全 文 ：第４２卷　第６期 陕西师范大学学报（自然科学版） Ｖｏｌ．４２　Ｎｏ．６
　２０１４年１１月 Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｈａａｎｘｉ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ） Ｎｏｖ．，２０１４　
文章编号：１６７２－４２９１（２０１４）０６－００６６－０５
收稿日期：２０１４－０７－２５
基金项目：国家自然科学基金资助项目（３１２００２２１）；中央高校基本科研业务费专项资金项目（ＧＫ２０１４０５００１）
第一作者：杨树，男，博士研究生，研究方向为菘蓝转录组以及次生代谢．Ｅ－ｍａｉｌ：ｂｉｇｔｒｅｅ＿５３０８８１６＠１６３．ｃｏｍ
　＊通信作者：李焘，女，副教授，博士．Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｔａｏ＠ｓｎｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
菘蓝色氨酸合成酶基因的克隆与生物信息学分析
杨　树，潘淑琴，张丽红，王喆之，李　焘＊
（药用资源与天然药物化学教育部重点实验室，西北濒危药材资源开发国家工程实验室，
陕西师范大学 生命科学学院，陕西 西安７１０１１９）
摘　要：对菘蓝色氨酸合成酶基因ＩｉＴＳＡ进行克隆，并对其进行生物信息学分析．结果表明：菘蓝
ＩｉＴＳＡ基因全长２　１１１ｂｐ，包含８个外显子和７个内含子；ｃＤＮＡ全长１　０３５ｂｐ，编码３１１个氨基
酸，编码的蛋白定位在叶绿体基质中，是一种无信号肽和跨膜结构域的疏水性蛋白；二级结构主要
由α－螺旋、β－转角、延伸链和不规则卷曲组成；序列比对结果显示，菘蓝ＩｉＴＳＡ核酸序列和氨基酸
序列与其他多种植物的ＴＳＡ核酸序列和氨基酸序列均具有较高的同源性．
关键词：菘蓝；靛蓝；色氨酸合成酶；生物信息学
中图分类号：Ｑ５１７；Ｑ９３．２　 文献标志码：Ａ
Ｇｅｎｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ
ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｆｒｏｍＩｓａｔｉｓ　ｉｎｄｉｇｏｔｉｃａ
ＹＡＮＧ　Ｓｈｕ，ＰＡＮ　Ｓｈｕｑｉｎ，ＺＨＡＮＧ　Ｌｉｈｏｎｇ，ＷＡＮＧ　Ｚｈｅｚｈｉ，ＬＩ　Ｔａｏ＊
（Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｐｌａｎｔ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　ａｎｄ　Ｎａｔｕｒａｌ
Ｐｈａｒｍａｃｅｎｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｆｏｒ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ
ｏｆ　Ｅｎｄａｎｇｅｒｅｄ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｃｒｕｄｅ　Ｄｒｕｇｓ　ｉｎ　Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ，Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，
Ｓｈａａｎｘｉ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ′ａｎ　７１０１１９，Ｓｈａａｎｘｉ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍＩｓａｔｉｓ　ｉｎｄｉｇｏｔｉｃａ　ｗａｓ　ｃｌｏｎｅｄ，ａｎｄ　ｉｔｓ　ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ　ｗｅｒｅ　ａｎａ－
ｌｙｚｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｆｕｌ　ｌｅｎｇｔｈ　ｏｆ　ＩｉＴＳＡｉｓ　２１１ｂｐ，ａｎｄ　ｉｔ　ｃｏｎｔａｉｎｓ　８ｅｘｏｎｓ　ａｎｄ　７ｉｎｔｒｏｎｓ；
