基因
控制的数量遗传性状［3］。同时，以丹参为模型，研
究了道地药材形成过程中遗传与环境因子的相互作
用［17］，对道地药材形成分子机制进行了部分阐明。
但这些研究都没有考虑到药材形成过程中的表观遗
传机制。
DNA甲基化修饰是调控基因表达的一种重要
方式。研究发现，各种环境胁迫都能导致植物基因
组发生 DNA甲基化模式、组蛋白共价修饰的改变，
调节一些基因的转录，从而增强其逆境胁迫下的适
应性［12-13，18-19］。本研究发现高温能引起菘蓝基因组
DNA甲基化模式的改变，这暗示环境生态因子可能
会通过表观遗传调控机制调节中药材基因的表达，
从而对其品质的形成产影响。同时，菘蓝基因组
DNA甲基化模式的变化到底引起了哪些基因转录
改变是需要进一步研究的问题。
本研究虽然在揭示了逆境胁迫下菘蓝基因组表
观遗传的部分变化，但这些是实验室的结果。只有
深入比较道地与非道地产区板蓝根药材的表观遗传
组的差异及其与品质的关联性，结合代谢组学［20］等
结果才能明确表观遗传修饰是否参与了道地药材形
成的逆境效应理论。
［参考文献］
［1］ 肖小河，陈士林，黄璐琦，等．中国道地药材研究 20
年概论［J］．中国中药杂志，2009，34(5) :519.
［2］ 肖培根，王永炎．加速中药研究的创新步伐［J］．中国
中药杂志，2010，35(16) :2047.
［3］ 黄璐琦，郭兰萍，胡娟，等．道地药材形成的分子机
制及其遗传基础［J］． 中国中药杂志，2008，33
(20) :2303.
［4］ 曾燕，郭兰萍，杨光，等．环境生态因子对药用植物
皂苷成分的影响［J］． 中国实验方剂学杂志，2012，
18(17) :309.
［5］ 程若敏，梁晓乐，陈少容，等．药用银花环境因子特
性研究概况［J］． 中国实验方剂学杂志，2011，17
(3) :232.
［6］ 谷巍，巢建国，刘训红，等．安徽道地药材牡丹皮高
效毛细管电泳指纹图谱研究［J］．中国实验方剂学杂
志，2011，17(17) :58.
［7］ 邵林，郭庆梅，冉蓉，等． 济南．山东不同栽培品种金
银花 HPLC 指纹图谱的比较［J］．中国实验方剂学杂
志，2011，17(19) :117.
［8］ 赵曼茜，吕金嵘，郭兰萍，等．土壤无机元素对黄芩
无机元素及黄芩苷含量的影响［J］．中国实验方剂学
杂志，2010，16(9) :103.
［9］ 王甫成，时维静．不同采收年限亳白芍中芍药苷含量
的变化［J］． 中国实验方剂学杂志，2011，17
(23) :51.
［10］ 郭兰萍，黄璐琦，阎洪，等．基于地理信息系统的苍
术道地药材气候生态特征研究［J］． 中国中药杂志，
2005，30(8) :565.
［11］ 黄璐琦，郭兰萍．环境胁迫下次生代谢产物的积累及
道地药材的形成［J］． 中国中药杂志，2007，32
(4) :277.
［12］ Boyko A，Kovalchuk I． Epigenetic control of plant stress
response［J］． Environ Mole Mutage，2008，49(1) :61.
［13］ Chinnusamy V，Zhu J K． Epigenetic regulation of stress
responses in plants［J］． Curr Opin Plant Biol，2009，12
(2) :133.
［14］ 杨飞，李立家．菘蓝 rDNA 及端粒多色荧光原位杂交
分析［J］．中草药，2011，42(5) :972.
［15］ 刘盛，谢华，乔传卓．板蓝根药材道地性初步研究总
结［J］．中药材，2001，24(5) :319.
［16］ 李贝宁，南博，刘春生，等．道地产区甘草遗传多样
性的 ISSR 分析［J］．中国实验方剂学杂志，2010，16
(12) :90.
［17］ Yang Y，Hou S，Cui G， et al． Characterization of
reference genes for quantitative real-time PCR analysis
in various tissues of Salvia miltiorrhiza［J］． Molecular
Biol Rep，2010，37(1) :507.
［18］ Yang F，Zhang L，Li J，et al． Trichostatin A and 5-
azacytidine both cause an increase in global histone H4
acetylation and a decrease in global DNA and H3K9
methylation during mitosis in maize［J］． BMC Plant
Biol，2010，10(1) :178.
［19］ Tsuji H，Saika H，Tsutsumi N，et al． Dynamic and
reversible changes in histone H3-Lys4 methylation and
H3 acetylation occurring at submergence-inducible genes
in rice［J］． Plant Cell Physi，2006，47(7) :995.
［20］ 苏桃，陆兔林，毛春芹，等．代谢组学与中医药现代
化研究［J］． 中国实验方剂学杂志，2011，17
(7) :247.
［责任编辑 邹晓翠］
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