全 文 ：第 25卷第 5期
2007年 9月 干 旱 地 区 农 业 研 究Agricultural Research in the Arid Areas Vol.25 No.5Sept.2007
　
收稿日期:2006-12-24
基金项目:陕西师范大学 2004～ 2006年重点基金资助
作者简介:周西坤(1983—),男 ,研究方向为植物抗性生理生化。
　　　＊通讯作者:俞嘉宁 , E-mail:jnyu@snnu.edu.cn.
不同处理下菘蓝苗中
IAA 和靛玉红含量分析及合成部位研究
周西坤 ,俞嘉宁＊ ,王　剑 ,杨根生 ,陈雅男
(陕西师范大学生命科学学院 , 陕西西安 710062)
　　摘　要:自然干旱 、20 mmol/ L ABA、4℃低温处理培养 30 d 的菘蓝组培苗 , 不同时间内取样 , 用高效液相色谱
法测定其中 IAA的含量。结果表明:干旱处理菘蓝组培苗在 12 h 内能提高其 IAA 含量 242.04%～ 262.87%;ABA
处理与干旱处理有相似结果;低温胁迫处理 24 h也能提高 IAA 含量 503.87%。此外用高效液相色谱法测定了生
长一个半月的菘蓝实生苗中 IAA 和靛玉红含量。结果为:花中 IAA 含量大于根中 , 叶中没有;靛玉红则在叶中最
多 ,花中次之 , 根中最少;初步表明菘蓝中 IAA和靛玉红虽然具有类似的分子结构 ,且逆境胁迫处理都可使其含量
增加 ,但在植物体中的产生部位有差异。
关键词:菘蓝;IAA;靛玉红;逆境胁迫;HPLC 图谱
中图分类号:S567.23+9　　文献标识码:A　　文章编号:1000-7601(2007)05-0160-05
　　菘蓝 ,又称草大青 ,属十字花科菘蓝属二年生
植物 ,是我国南北各地广为栽培的一种药用植物 ,
是常用中药板蓝根和大青叶的主要来源 。板蓝根和
大青叶两者都有清热解毒 、凉血消斑的功效[ 1] 。菘
蓝含有靛玉红(Indirubin),其为吲哚类衍生物 ,是板
蓝根和大青叶的有效成分 。但其在植物体内不同部
位的表达情况及合成途径仍有待深入研究。
近年来 ,发现 IAA和靛玉红有相似的分子结构
式(如图 1所示), IAA主要通过色氨酸※吲哚丙酮
酸或色氨※吲哚乙醛※IAA 途径合成 ,靛玉红的合
成是否也通过此途径亦或可由 IAA 进一步生成还
需要试验的证实 。
我们曾用干旱 、脱落酸(ABA)、低温不同时间胁
迫处理培养 30 d的菘蓝组培苗 ,通过高效液相色谱
法测量其中的靛玉红含量 ,结果表明一定范围的
ABA和逆境胁迫处理可促使菘蓝组培苗靛玉红含
量增加[ 2] 。本文中我们进一步用干旱 、脱落酸
(ABA)、低温不同时间处理菘蓝组培苗 ,测定其 IAA
含量 ,结果表明上述胁迫处理也可促使 IAA 含量增
加 ,而且与靛玉红有相似的变化趋势 ,初步表明靛玉
红可能与 IAA 具有相似的合成途径。但通过测定
生长了一个半月的菘蓝实生苗不同部位根 、茎 、叶 、
花中的 IAA和靛玉红的含量 ,表明两者在植物体中
的主要合成部位不同 。
图 1　IAA和靛玉红分子结构
Fig.1　Molecule structure of IAA and indirubin
1　材料与方法
1.1　菘蓝苗的栽培与处理
菘蓝组培苗的培养与处理参照文献[ 2]方法。
菘蓝大苗为生长了一个半月的实生苗 ,其栽培方法
参照文献[ 3] 。
1.2　仪器与药品
靛玉红 、IAA含量测定采用日本岛津公司 SHI-
MADZU LC-2010A 高效液相色谱系统 。靛玉红
对照品(中国药品生物制品鉴定所 , 717-200204);
IAA对照品(SIGMA 原装);甲醇 、乙腈(科密欧公
司 ,色谱纯)。
1.3　对照品溶液和样品供试液的制备
1.3.1　靛玉红对照品溶液和样品供试液的制备　
参照段飞等方法[ 2] 。
1.3.2　IAA 对照品溶液和样品供试液的制备　对
照品溶液的制备:准确称取 IAA 对照品 10 mg 置
100 ml容量瓶中 ,用流动相:甲醇∶乙腈∶水=10∶20
∶70 溶解至刻度定容 ,充分混匀 , 制成 1 μg/ml的
IAA对照品溶液 ,备用。