ｃＤＮＡ　ｉｓ　１　０３５ｂｐ　ｉｎ　ｌｅｎｇｔｈ，ｃｏｄｉｎｇ　３１１ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ．Ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｉｓ　ａ　ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｌｏｃａｔｅｄ
ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ　ｓｔｒｏｍａ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｓｉｇｎａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　ｄｏｍａｉｎ．Ｔｈｅ　ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ
ＩｉＴＳＡｍａｉｎｌｙ　ｉｎｃｌｕｄｅｓ　ｔｈｅ　ａｌｐｈａ　ｈｅｌｉｘ，ｂｅｔａ　ｃｏｒｎｅｒ，ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ｃｈａｉｎｓ　ａｎｄ　ｉｒｒｅｇｕｌａｒ　ｃｕｒｌｙ．Ｔｈｅ　ｎｕｃｌｅｉｃ
ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ＩｉＴＳＡｈａｓ　ｈｉｇｈ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ＴＳＡ　ｉｎ　ｏｔｈｅｒ　ｐｌａｎｔｓ，ａｎｄ
ｔｈｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｌｓｏ　ｈａｓ　ｈｉｇｈ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｉｓａｔｉｓ　ｉｎｄｉｇｏｔｉｃａ；ｉｎｄｉｇｏ；ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ　ｓｙｎｔｈａｓｅ；ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ
　　菘蓝（Ｉｓａｔｉｓ　ｉｎｄｉｇｏｔｉｃａ　Ｆｏｒｔ）是十字花科（Ｃｒｕ－
ｃｉｆｅｒａｅ）菘蓝属（Ｉｓａｔｉｓ）两年生草本植物，主要分布
在河北、江苏、浙江、安徽等地；具有清热解毒、凉血
消斑的功效，是板蓝根、大青叶药材及其制剂的主要
来源［１］；其有效成分包括生物碱类、有机酸类、氨基
酸类、喹唑酮类、芥子苷类及腺苷、多糖等，其中靛蓝
为菘蓝主要的次生代谢产物之一，靛玉红是靛蓝的
同分异构体．
关于靛蓝在植物体内的合成过程一直都是植物
学家关注的热点和难点．目前，微生物合成靛蓝的过
程已经十分明确，而大量的文献研究也表明，植物中
靛蓝的合成过程与微生物相类似［１］．由色氨酸合成
途径产生的吲哚－３－甘油磷酸（ｉｎｄｏｌｅ－３－ＧＰ）在色氨
酸合成酶（ＴＳＡ）的催化下形成靛蓝的起始物质吲
　　第６期 杨树 等：菘蓝色氨酸合成酶基因的克隆与生物信息学分析 ６７　
哚［２］；吲哚在细胞色素Ｐ４５０单加氧酶（ＣＹＰ）的催
化下形成吲哚酚［３］；吲哚酚在 β－Ｄ－葡萄糖苷酶
（ＧＬＵ）的催化下形成一系列靛蓝的前体物质［４］，并
最终合成靛蓝类色素物质．因此，色氨酸合成酶
（ＴＳＡ）在靛蓝合成过程中扮演了十分重要的
角色［５－６］．
目前，关于菘蓝中靛蓝合成途径催化各步反应
的关键酶及其编码基因的功能研究鲜见报道，极大
地限制了利用生物技术手段提高靛蓝合成效率的进
程．因此，有必要深入开展菘蓝分子生物学的研究，
阐明相关基因在靛蓝类色素物质合成乃至其他一些
次生代谢产物的合成、积累及调控过程中的重要作
用．为此，我们以菘蓝转录组数据为基础，以菘蓝为
研究对象，克隆菘蓝色氨酸合成酶基因，并对其进行
生物信息学分析，以期进一步明确其生物学功能．
１　材料与方法
１．１　材料
