全 文 ：第 24卷第 3期
2006年 5月 干 旱 地 区 农 业 研 究Agricultural Research in the Arid Areas Vol.24 No.3May.2006
　
收稿日期:2005-11-21
基金项目:2004～ 2006校级重点基金
作者简介:段　飞(1980—),男 ,陕西西安人 ,硕士研究生 ,主要从事植物抗性生理生化研究。
通讯作者:俞嘉宁 , E-mail:jnyu@snnu.edu.cn
逆境胁迫对菘蓝幼苗靛玉红含量的影响
段　飞 ,杨建雄 ,周西坤 ,马天利 ,俞嘉宁
(陕西师范大学生命科学学院 , 陕西西安 710062)
　　摘　要:培养 30 d 的菘蓝无菌幼苗经 250 mmol/ L NaCl、自然干旱 、20 mmo l/ L ABA、4℃低温等不同方式逆境
处理 , 不同时间内取样 , 用高效液相色谱法对其中靛玉红的含量进行测定。结果表明:盐 、干旱 、ABA 处理 12 h 内
能提高菘蓝幼苗中靛玉红含量 59.05%～ 161.67%, 低温胁迫处理 24 h 也能提高靛玉红含量 141.4%,说明适当逆
境胁迫处理能有效提高菘蓝幼苗体内靛玉红的累积量 , 其中 250 mmol/ L NaCl胁迫处理效果最为显著。
关键词:菘蓝;靛玉红;逆境胁迫;HPLC
中图分类号:R745.78　　文献标识码:A　　文章编号:1000-7601(2006)03-0111-04
　　菘蓝(Isatis indigotica Fort.)是十字花科大青属
的一种常用的二年生药用植物 ,我国南北各地广为栽
培 , 根和叶均可入药 ,中药称菘蓝的根为板蓝根 ,叶
为大青叶。菘蓝整株含有靛玉红(indirubin),为吲哚
类衍生物 ,是板蓝根和大青叶的有效成分[ 1 , 2] 。
植物在遭受外界不良因素 ,如生物 、非生物入
侵 、创伤等胁迫时 ,植物细胞往往趋于向次生产物合
成的方向转变[ 3] 。如许桢灿等[ 4] 应用薄层扫描法
测定同一产地不同采收期的板蓝根中靛玉红含量 ,
发现 12月份靛玉红含量最高 ,认为北方产板蓝根宜
在11 ～ 12月份之间采收 。说明靛玉红的含量可能
受环境胁迫的影响。我们用盐 、低温 、干旱 、脱落酸
(ABA)等不同胁迫方式处理培养 30 d 的菘蓝无菌
幼苗 ,通过高效液相色谱法测量其中的靛玉红含量 ,
期望找出能提高靛玉红含量的较佳胁迫方式 。
1　材料与方法
1.1　无菌苗的栽培
菘蓝种子(购于西安市万寿路中药材批发市场 ,
并经本院田先华副教授鉴定)去掉果皮[ 5] ,清水洗
净后用浓度为 75%的乙醇浸泡 30 s ,无菌水清洗一
遍 ,浸泡于0.1%的 HgCl2 溶液中10 min , 无菌水冲
洗 3 ～ 5次置于 MS 固体培养基中 ,27℃黑暗条件萌
发[ 6] ,3 d后转入光照培养室 , 25℃,每天 14 h 光照
培养 ,光照强度 2 500 lx ,选择生长 30 d长势基本一
致的菘蓝无菌苗为实验材料。
1.2　盐和 ABA胁迫处理
将菘蓝幼苗小心从培养基中取出 ,洗净其上的
残留培养基 ,吸干水分 ,取 120株等分成 2份分别放
入 250 mmol/ L的 NaCl和 20 mmol/L 的ABA溶液
中 ,光照培养箱内 25℃,光照强度 2500 lx 进行处
理 ,0 ,1.5 , 3.0 , 6.0 , 9.0 , 12.0 h 分别取样 ,迅速将
幼苗擦干后投入盛有液氮[ 7] 的研钵中进行研磨 ,加
入无水乙醇 ,待乙醇挥发净尽后于 40℃烘至干燥得
样品干燥粗粉待用(每处理设三个重复)。
1.3　干旱胁迫处理
将菘蓝幼苗小心从培养基中取出 ,洗净其上的
残留培养基 , 吸干水分 ,取 60 株于光照培养箱中
25℃光照自然干旱处理[ 8] , 0 , 1.5 , 3.0 , 6.0 , 9.0 ,
12.0 h 分别取样 ,按 1.2中的方法制得粗粉待用 。
1.4　冷胁迫处理
将原先置于光照培养室生长 30 d 菘蓝幼苗的
培养瓶放置在光照培养箱中 ,4±0.2℃光照培养 ,分
别于 0 , 6 ,9 , 12 , 24 , 36 h将幼苗小心从瓶内培养基
中取出 ,清水洗净苗上残留培养基 ,按 1.2中的方法
制得粗粉待用 。
1.5　靛玉红含量测定
靛玉红含量测定采用日本岛津公司 SHI-
MADZU LC-2010A 高效液相色谱系统 。靛玉红
对照品为中国药品生物制品检定所 717-200204样
品。
2　结果与分析
2.1　对照品溶液和样品供试液
对照品溶液的制备:准确称取靛玉红对照品 10