样品供试液的制备 ,参照文献[ 4 , 5] 的提取 、分
离 、纯化方法 ,并加以改进 ,即:准确称取经各胁迫处
理制得的粗粉 0.2 g;样品在 4℃用 80%预冷甲醇
100 ml浸提 24 h ,收集浸提液;将收集的全部浸提
液进行抽滤 , 滤渣用 80%甲醇的水溶液重复洗 3
次 ,合并全部滤液;将其在-20℃下放置 1 h ,使水
相冻结;取出室温溶解;8 000 rpm 离心10 min;加入
等体积的石油醚 ,萃取 3次 ,取水相。用 HCL 溶液
调pH 2.8 ～ 3.0;用乙酸乙酯萃取 ,收集上层的酯
相 ,将下层的酸水相继续萃取 ,共萃取 3 次;将酯相
于(35℃～ 40℃)下浓缩蒸干 ,加流动相溶出 ,并定容
至 5 ml ,0.22μm 微孔滤膜过滤 ,得到内源激素的提
取液 。
1.4　色谱条件
1.4.1　IAA 检测条件　色谱柱:M ICROSORB-
MV 100A(C18)色谱柱(250 mm ×5.5 mm);柱温:
室温;流动相:甲醇∶乙腈∶水=10∶20∶70;检测波长:
270 nm;流速:0.6 ml/min。
1.4.2　靛玉红检测条件　色谱柱:M ICROSO RB-
MV 100A(C18)色谱柱(250 mm ×5.5 mm);柱温:
室温;流动相:甲醇∶水=70∶30;检测波长:290 nm;
流速:1.0 ml/min 。
2　结果与分析
2.1　标准曲线的制作
(1)制得的 1μg/mL的 IAA对照品溶液分别设
定 1 ,3 ,5 ,7 , 9 , 11μl仪器自动进样 ,记录色谱图(如
图 2),以对照品进样量对峰面积作图 ,得回归方程
如下:
Y =5.00×10-6X -1.1×10-2 , 　r=0.99945
表明 IAA 在 1 ～ 11 ng 范围内与峰面积呈良好的线
性关系。
(2)制得的 0.02 mg/mL的靛玉红对照品溶液
分别设定 1 ,3 , 5 ,7 , 9 , 11μl仪器自动进样 ,记录色谱
图(如图 3),以对照品进样量对峰面积作图 ,得回归
方程如下:
Y =1.00×10-4X +3.47×10-2 , 　r=0.99998 ,
表明靛玉红在 0.02 ～ 0.22 μg 范围内与峰面积呈良
好的线性关系 。
图 2　IAA 标准品及供试品的 HPLC 图谱
A.供试品;B.IAA 标准品
Fig.2　HPLC graph of standard IAA and trial sample
A.sample;B.standard IAA
图 3　靛玉红标准品及供试品的 HPLC 图谱
A.供试品;B.靛玉红标准品
Fig.3　HPLC graph of standard indirubin and trial sample
A.sample;B.standard indirubin
161第 5期　　 　　周西坤等:不同处理下菘蓝苗中 IAA和靛玉红含量分析及合成部位研究
2.2　精密度 、稳定性及回收率试验
以 10μl连续对 IAA 、靛玉红对照品自动进样 5
次 ,分别测得峰面积 ,结果表明精密度良好(数据未
出示)。
分别取浓度为 0.02 mg/mL 的靛玉红和 1 μg/
mL 的 IAA对照品溶液及 IAA 、靛玉红供试样品溶
液 10 μl间隔 1 h各自连续自动进样 8次 ,结果表明
对照品溶液在 8 h内稳定(数据未出示)。
准确量取 0.02 mg/ml靛玉红标准品溶液 2 m l
和 1 μ/ml IAA标准品溶液 100μl ,依照样品供试液
的制备和样品含量的测定项下处理 5份 ,计算平均
回收率 ,其结果如表 1所示。
数据显示 ,此测定方法保留时间较稳定 , 回收
率也基本符合微量分析要求 , 而且数据的变异度较
小 , 说明所选择的激素提取 、分离 、纯化的方法和
HPLC 色谱条件是可行的 。
表 1　回收率
Table 1　Results of recovery tests
加入靛玉红
Added indirubin(μg)
实测靛玉红
Obs indirubin(μg)
回收率
Recovery (%)
平均回收率
Average recovery(%)
RSD