菘蓝种子：采自陕西师范大学校园内，种于含蛭
石的营养钵中，放于人工气候箱（宁波江南仪器厂，
ＲＸＺ－５００Ｄ）中培养（温度２５±２℃，湿度４８％，光照
强度２１６μｍｏｌ／（ｍ
２·ｓ），光照时间１６ｈ／ｄ）．
菌株与载体：大肠杆菌ＤＨ５α；ＰＭＤ　１９－Ｔ　Ｓｉｍ－
ｐｌｅ　Ｖｅｃｔｏｒ购自ＴａＫａＲａ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公司．
试剂与药品：植物基因组 ＤＮＡ 提取试剂盒；
ＤＮＡ凝胶回收试剂盒；ＤＬ２０００，２×Ｔａｑ　ＰＣＲ　Ｍａｓ－
ｔｅｒ　Ｍｉｘ，ｄｄＨ２Ｏ；ＬＢ培养基（固、液体），１×ＴＡＥ缓
冲液，溴化乙锭（ＥＢ），氨苄青霉素等．
１．２　实验方法
１．２．１　ＩｉＴＳＡ引物的设计 采用本实验室已经建
立的菘蓝转录组数据库信息，利用ＤＮＡＳｔａｒ软件寻
找菘蓝色氨酸合成酶 Ｕｎｉｇｅｎｅ序列的开发阅读框，
发现该 Ｕｎｉｇｅｎｅ序列具有完整的开放阅读框．经
ＮＣＢＩ氨基酸比对发现，该Ｕｎｉｇｅｎｅ为ｃＤＮＡ全长，
比对结果如图１所示．
图１　已知Ｕｎｉｇｅｎｅ序列氨基酸比对结果
Ｆｉｇ．１　Ｕｎｉｇｅｎｅ　ｋｎｏｗｎ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｒｅｓｕｌｔｓ
利用软件Ｐｒｉｍｅｒ　ｐｒｅｍｉｅｒ　５．０在已知 Ｕｎｉｇｅｎｅ
序列的开放阅读框之外设计引物 ＴＳＡ－Ｒ：５′－ＴＧ－
ＣＡＧＴＡＴＣＣＡＴＡＧＣＴＴＣＴＴＡＣ－３′，ＴＳＡ－Ｆ：５′－
ＣＡＣＡＡＴＣＡＡ　ＧＡＡＴＧＡＴＴＴＣＴＧＣ－３′，并 合 成
（北京奥科鼎盛生物科技有限公司）［７－８］．
１．２．２　菘蓝基因组ＤＮＡ的提取　参照Ｂｉｏｓｐｉｎ植
物基因组ＤＮＡ提取试剂盒进行．
１．２．３　菘蓝色氨酸合成酶基因的克隆　ＩｉＴＳＡ的
克隆主要包括ＰＣＲ的扩增、扩增产物的电泳检测、
凝胶回收、Ｔ载体的连接、回收产物转化到大肠杆菌
ＤＨ５α感受态细胞以及阳性克隆的挑选等过程．
１．２．４　菘蓝色氨酸合成酶基因的生物信息学分析
　利用 ＤＮＡＳｔａｒ软件和ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．
ｎｉｈ．ｇｏｖ．／；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／；ｈｔｔｐ：／／
ｐｓｏｒｔ．ｈｇｃ．ｊｐ／；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／；ｈｔｔｐ：／／
ｃｎ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／等网站提供的各类生物信息学分析
软件对菘蓝色氨酸合成酶基因的核酸序列和编码的
氨基酸序列进行在线分析［７］．开放阅读框的查找、核
酸序列和氨基酸序列的组成、蛋白质的理化性质、亲
水性／疏水性、信号肽、跨膜结构域、亚细胞的定位、
二级结构和三级结构的分析分别用ＤＮＡＳｔａｒ软件
和在 线 工 具 ＣｌｕｓｔａｌＷ２、ＢｌａｓｔＸ、ＥｘＰＡＳｙ　Ｐｒｏｔ－
Ｐａｒａｍ、ＰｒｏｔＳｃａｌｅ、ＳｉｇｎａｌＰ　３．０Ｓｅｒｖｅｒ、ＴＭＨＭＭ、
ＰＳＯＲＴ、ＳＯＰＭＡ和ＥＳｙＰｒｅｄ３Ｄ进行分析．核酸序
列和氨基酸序列的同源性分别用 Ｂｌａｓｔ和 Ｃｌｕｓｔ－
ａｌＷ２进行分析．
２　结果与讨论
２．１　ＩｉＴＳＡ的克隆和结构分析
根据已知的 Ｕｎｉｇｅｎｅ到 ＮＣＢＩ进行比对，该
Ｕｎｉｇｅｎｅ为ｃＤＮＡ 全长，利用 ＤＮＡＳｔａｒ５．０寻找
ｃＤＮＡ的开放阅读框，在开放阅读框外设计引物，以
菘蓝基因组ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，获得该基
因的全长．分析发现，ｃＤＮＡ全长１　０３５ｂｐ，包含５′
端非编码区４２ｂｐ、３′端非编码区５７ｂｐ和一个９３６
ｂｐ的开放阅读框，编码３１１个氨基酸；ＩｉＴＳＡ 全长
为２　１１１ｂｐ，包括８个外显子和７个内含子，这与欧
洲菘蓝和玉米一样［５－６］，且每个内含子的两端具有内
含子的保守序列ＧＴ／ＡＧ，符合典型的ＧＴ－ＡＧ规则