mg置 250 ml容量瓶中 ,用 100 ml氯仿溶解 ,加入
甲醇稀释至刻度定容 ,充分混匀后精密量取 25 m l
该溶液置 50 ml容量瓶中 ,用甲醇精确定容至刻度
线 ,摇匀 ,制成 0.02 mg/ml的靛玉红对照品溶液 ,
备用 。
样品供试液的制备[ 9] :准确称取经各胁迫处理
制得的粗粉0.15 g ,置索氏提取器中 ,加氯仿60 ml ,
回流提取 6 h ,提取液置蒸发皿中 ,放置于通风橱内
40℃水浴挥干 ,用适量甲醇∶氯仿(80∶20)混合液分
四次溶洗定容至 10 m l容量瓶中 , 0.45 μm 微孔滤
膜过滤 ,滤液即为供试品溶液 。
2.2　色谱条件
色谱柱:Shim -pack VP -ODS 色谱柱(150
mm×4.6 mm);流动相:甲醇∶水 =70∶30;检测波
长:290 nm;流速:1.0 ml/min;柱温:室温 。
2.3　标准曲线的制作
制得的 0.02 mg/ml的靛玉红对照品溶液分别
设定 1 , 3 ,5 , 7 , 9 , 11 μl仪器自动进样 ,记录色谱图
(如图 1),以对照品进样量对峰面积作图 ,得回归方
程如下:
Y =1.00 ×10-4X +3.47 ×10-2 , r =0.99998 ,
表明靛玉红在 0.02 ～ 0.22 μg 范围内与峰面积呈良
好的线性关系 。
图 1　靛玉红标准品及供试品的 HPLC 图谱
Fig.1　HPLC graph of standard indirubin and trial sample
A.供试品;B.靛玉红标准品　A.sample;B.standard indi rubin
2.4　精密度试验
以5μl连续对靛玉红对照品自动进样 5次 ,测
得峰 面积分别 为:1385546 , 1385094 , 1382907 ,
1380884 , 1383106 , RSD=0.14%,表明精密度良好 。
2.5　稳定性试验
对照品溶液的稳定性:取浓度为 0.02 mg/ml
的靛玉红对照品溶液 5 μl间隔 1 h 连续自动进样 8
次 , 所 得峰 面 积 分 别 为:117307.0 , 124535.2 ,
120331.7 , 119806.9 , 118637.5 , 118518.5 , 119779.0 ,
119226.3 ,RSD=2.33%,表明对照品溶液在 8 h内
稳定 。
供试样品溶液的稳定性:取供试样品溶液 5 μl
间隔 1 h连续自动进样 8次 ,所测的峰面积分别为:
69132.1 , 67254.1 , 65221.4 , 66144.4 , 65208.8 ,
66592.2 , 66572.1 , 66612.2 , RSD=2.48%,表明供
试样品溶液在 8 h内稳定。
2.6　加样回收率
准确称取已知靛玉红含量为 133.26 μg/g 未经
任何处理的菘蓝幼苗粗粉 0.15 g ,加入 0.02 mg/ml
靛玉红标准品溶液 1 ml ,依照样品供试液的制备和
样品含量的测定方式处理 5份 ,计算平均回收率为:
96.31%,RSD=0.86%。
2.7　靛玉红含量
将仪器自动进样量数值设定为 20 μl ,分别对已
制备的样品供试液进行进样测定 ,结果如图 2所示 ,
用 250 mmol/ L NaCl溶液处理菘蓝幼苗时 ,靛玉红
含量随着胁迫时间的延长不断增加 ,至 12 h达到最
大值 348.69μg/g ,高出对照 161.67%;干旱处理的
结果与盐处理结果类似 ,但在 9 h 含量达到最大值
211.94 μg/g 后至 12 h 的靛玉红含量基本保持不
变。20 mmol/L 的 ABA 溶液处理的菘蓝幼苗 ,靛玉
红含量在处理 6 h后达到最大 227.49μg/g ,高出对
照 70.72%,之后开始下降 ,但处理12 h的含量又有
所上升 ,且明显高于对照 。
4℃低温胁迫处理的菘蓝幼苗靛玉红含量表现
出先上升后下降 ,再又上升的趋势。即 0到 9 h 逐
渐增加至 317.92 μg/g , 12 h 含量减至 232.70
μg/g ,24 h上升且达到最大值 321.68μg/g ,高出对
照 141.4%,至 36 h又略有下降 。
112　　　　　　　　　　　　　　　　　　　干旱地区农业研究　　 　　　　　　　　　　　　　第 24卷
图 2　盐 、干旱 、冷 、ABA胁迫处理菘蓝靛玉红含量(n=3)
Fig.2　Content of indirubin in salt , drought , cold and ABA stress trea ted I satis indigotica Fort