(%)
40 38.511 96.28
40 38.89 97.22
40 36.32 90.80
40 37.96 94.90
40 36.78 91.95
94.23 2.93
加入 IAA
Added IAA(ng)
实测 IAA
Obs IAA(ng)
回收率
Recovery (%)
平均回收率
Average recovery(%)
RSD
(%)
100 78.98 78.98
100 79.62 79.62
100 80.34 80.34
100 76.45 76.45
100 79.89 79.89
79.06 1.95
2.3　干旱 、低温处理菘蓝组培苗中 IAA 含量测定
在光照培养箱内 25℃,光照强度 2 500 lx 的条
件下培养菘蓝组培苗 30 d ,将菘蓝幼苗从培养基中
取出 ,吸干水分 ,取 60株于光照培养箱中 25℃,光
照进行自然干旱处理 ,分别于 0 , 1.5 ,3 , 6 ,9 ,12 h取
样 ,液氮研磨 ,置于 40℃烘至干燥得样品干燥粗粉
(每处理设 3个重复),并按 1.3.2中方法制备 IAA
样品供试液。
将原先置于光照培养室菘蓝幼苗的培养瓶放置
在光照培养箱中 , 4℃±0.2℃光照培养 ,分别于 0 ,
6 ,9 , 12 , 24 , 36 h将幼苗小心从瓶内培养基中取出 ,
清水洗净苗上残留培养基 ,按与干旱处理相同的方
法制得 IAA样品供试液 。
将仪器自动进样量数值设定为 20 μl ,分别对已
制备的样品供试液进行进样测定 ,结果如图 4所示 ,
干旱胁迫处理的菘蓝组培苗 IAA 含量总体表现出
上升趋势 ,即处理 3 h后开始明显上升 ,至 9 h虽略
有下降 ,但处理 12 h 含量可达到最大值 413.01
ng/g(鲜重 ,下同),高出对照 242.04%。
低温处理的结果与干旱处理结果类似 ,表现出
先上升后下降 ,再上升的趋势 ,在 24 h 含量达到最
大值729.17 ng/g ,高出对照 503.87%,至 36 h又略
有下降。
图 4　干旱 、低温处理菘蓝 IAA 含量(n =3)
Fig.4　Content of IAA in drought and cold stress treated Isatis indigotica Fort .
A.自然干旱;B.低温处理(A.drought st ress;B.cold st ress)
162　　　　　　　　　　　　　　　　　　　干旱地区农业研究　　 　　　　　　　　　　　　　第 25卷
2.4　ABA处理菘蓝组培苗中 IAA含量的测定
将同样条件下培养 30 d 菘蓝幼苗小心从培养
基中取出 ,洗净其上的残留培养基 ,吸干水分 ,各取
60株分别放入 20 mmol/L 的 ABA 溶液中进行处
理 ,0 ,1.5 ,3 ,6 , 9 , 12 h 取样 ,按 2.3中的方法制得
IAA样品供试液。
将仪器自动进样量数值设定为 20μl ,对经 ABA
处理所得的样品供试液进行进样测定 ,结果如图 5
所示 , 20 mmol/L 的 ABA 溶液处理的菘蓝组培苗 ,
IAA含量随着胁迫时间的延长不断增加 ,至 12 h达
到最大值 438.155 ng/g ,高出对照 262.87%。
2.5　菘蓝实生苗不同部位 IAA 、靛玉红含量的测定
　　将生长一个月的菘蓝实生苗分根 、茎 、叶 、花采
收 ,分别将其粉碎 ,按2.3中的方法制得粗粉和 IAA
样品供试液 ,并按文献[ 2]中方法制得靛玉红样品供
试液 ,以研究菘蓝实生苗中 IAA和靛玉红的关系 ,
结果如图 6所示 , IAA 在花中可达到 124.302 ng/g
(鲜重 ,下同),根中为65.681 ng/g ,而叶茎中检测不
到 ,表明 IAA 主要分布在根和花中 ,且花中含量大
于根中含量;靛玉红在花 、根 、叶中均有分布 ,但叶中
最多 ,为 1 673.114 μg/g ,花中次之 ,根中再次之;而
在茎中检测不到。
图 5　ABA处理菘蓝 IAA含量
Fig.5　Content of IAA in ABA treated Isatis indigotica Fort .