（见图２）．利用在线工具ＥｘＰＡＳｙ　Ｐｒｏｔｐａｒａｍ预测
显示：ＩｉＴＳＡ编码的氨基酸序列分子量为３２．９２２　１
ｋＤａ，理论等电点６．７６．经在线工具ＰＳＯＲＴ分析，
ＩｉＴＳＡ定位在叶绿体基质中的可能性最大，这与拟
南芥中ＴＳＡ的定位一致［７］．
６８　 陕西师范大学学报（自然科学版） 第４２卷
图２　ＩｉＴＳＡ的全长及其推导的氨基酸序列
Ｆｉｇ．２　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ＩｉＴＳＡａｎｄ　ｔｈｅ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ
起始密码子和终止密码子用下划线标出，内含子和
非编码区均用小写字母表示，外显子用大写字母表
示，氨基酸位于对应的密码子下方．
２．２　ＩｉＴＳＡ的疏水性／亲水性分析
疏水性是指氨基酸远离周围水分子，包埋进蛋
白质核心的相对趋势，是蛋白质三维空间构象的影
响因素之一［９］．疏水性和亲水性的分析，对蛋白质高
级结构的预测和功能结构域的分析有重要意义．用
在线工具Ｐｒｏｔｓｃａｌｅ对ＩｉＴＳＡ氨基酸序列的疏水性
和亲水性进行预测，结果如图３所示．７５～１７５之间
为明显的疏水区域，２７０～２８０之间疏水性最强，无
明显的亲水区域，整条肽链表现为疏水性．再经Ｅｘ－
ＰＡＳｙ　ＰｒｏｔＰａｒａｍ 预测显示ＩｉＴＳＡ 编码的氨基酸
ＧＲＡＶＹ（Ｇｒａｎｄ　Ａｖｅｒａｇｅ　ｏｆ　Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ，即总
平均亲水性）值为０．１１７，因此，ＩｉＴＳＡ为疏水蛋白．
图３　ＩｉＴＳＡ疏水性／亲水性的预测
Ｆｉｇ．３　Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ／ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ＩｉＴＳＡ
２．３　ＩｉＴＳＡ信号肽分析
信号肽是与蛋白分选相关的信号序列，均含有
一段或几段特殊的氨基酸序列，可用于引导蛋白质
进入细胞的特定部位，通常位于蛋白质的氨基端，一
般由１５～３０个氨基酸残基组成，在信号肽的中部有
一段疏水核心区［１０］．信号肽的预测和分析，对分析
和理解蛋白质在细胞中的定位及分选有着重要的参
考价值．用ＳｉｇｎａｌＰ　３．０Ｓｅｒｖｅｒ对ＩｉＴＳＡ 氨基酸序
列的信号肽进行预测，结果如图４所示．分析结果发
现ＩｉＴＳＡ不具有信号肽．据此推测，ＩｉＴＳＡ合成后，
不进行蛋白质的转运，直接在合成部位发生作用．
图４　ＩｉＴＳＡ信号肽的预测
Ｆｉｇ．４　Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｓｉｇｎａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｏｆ　ＩｉＴＳＡ
２．４　ＩｉＴＳＡ跨膜结构域预测
跨膜结构域是内在膜蛋白与膜脂相结合的主要
部位，一般由２０个左右的疏水氨基酸残基组成，形
成α螺旋（长度约３．２ｎｍ），其外部疏水侧链通过范
德华力与脂双层分子脂肪酸链相互作用［１０］．跨膜结
构域的预测和分析，有助于分析蛋白质的结构、种
类、功能和定位．用ＴＭＨＭＭ２．０Ｓｅｒｖｅｒ对ＴＳＡ氨
基酸序列的跨膜结构域进行预测，结果如图５所示．
ＩｉＴＳＡ具有跨膜结构域的可能性很小，推测不具跨
膜结构域，不属于跨膜蛋白．
２．５　ＩｉＴＳＡ高级结构预测
蛋白质的高级结构决定了其生物学功能，而高
级结构又取决于蛋白质的氨基酸序列．多肽链借助
氢键排列成沿一维方向有规则的二级结构，二级结
构借助范德华力、氢键、离子键和疏水作用等形成蛋
　　第６期 杨树 等：菘蓝色氨酸合成酶基因的克隆与生物信息学分析 ６９　
图５　ＩｉＴＳＡ跨膜结构域的预测
Ｆｉｇ．５　Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｔｒａｎｓｅｍｂｒａｎｅ　ｄｏｍａｉｎ　ｂｙ　ＴＭＨＭＭ　２．０ｓｅｖｅｒ
白质的三级结构，从而发挥正常的生物学功能［１０］．
因此，蛋白质高级结构的预测和分析，对认识蛋白质