A 250mmol/ L NaCl;B 自然干旱;C 20mmol/ L ABA;D 冷处理
A 250mmol/ L NaC l;B d rough t;C 20mmol/ L ABA;D cold
3　讨　论
植物的次生代谢是植物体内的另一种重要的生
理代谢 ,对绝大多数植物而言 ,次生代谢产物的合成
与积累往往与所处的生长环境密切相关 。植物根据
所处的环境条件及其变化来决定合成次生代谢产物
的种类及数量 ,即只有在一定的生长环境条件下才
合成某些特定的次生代谢产物 ,或者显著的增加某
些特定的次生代谢产物在体内的含量。与植物的初
生代谢需要有良好的生长环境不同 ,植物的次生代
谢往往会在植物遭遇如低温 、干旱 、高盐碱等胁迫性
环境时变得旺盛[ 10] 。当环境适宜时 ,植物通过初生
代谢合成自身生长所需的蛋白质 、糖类 、核酸等物
质 ,次生代谢只产生少量的代谢物质以维持日常生
长所需 ,当适宜的生境恶化时植物光合与呼吸作用
受到抑制 ,而次生代谢活动加强 ,产生大量的次生代
谢物质以提高植物自身的抗逆性[ 11 ,12] 。
靛玉红是菘蓝的次生代谢物质 ,属于吲哚类生
物碱 ,本实验结果表明 ,经250 mmol/L NaCl溶液胁
迫处理过的菘蓝幼苗从 0到 12 h 靛玉红含量逐渐
增加 ,干旱处理的菘蓝幼苗中靛玉红的含量从 0 到
9 h逐渐增加 ,达最大值 ,且在 12 h含量基本保持恒
定 ,这一现象可能是因为菘蓝幼苗在受到盐胁迫和
干旱胁迫处理后体内代谢方式出现相应的调整 ,从
初生代谢为主转向以次生代谢为主 ,产生大量的具
有抗逆作用的次生代谢物质以维持自身的生存 。
ABA作为一种“胁迫激素”在调节植物抗逆性
方面起着一定的作用[ 13 , 14] ,外源 ABA 的处理能够
诱导植物某些耐逆基因的表达[ 15 ,16] ,实验室和大田
实验也证明气孔的开放程度会随着所用 ABA 浓度
的提高而下降[ 17 ～ 19] ,本试验使用 20mmol/LABA
溶液处理菘蓝幼苗表现出和盐胁迫处理 、干旱胁迫
处理类似现象 ,即随 ABA 处理时间的延长 ,靛玉红
含量表现出逐渐增加的趋势 ,表明 ABA可能也具有
诱导菘蓝中靛玉红合成相关基因表达的作用 。但
ABA处理 9 h 后 ,靛玉红含量表现出较明显下降 ,
113第 3期　　　　　 　　　段　飞等:逆境胁迫对菘蓝幼苗靛玉红含量的影响
其原因可能是因为最初胁迫阶段(0 到 6 h)ABA诱
导促使菘蓝体内合成大量靛玉红 ,同时叶片气孔的
缩小或者关闭导致菘蓝幼苗光合与呼吸作用的减
弱 ,以至使处理 9 h后菘蓝幼苗各种正常代谢活动
可能进一步减弱之故 ,当继续延长 ABA 胁迫处理时
间 ,靛玉红含量又有所上升 ,其原因有待深入研究 。
将正常生长的菘蓝幼苗置于 4℃低温环境后 ,
菘蓝幼苗从外观上看并没有像上述几种处理出现很
明显的变化 ,因此我们进行了较长时间的低温处理 。
结果所有处理时间点的靛玉红含量均高于对照 ,表
明冷胁迫可诱导幼苗中靛玉红的累积 。0 到 9 h菘
蓝幼苗中靛玉红含量随低温胁迫时间的增加而增
加 ,但处理 12 、36 h 时 ,靛玉红含量下降 ,推测可能
与植物体自身的昼夜节律有关[ 20] ,其详细机制有待
进一步研究。
菘蓝是中药板蓝根和大青叶的主要来源 ,而靛
玉红是板蓝根和大青叶的主要有效活性成分 。从每
年初春播种到当年 7月和 10 月分别收获大青叶和
板蓝根 , 这一周期长达 4 到 6 个月[ 21] , 文献报
道[ 9 ,22～ 24] ,板蓝根中靛玉红的含量为 7.5 ～ 24.2
μg/g , 大青叶中靛玉红的含量为 153.6 ～ 1117.7
μg/g ,而本实验选用生长 30 d的菘蓝幼苗进行适当
的逆境处理 ,有效提高菘蓝体内靛玉红的含量且可
高达 348.7 μg/g ,因而如果以菘蓝为原料提取靛玉
红可以将生长 1个月左右无土栽培或盆栽的菘蓝幼
苗进行适当的逆境胁迫或 ABA处理 ,这样获得菘蓝
植株来提取靛玉红 ,操作简单 ,不受时空条件制约 ,
节约耕地 ,产量高 ,具有较好的经济和社会效益。
参 考 文 献:
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(英文摘要下转第 120页)
114　　　　　　　　　　　　　　　　　　　干旱地区农业研究　　 　　　　　　　　　　　　　第 24卷
The evaluation on the spatial difference of sustainable
land resource use in Gansu Province