图 6　不同部位 IAA和靛玉红含量(n=3)
Fig.6　Content of IAA and indirubin in different parts
A.IAA;B.Indirubin
3　讨　论
植物激素是植物自身合成的微量有机物 , 对植
物的生长发育具有重要的调节作用 。多种逆境条件
下植物体内源激素含量发生不同程度变化 , 进而影
响其生理过程[ 6] 。
本实验结果表明 ,干旱胁迫处理的菘蓝组培苗
IAA含量整体呈上升趋势 ,到 12 h达到最高 ,这一
现象可能是因为菘蓝苗在受到干旱胁迫处理后为适
应不利环境其体内代谢方式出现相应的调整 。20
mmol/L 的 ABA溶液处理的菘蓝组培苗 , IAA 含量
随着胁迫时间的延长不断增加 ,至 12 h 达到最大
值。ABA作为一种“胁迫激素” ,外源 ABA 的处理
使植物呈现的形态和生理反应上类似于逆境条件的
刺激 ,从而启动了植物体内一系列耐逆的生理生化
过程。冷冻处理的结果表现出先上升后下降 ,再上
升的趋势 ,在 24 h IAA含量达到最大值 ,至 36 h又
略有下降 。表明植物激素在植物抗寒力调控中起重
要作用 ,引起了某些与 IAA 合成有关酶的活性升
高。
此外 ,与我们以前的实验结果相比较 ,即:自然
干旱处理生长 30 d的菘蓝组培苗中靛玉红的含量
从 0 ～ 9 h 逐渐增加 ,达最大值 ,且在 12 h含量基本
保持恒定;而 20 mmol/L ABA处理 ,随时间的延长 ,
靛玉红含量表现出逐渐增加的趋势;4℃低温处理所
有处理时间点的靛玉红含量均高于对照 , 0到 9 h
菘蓝组培苗中靛玉红含量随低温胁迫时间的增加而
增加 ,但处理 12 、36 h时 ,靛玉红含量有所下降。表
明适当胁迫处理能有效提高菘蓝组培苗中靛玉红的
累积[ 2] 。本实验也证实 ABA 和胁迫处理可引起菘
蓝体内 IAA含量的增加。由于 IAA和靛玉红具有
类似的分子结构 ,推测二者的合成途径可能有相似
之处 ,ABA 、胁迫处理可能使合成它们所需的酶活性
上升 ,从而表现出在 ABA 和逆境胁迫处理下 IAA
163第 5期　　 　　周西坤等:不同处理下菘蓝苗中 IAA和靛玉红含量分析及合成部位研究
和靛玉红在菘蓝体内大量增加 ,且有相似的变化趋
势。
为进一步研究 IAA 和靛玉红合成部位是否相
同 ,分别测定菘蓝实生苗花 、根 、叶 、茎中 IAA 和靛
玉红含量 , IAA含量在花中大于根中 ,在茎 、叶中检
测不到;靛玉红含量在叶中最多 ,花中次之 ,根中再
次之 ,在茎中检测不到 。表明 , IAA 和靛玉红合成
部位有差异 , IAA主要在植株生长旺盛的部位花和
根中合成 ,靛玉红虽然也可在花和根中合成 ,但叶中
靛玉红含量最多 ,推测叶可能是靛玉红的主要合成
部位 ,对叶中相关酶活性的分析研究将更有助于解
释靛玉红合成的详细途径 。
参 考 文 献:
[ 1] 　傅　翔,张汉明 ,丁如贤.菘蓝组织培养物中靛蓝 、靛玉红含量
的变化[ J] .2001 ,(1):33—37.
[ 2] 　段　飞 ,杨建雄 ,周西坤, 等.干旱地区农业研究 , 2006 , 5(3):
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Analysis of content and synthesis position of IAA and indirubin in
Isatis indigotica Fort .seedlings with different treatments
ZHOU Xi-kun , YU Jia-ning＊ , WANG Jian , YANG Gen-sheng , CHEN Ya-nan
(College of Life Sciences , Shaanxi Normal University , X i an , Shaan xi 710062 , China)
　　Abstract:The seedlings of Isatis indigotica Fort .cultivated 30 day s w as t reated wi th natural drought , 20
mmol/L ABA , 4℃ low temperature , respectively.The content of IAA was ex tracted f rom Isatis indigotica
Fort .seedling s at the indicated times and analyzed by HPLC method.The results showed that the content of
IAA could increased up to 242.04%～ 262.87%w ith drought t reatment;The similar results w ere found in 20
mmol/L ABA treated.The content of IAA increased up to 503.87%under low temperature st ress for 24 h.
IAA and indirubin also w ere ext racted f rom w ild Isatis indigot ica Fort .seedlings w hich had g row n one and a
half month and were measured by HPLC.The content of IAA in f low er was higher than it in root , and it w as
not measured in the leaf.The content of indirubin w as the highest in leaf , and it was the second or third in
flow ers and roots.It implied that IAA and indirubin have the similar molecule structure and could be induced by
ABA and stress treatment , but they might synthesize in dif ferent parts in Isat is indigot ica Fort ..
Keywords:Isat is indigotica Fort .;IAA;indirubin;stress;HPLC g raph
164　　　　　　　　　　　　　　　　　　　干旱地区农业研究　　 　　　　　　　　　　　　　第 25卷