结构和功能之间的关系有着重要意义．用ＳＯＰＭＡ
对ＩｉＴＳＡ氨基酸序列的二维结构进行预测，结果表
明，ＩｉＴＳＡ由４３．４１％的α－螺旋、１６．７２％的延伸链、
７．７２％的β－转角和３２．１５％的无规则卷曲构成．从
整个蛋白质的结构分析，α－螺旋和无规则卷曲是
ＩｉＴＳＡ的主要结构元件，β－转角和延伸链散布于整
个蛋白质．
氨基酸序列相似的蛋白质，它们的三维结构也
相似［１１］．用ＥＳｙＰｒｅｄ３Ｄ在线同源建模法构建ＩｉＴ－
ＳＡ的三级结构，结果见图６．该模型以玉米中的
ＢＸ１（吲哚合酶）的三维结构为模板构建，二者的相
似性为５０．８％，其结构模型显示，整个三级结构呈
“桶状”，ＩｉＴＳＡ 主要由１０个α－螺旋和一些无规则
卷曲构成，这与二级结构的预测结果一致．
图６　ＩｉＴＳＡ三维结构的预测
Ｆｉｇ．６　Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｔｈｅ　ｔｈｒｅｅ　ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｍｏｄｅｌ
ｏｆ　ＩｉＴＳＡｂｙ　Ｅｓｙｐｒｅｄ　３Ｄ
２．６　不同物种间ＴＳＡ的核酸序列及其推导的氨基
酸序列的同源性分析
运用ＮＣＢＩ上的Ｂｌａｓｔｎ程序对ＩｉＴＳＡ 的核酸
序列进行比对．比对结果表明，ＩｉＴＳＡ 的核酸序列
和欧洲菘蓝（Ｉｓａｔｉｓ　ｔｉｎｃｔｏｒｉａ，ＡＪ８４１７０５．１）、拟南芥
（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ，Ｕ１８９９３．１）的一致性较高，
分别为９６％、８７％；用 Ｂｌａｓｔｐ程序以及在线工具
ＣｌｕｓｔａｌＷ２对ＩｉＴＳＡ 编码的氨基酸进行序列同源
性分析，结果显示ＩｉＴＳＡ编码的氨基酸与多种植物
ＴＳＡ 编码的氨基酸序列均具有较高同源性（见图
７），与欧洲菘蓝（Ｉｓａｔｉｓ　ｔｉｎｃｔｏｒｉａ，ＣＡＨ５６４７７）、拟南
芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ，ＡＡＭ６５５２６）、琴叶拟南
芥 （Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｌｙｒａｔａ　ｓｕｂｓｐ．ｌｙｒａｔａ，ＸＰ ＿
００２８７７９９２）、蓖 麻 （Ｒｉｃｉｎｕｓ　ｃｏｍｍｕｎｉｓ，ＸＰ ＿
００２５２０９７５）、玉米（Ｚｅａ　ｍａｙｓ，ＮＰ＿００１１２３５９２）、花生
（Ａｒａｃｈｉｓ　ｈｙｐｏｇａｅａ，ＡＢＩ８４２５９）等的一致性分别
为：９８％、９２％、９０％、７２％、６９％、７５％，其中与欧洲
菘蓝的同源性最高达９８％，说明本次实验克隆出的
基因确实为菘蓝色氨酸合成酶基因．
３　结论
色氨酸是菘蓝中靛蓝合成的基础，而色氨酸合
成酶是菘蓝中靛蓝合成过程中的关键酶，目前关于
色氨酸合成酶基因的研究还较少，在植物中仅见于
拟南芥、欧洲菘蓝、玉米等．本实验根据已知 Ｕｎｉ－
ｇｅｎｅ利用ＰＣＲ技术获得了ＩｉＴＳＡ 全长，它与同属
植物欧洲菘蓝和玉米一致，与拟南芥等物种中色氨
酸合成酶基因的长度接近，且有较高的一致性．
ＩｉＴＳＡ的克隆和功能分析可为进一步揭示靛蓝次
生代谢途径奠定基础．
参考文献：
［１］Ｓｈｅｌｄｏｎ　Ｒ　Ａ，Ａｒｅｎｄｓ　Ｉ，Ｈａｎｅｆｅｌｄ　Ｕ．Ｇｒｅｅｎ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ａｎｄ　ｃａｔａｌｙｓｉｓ［Ｍ］．Ｂｅｒｌｉｎ：Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ　Ｖｅｒｌａｇ　ＧｍｂＨ　＆
Ｃｏ．ＫＧａＡ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，２００７：３５３－３５５．
［２］Ｆｒｅｙ　Ｍ，Ｃｈｏｍｅｔ　Ｐ，Ｇｌａｗｉｓｃｈｎｉｇ　Ｅ，ｅｔ　ａｌ．Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａ
ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｐｌａｎｔ　ｄｅｆｅｎｓｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｉｎ　ｇｒａｓｓｅｓ［Ｊ］．Ｓｃｉ－
ｅｎｃｅ，１９９７，２７７：６９６－６９９．
［３］Ｗａｒｚｅｃｈａ　Ｈ，Ｆｒａｎｋ　Ａ，Ｐｅｅｒ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ
ｉｎｄｉｇｏ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　ｉｎｄｉｃａｎ　ｉｎ　ｇｅｎｅｔｉｃａｌｙ　ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ　ｔｏｂａｃ－
ｃｏ　ｐｌａｎｔｓ　ａｎｄ　ｃｅｌ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｊｏｕｒ－
ｎａｌ，２００７，５：１８５－１９１．
［４］Ｍａｕｇａｒｄ　Ｔ，Ｅｎａｕｄ　Ｅ，Ｃｈｏｉｓｙ　Ｐ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ
ａｎ　ｉｎｄｉｇｏ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　ｆｒｏｍ　ｌｅａｖｅｓ　ｏｆ　Ｉｓａｔｉｓ　ｔｉｎｃｔｏｒｉａ
（Ｗｏａｄ）［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００１，５８：８９７－９０４．
［５］Ｐａｐａｎａｓｔａｓｉｏｕ　Ｍ，Ａｌｅｎ　Ｎ　Ｓ，ＭｃＭａｈｏｎ　Ａ，ｅｔ　ａｌ．Ａｎａｌ－
ｙｓｉｓ　ｏｆ　ｉｎｄｉｇｏ－ｔｙｐｅ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　ｉｎ　ｎａｔｕｒａｌ　ｄｙｅｓ　ｂｙ　ｎｅｇａ－
ｔｉｖｅ　ｉｏｎ　ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ　ｐｈｏｔｏｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃ－
ｔｒｏｍｅｔｒｙ［Ｊ］．Ｄｙｅｓ　ａｎｄ　Ｐｉｇｍｅｎｔｓ，２０１２，９２ （３）：
１１９２－１１９８．
［６］欧阳剑，李家洋．拟南芥色氨酸与吲哚乙酸生物合成的
研究进展［Ｊ］．生物工程进展，１９９８，１８（２）：２－１１．
［７］Ｓａｌｖｉｎｉ　Ｍ，Ｂｏｃｃａｒｄｉ　Ｔ　Ｍ，Ｓａｎｉ　Ｅ，ｅｔ　ａｌ．Ａｌｐｈａ－ｔｒｙｐｔｏ－
ｐｈａｎ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｏｆ　Ｉｓａｔｉｓ　ｔｉｎｃｔｏｒｉａ：ｇｅｎｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｅｘ－
ｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００８，
４６：７１５－７２３．
［８］丁超．实时荧光定量ＰＣＲ应用及实验条件优化［Ｊ］．大
７０　 陕西师范大学学报（自然科学版） 第４２卷
图７　菘蓝ＴＳＡ与其他几种植物的ＴＳＡ的同源性比对
Ｆｉｇ．７　Ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｉｎ　ＩｉＴＳＡａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ｓｐｅｃｉｅｓ
　　连医科大学学报，２００７，２９（４）：４０４－４０７．
［９］李铮，王喆之．植物萜类合成酶１－脱氧－Ｄ－木酮糖－５－磷
酸还原异构酶的分子结构特征与功能预测分析［Ｊ］．植
物研究，２００７，２７（１）：５９－６７．
［１０］翟中和，王喜忠，丁明孝．细胞生物学［Ｍ］．３版．北京：
高等教育出版社，２００７：８８－９０．
［１１］王镜岩，朱圣庚，徐长法，等．生物化学（上册）［Ｍ］．３
版．北京：高等教育出版社，２００２：１５７－１８１．
〔责任编辑　王　勇〕