MAO Xiao-wen
(College of Tourism , North West Normal University , Lanz hou , Gansu 730070 , China)
　　Abstract:Based on establishing an indicator sy stem for evaluating the spatial dif ferences of the sustainable
land resource use , which include 23 evaluation indicators about resources , environment , economy and society ,
the paper evaluated quantitatively the spat ial differences of the sustainable land resource use in Gansu province.
The results show that the spatial difference level of the sustainable land resource use in Gansu province is re-
markable , and that the ef fective measures should be taken to harmonize the relationship of resource exploitation ,
economy development , society improvement and envi ronment pro tection.
Keywords:land resource;sustainable use;spatial dif ference evaluation;Gansu province
(上接第 114页)
Effects of stress on the indirubin content of Isatis indigotica Fort.seedlings
DUAN Fei , YANG Jian-xiong , ZHOU Xi-kun , MA Tian-li , YU Jia-ning
(College of Life Science , Shaanx i Normal University , Xi an 710062 , China)
　　Abstract:The seedlings of Isatis indig otica Fort.cultivated for 30 day s in aseptic environment w ere t reated
w ith 250 mmol/LNaCl , natural drought method , 20 mmol/L ABA , 4℃ low temperature , respectively .The
content of indirubin w as ext racted f rom Isatis indigotica Fort.seedlings at the indicated times and analyzed using
HPLC method , the results showed that the content of indirubin could increased up to 59.05%～ 161.67% in
salt , drought and ABA treatment during 12 h.The content of indirubin increased up to 141.4%under low tem-
perature st ress for 24 h.These implied that the content of indirubin in the Isatis indigotica Fo rt.seedlings could
accumulate by appropriate stress andABA treatment ef ficiently.The 250 mmol/L NaCl st ress treatment had the
most effect.
Keywords:Isatis indigotica Fort .;indirubin;st ress;HPLC
120　　　　　　　　　　　　　　　　　　　干旱地区农业研究　　 　　　　　　　　　　　　　第 24卷